資源簡介

押題10 基因表達與基因工程中PCR關聯考題
猜押 10大題型
題型01融合基因中PCR的應用
題型02 DNA復制中自修復和岡崎片段問題
題型03雙脫氧測序法
題型04 DNA的粗提取實驗
題型05 DNA不同片段間互為引物的問題
題型06基因工程中選酶問題
題型07 PCR引物設計及電泳條帶問題
題型08外源基因插入及基因序列問題
題型09重組基因中引物選擇
題型10基因工程和孟德爾定律關聯考題
猜押考點 3年真題 考情分析 押題依據
基因表達與基因工程中PCR關聯考題 2021年山東卷第25題 2022年山東卷第13、25題 2023年山東卷第5、25題 2024年山東卷第5、25題 2025年新高考生物新結構體系下，基因表達與基因工程中PCR關聯題型更注重考察學生的審題能力和知識點掌握的全面和準確性；以基礎知識為引導，深入考察延伸思路。 題目更加注重綜合性、應用性、創新性，對知識點的背景和應用有更多的掌握。 基因工程題型要求考生在細讀題干的基礎上，依據題目提供的信息，聯系所學的知識和方法，實現信息的遷移，達到靈活解題的目的；遇到新情境問題，應耐心讀題，分析題干信息及隱含的知識點，弄清新定義的性質，按新定義的要求，“照章辦事”，逐條分析、驗證、運算，使問題得以解決. 難度適中，可以預測2025年選擇題拓展題目命題方向將會以新情境信息題型展開命題．
題型1 融合基因中PCR的應用
1．（多選）丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一種傳染病。為研制針對HCV的多肽疫苗，某研究小組構建LTB-R9-Bp融合基因的過程如圖，進而構建出融合基因表達載體，其中LTB是一種免疫增強劑基因，R9-Bp是HCV兩個相連的包膜蛋白基因。下列說法正確的是（ ）
A．PCR反應體系中需加入待擴增的模板、引物、原料以及耐高溫的DNA聚合酶
B．若要大量擴增LTB-R9-Bp融合基因，可選擇引物P2和引物P3繼續進行PCR
C．融合基因表達載體的組成元件有融合基因、標記基因、啟動子和終止密碼子等
D．若利用轉基因植物生產該疫苗，需用到基因工程、植物組織培養和抗原抗體雜交技術
【答案】AD
【分析】基因工程的操作步驟：(1)目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成；(2)基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟。基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；(3)將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣，將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。(4)目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因-DNA分子雜交技術。②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA-分子雜交技術。③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質：抗原-抗體雜交技術，個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
【詳解】A、PCR擴增時，需要再反應體系中加入待擴增的模板、引物、原料以及耐高溫的DNA聚合酶，A正確；
B、通過PCR技術擴增LTB-R9-Bp融合基因，需要與融合基因兩端序列互補配對的引物，結合圖示分析，可選擇引物P1和引物P4繼續進行PCR，B錯誤；
C、終止密碼子存在于mRNA上，不會存在于融合基因中，C錯誤；
D、若利用轉基因植物生產該疫苗，則需要通過基因工程獲得含有目的基因的受體細胞，再通過植物組織培養獲得具備產生疫苗的植物，最終需要通過抗原抗體雜交技術進行目的基因成功表達的鑒定，D正確。
故選AD。
題型2 DNA復制中自修復和岡崎片段問題
1．已知紫外線（UV）可誘導DNA單鏈上相鄰的T之間相互結合形成嘧啶二聚體，阻礙堿基正常配對而導致復制錯誤引起突變，DNA修復機制對維持遺傳穩定性至關重要。研究人員發現某細菌中存在兩種如圖所示修復機制：①光復活修復：光復活酶（PRE）在可見光下直接切割二聚體，恢復原結構；②暗修復：無需光照，通過切除損傷單鏈并重新合成。下列說法正確的是（ ）

A．PRE可將嘧啶二聚體的磷酸二酯鍵斷開
B．暗修復過程中還需消耗原料、能量和引物
C．PRE基因發生堿基替換后，在光照下PRE的修復功能可能正常
D．UV誘導DNA形成嘧啶二聚體引起的變異不可遺傳
【答案】C
【分析】DNA連接酶（將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵）：
（1）種類： E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。
（2）作用：E.coli DNA連接酶只能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來，不能連接具有平末端的DNA片段；而T4 DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端的效率相對較低。
【詳解】A、由圖可知，PRE（光復活酶）切割的是相鄰T堿基之間形成的環狀共價鍵，并非磷酸二酯鍵，A錯誤；
B、無需光照，通過切除損傷單鏈并重新合成，即暗修復切除損傷片段后，DNA聚合酶可直接利用缺口處原有的3′OH末端延伸合成新鏈，不需要引物，B錯誤；
C、由于密碼子具有簡并性，基因的堿基替換未改變氨基酸得排列順序，酶活性不變，則在光照條件下PRE的修復功能仍可能維持正常，C正確；
D、若嘧啶二聚體未被修復而導致DNA堿基序列永久改變，則該突變在細胞分裂過程中是可以遺傳的，D錯誤。
故選C。
2．端粒學說是細胞衰老的假說之一，研究發現，端粒縮短與DNA復制方式有關。人體細胞內DNA復制部分過程如圖所示。下列敘述錯誤的是（ ）
A．圖示體現了DNA半保留復制、雙向復制的特點
B．圖示引物為短單鏈核酸，復制過程中會被酶切除
C．PCR擴增的原理與生物體內DNA復制的原理相同
D．端粒縮短的原因是新合成的子鏈5'端變短
【答案】A
【分析】DNA復制過程為：（1）解旋：需要細胞提供能量，在解旋酶的作用下，兩條螺旋的雙鏈解開；（2）合成子鏈：以解開的每一段母鏈為模板，在DNA聚合酶等酶的作用下，利用游離的4種脫氧核苷酸為原料，按照堿基互補配對原則，合成與母鏈互補的子鏈；（3）形成子代DNA分子：延伸子鏈，母鏈和相應子鏈盤繞成雙螺旋結構。
【詳解】A、DNA復制是半保留的，即每個新合成的DNA分子包含一條親代鏈和一條新合成的子鏈，圖示過程可體現DNA的半保留復制，但不能體現雙向復制（從復制起點向兩個方向同時進行）的特點，A錯誤；
B、結合圖示可知，在DNA復制過程中，引物是短單鏈核酸，，用于啟動DNA合成。隨后，引物會被DNA聚合酶切除，并由DNA片段填補，B正確；
C、PCR（聚合酶鏈式反應）是一種體外DNA擴增技術，其原理與生物體內的DNA復制相似，都是DNA半保留復制，C正確；
D、結合圖示可知，由于有岡崎片段等存在，新合成的子鏈5'端變短，從而導致端粒縮短，D正確。
故選A。
3．我國科學家敲除豬的糖抗原合成基因（β4GalNT2），轉入相應的調節基因后，將基因編輯豬的單個腎移植給獼猴，同時切除獼猴的自體雙腎，最終移植腎存活184天。在移植成功5個月內，獼猴的移植腎功能完全正常，之后出現逐漸加重的蛋白尿。下列說法正確的是（ ）
A．基因編輯豬的成功體現了動物細胞的全能性
B．出現蛋白尿的原因主要是腎小管細胞凋亡導致
C．豬和獼猴腎臟的差異體現了基因的選擇性表達
D．敲除β4GalNT2能改變膜蛋白種類，降低免疫排斥反應
【答案】D
【分析】器官移植是將一個個體的某一器官整體或部分地轉移到另一個體（或本體的另一位置，如自體皮膚移植）的過程。器官移植存在的主要問題：免疫排斥反應和供體器官不足。針對免疫排斥反應，可采用免疫抑制劑來提高移植器官的成活率。
【詳解】A、基因編輯豬的成功屬于基因工程的應用范疇，其原理不是細胞的全能性，A錯誤；
B、出現蛋白尿的原因主要是腎小球通透性增強導致的，不是腎小管細胞凋亡導致，B錯誤；
C、豬和獼猴腎臟的差異體現了不同遺傳物質對性狀的決定，不是基因選擇性表達的體現，因為豬和獼猴腎臟不是來源于同一物種，更不是同一細胞的后代，C錯誤；
D、β4GalNT2是糖抗原合成基因，因而敲除β4GalNT2能改變膜蛋白種類，進而降低免疫排斥反應，D正確。
故選D。
4．一段雙鏈DNA的一條核苷酸鏈上有2個胞嘧啶（C），其中1個C被甲基化生成5-甲基胞嘧啶（5-mC），C與5-mC進一步被氧化脫氨基分別生成胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）。細胞內存在尿嘧啶錯配修復系統，該系統能在U的兩側將核苷酸單鏈切開，清除兩切點間包含U的核苷酸片段后再合成正確的片段。下列說法錯誤的是（ ）
A．尿嘧啶錯配修復系統具有限制酶、DNA聚合酶和DNA連接酶的功能
B．在修復并進行復制的過程中，可能使用4種核苷酸作為原料
C．修復時，以切口處末端核苷酸鏈為引物延伸正確DNA片段
D．若未被修復，復制兩次后，兩個位點的C才都會被A替代
【答案】D
【分析】DNA分子的復制時間：有絲分裂和減數分裂間期；條件：模板（DNA的雙鏈）、能量（ATP水解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游離的脫氧核苷酸）；過程：邊解旋邊復制；結果：一條DNA復制出兩條DNA；特點：半保留復制。
【詳解】A、尿嘧啶錯配修復系統具有限制酶（用于在U的兩側切開DNA鏈）、DNA聚合酶（用于合成新的DNA片段以替換被切除的部分）和DNA連接酶（用于將新合成的DNA片段連接到原有的DNA鏈上）的功能，A正確；
B、DNA的基本單位是4種脫氧核糖核苷酸，故DNA修復和復制過程中需要四種核苷酸，B正確；
C、DNA子鏈的延伸方向是5'→3’，在DNA修復過程中，通常以切口處的3’末端作為引物，由DNA聚合酶延伸合成新的DNA片段，C正確；
D、未被修復的C和5-mC在復制過程中會被錯誤地配對，C會被錯誤地配對為A，5-mC被氧化脫氨基生成U，U會被配對為A，故若未被修復，在一次復制后兩個位點的C都會被A替代，D錯誤。
故選D。
題型3雙脫氧測序法
1．雙脫氧測序法是第一代DNA測序方法。在4支試管中分別加入4種dNTP和少量的1種ddNTP進行PCR，再把PCR產物變性，利用電泳進行分離，根據結果確定特定堿基的位置。通過該方法測定并比較某疾病患者與對照個體DNA模板鏈的一段堿基序列，結果如圖所示。下列敘述錯誤的是（ ）

注：dNTP是PCR的四種原料；雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四種；在DNA聚合酶作用下，ddNTP與dNTP競爭核苷酸鏈延長位點，以加入ddATP的體系為例：若配對的為ddATP，延伸終止；若配對的為dATP，繼續延伸。
A．上述PCR反應體系中模板鏈需要足夠多 B．患者該段序列中某位點的堿基C突變為T
C．5'－TAGTGCCCATC－3'為對照個體的一段序列 D．沿電泳方向，核苷酸鏈長度逐漸減小
【答案】C
【分析】PCR技術：
（1）概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術；
（2）原理：DNA復制；
（3）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物
（4）條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）
（5）過程：
①高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開）；②低溫復性：引物結合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。
【詳解】A、在進行序列時，模板量的數量需要足夠多，以確保測序的準確性和可測性。如果模板DNA量不足，可能會導致測序結果不準確或無法進行，A正確；
B、患者的測序結果為5'-CTACCTGTGAT-3'，對照個體的測序結果為5'-CTACCCGTGAT-3'，對比患者和對照個體的測序結果可知，患者該段序列中某位點的堿基C突變為T，B正確；
C、依據雙脫氧測序法的原理，可以確定每個泳道中的條帶（DNA片段）的3'終端的堿基，如+ddATP的泳道中出現的條帶（DNA片段）的3'終端堿基就是A。另外由于每個片段的起始點相同，但終止點不同，因此可以通過比較片段的長度來確定DNA序列中每個位置上的堿基；圖示電泳方向為從上→下，即對應的DNA片段為長→短，則對應的DNA測序結果為3'→5'，如對照個體的電泳結果最短的條帶為+ddCTP泳道組的條帶，則說明該DNA片段5'端第一個堿基為C；因此對照個體的測序結果為5'-CTACCCGTGAT-3'，C錯誤；
D、電泳時，產物的片段越大，遷移速率越慢，故據圖可知沿電泳方向，核苷酸鏈長度逐漸減小，D正確。
故選C。
2．采用焦磷酸光化測序法進行DNA測序的原理是：將待測DNA鏈固定到一個磁珠上，將磁珠包被在單個油水混合小滴（乳滴）中，在該乳滴里進行獨立的DNA復制，四種脫氧核苷三磷酸依照T、A、C、G的順序一個一個進入該乳滴，如果發生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸（PPi），PPi經過一系列酶促反應后發出熒光。下列說法錯誤的是（ ）

A．脫氧核苷三磷酸通過磷酸二酯鍵把脫氧核苷酸接到多核苷酸鏈的3'-OH末端
B．PPi經過一系列的酶促反應后，釋放出的能量一部分可轉化為光能
C．當胞嘧啶脫氧核苷三磷酸進入后能發出熒光，說明此位置模板鏈上為G
D．若將四種脫氧核苷三磷酸同時加入反應體系中，可大大提高DNA測序的效率
【答案】D
【分析】PCR是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。 PCR反應需要在一定的緩沖溶液中才能進行，需提供DNA模板，分別與兩條模板鏈結合的2種引物，4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶；同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行。 擴增的過程包括：變性、復性、延伸。
【詳解】A、在DNA合成過程中，脫氧核苷三磷酸確實是通過磷酸二酯鍵把脫氧核苷酸接到多核苷酸鏈的3'-OH末端，A正確；
B、 PPi經過一系列的酶促反應后，釋放出的能量一部分可轉化為光能，從而發出熒光，B正確；
C、根據堿基互補配對原則，胞嘧啶（C）與鳥嘌呤（G）配對，當胞嘧啶脫氧核苷三磷酸進入后能發出熒光，說明此位置模板鏈上為G，C正確；
D、若將四種脫氧核苷三磷酸同時加入反應體系中，就無法根據堿基配對產生熒光的情況來確定模板鏈上的堿基順序，不能提高DNA測序的效率，D錯誤。
故選D。
3．凝膠阻滯試驗（EMSA）的基本原理是：熒光標記的DNA與蛋白質結合后分子量增大，電泳后通過熒光檢測可在相應位置顯示出阻滯條帶。已知O2蛋白通過與ZmGRAS11基因啟動子區的motif序列結合來調控ZmGRAS11基因的表達，科學家為證實motif序列是與O2蛋白結合的關鍵序列，利用熒光標記的motif序列作為指示探針，無熒光標記的motif序列（WT）和無熒光標記的突變motif序列（M1～M6）作為7種競爭探針，進行EMSA試驗，實驗結束后進行熒光檢測，結果如下圖所示，下列說法錯誤的是（ ）
注：“+”表示加入相應物質；“-”表示未加入相應物質；競爭探針足夠多
A．圖中“？”是指熒光標記的指示探針
B．泳道3無阻滯條帶的原因是O2蛋白全部與WT探針結合
C．在競爭探針中引入突變可評估突變對競爭探針與O2蛋白結合的影響
D．突變對探針M4～M6與O2蛋白結合能力影響相對較小的是M4、M5
【答案】D
【分析】凝膠阻滯試驗，又叫DNA遷移率變動的實驗，是在80年代初期出現的用于在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。該方法用來研究DNA與特異性蛋白的相互作用，通常是放射性標記的DNA片段與純化蛋白，或提取物中的蛋白混合物相結合，然后在非變性凝膠中分析該產物。與游離DNA相比，蛋白質-DNA復合物的遷移率將降低，因此，與游離DNA相對應，人們將觀察到帶中的“阻滯”。
【詳解】A、泳道1，沒有加O2蛋白和競爭探針以及“ ”，且只有一條指示探針條帶，說明圖中“ ”是指熒光標記的指示探針，A正確；
B、泳道3，加入了O2蛋白和無熒光標記的競爭探針WT探針以及熒光標記的指示探針，只有一條指示探針條帶，且于泳道1的指示探針條帶寬度相同，說明O2蛋白沒有與熒光標記的指示探針結合，都與無熒光標記的競爭探針WT探針結合了，所以觀察不到阻滯條帶，B正確；
C、O2蛋白與熒光標記的指示探針結合越多阻滯條帶就會越寬，指示探針條帶就會越窄，而對于加入無熒光標記的突變競爭探針會競爭性的與O2蛋白結合，從而使指示探針的條帶會變寬，阻滯條帶就會變窄，且突變的競爭探針與O2蛋白結合能力越強，阻滯條帶就會越窄，因此在競爭探針中引入突變可評估突變對競爭探針與O2蛋白結合的影響，C正確；
D、加入突變競爭探針M4、M5、M6的泳道，M6的阻滯條帶最窄，說明突變的競爭探針中M6與O2蛋白結合能力最強，即M6發生的突變，對其與O2蛋白結合影響相對較小，D錯誤。
故選D。
題型4 DNA的粗提取實驗
1．關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是（　　）
A．整個提取過程中可以不使用離心機
B．研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應充分搖勻再倒入燒杯中
C．鑒定過程中DNA雙螺旋結構不發生改變
D．僅設置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾
【答案】A
【分析】DNA的粗提取與鑒定的實驗原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白質等其他成分在不同 濃度的氯化鈉溶液中的溶解度不同，利用這一特點可 以選擇適當濃度的鹽溶液可以將DNA溶解或析出， 從而達到分離的目的; ②DNA不溶于酒精溶液，細胞中的某些蛋白質可以溶解于酒精，利用這一原理可以將蛋白質和DNA進一步分離; ③在沸水浴的條件下DNA遇二苯胺會呈現藍色。
【詳解】A、在DNA的粗提取與鑒定實驗中，可將獲得的研磨液用紗布過濾后，在4℃的冰箱中放置幾分鐘，再取上清液，也可以直接將研磨液用離心機進行離心后取上清液，A正確；
B、研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，DNA在上清液中，應取上清液倒入燒杯中，B錯誤；
C、鑒定過程中用沸水浴加熱，DNA雙螺旋結構會發生改變，C錯誤；
D、加入二苯胺試劑后沸水浴處理的時間要在5分鐘以上，且要等到冷卻后再觀察結果，這樣才可以觀察到較為明顯的顯色反應，僅設置一個對照組可以排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾，D錯誤。
故選A。
題型5 DNA不同片段間互為引物的問題
1．制備熒光標記的DNA探針時，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標記的dATP）的反應管①~④中，分別加入如表所示的適量單鏈DNA。已知形成的雙鏈DNA區遵循堿基互補配對原則，且在本實驗的溫度條件下不能產生小于9個連續堿基對的雙鏈DNA區。能得到帶有熒光標記的DNA探針的反應管有（　　）
反應管 加入的單鏈DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A．①② B．②③ C．①④ D．③④
【答案】D
【分析】子鏈的延伸方向為5'→3'，由題意可知，在本實驗的溫度條件下不能產生小于9個連續堿基對的雙鏈DNA區，要能得到帶有熒光標記的DNA探針，需要能根據所提供的模板進行擴增，且擴增子鏈種含有A。
【詳解】分析反應管①～④中分別加入的適量單鏈DNA可知，①中兩條單鏈DNA分子之間具有互補的序列，但雙鏈DNA區之外的3'端無模板，因此無法進行DNA合成，不能得到帶有熒光標記的DNA探針；②中單鏈DNA分子內具有自身互補的序列，由于在本實驗的溫度條件下不能產生小于9個連續堿基對的雙鏈DNA區，故一條單鏈DNA分子不發生自身環化，但兩條鏈可以形成雙鏈DNA區，由于DNA合成的鏈中不含堿基A，不能得到帶有熒光標記的DNA探針；③中兩條單鏈DNA分子之間具有互補的序列，且雙鏈DNA區之外的3'端有模板和堿基T，因此進行DNA合成能得到帶有熒光標記的DNA探針；④中單鏈DNA分子內具有自身互補的序列，一條單鏈DNA分子不發生自身環化，兩條鏈可以形成雙鏈DNA區，且雙鏈DNA區之外的3'端有模板和堿基T，因此進行DNA合成能得到帶有熒光標記的DNA探針。
綜上，能得到帶有熒光標記的DNA探針的反應管有③④。
故選D。
2．用DNaseI酶切割DNA分子，可產生一系列不同長度的DNA片段，且相鄰片段只相差1個核苷酸。當DNA分子中的某一區段與特異的轉錄因子蛋白質結合后，加入DNaseI酶時該區段會得到保護，在凝膠電泳放射性自顯影圖片上會出現一個空白區“足跡”，這種檢測DNA序列的方法稱為DNaseI足跡法。上述過程如圖所示，下列說法正確的是（ ）

A．需設置不添加DNaseI酶的對照組
B．對照組的每個DNA分子只發生一次磷酸二酯鍵的斷裂
C．未與特定蛋白結合的DNA切割后的片段長度相同
D．此方法可篩選能與DNA進行特異性結合的目標蛋白
【答案】D
【分析】基因工程的工具：（1）限制酶：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。（2）DNA連接酶：連接的是兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。（3）運載體：常用的運載體：質粒、噬菌體的衍生物、動植物病毒。
【詳解】A、該實驗是研究加入DNaseI酶后，DNA分子與轉錄因子蛋白質結合情況及切割情況，不需要設置不添加DNaseI酶的對照組，因為重點是對比結合蛋白和未結合蛋白時DNA被DNaseI酶切割的差異，而不是與不添加酶的情況對比，A錯誤；
B、由題意可知，用DNaseI酶切割DNA分子可產生一系列不同長度的DNA片段，且相鄰片段只相差1個核苷酸，這說明對照組的DNA分子被多次切割，磷酸二酯鍵多次斷裂，而不是只發生一次磷酸二酯鍵的斷裂，B錯誤；
C、因為用DNaseI酶切割DNA分子會產生一系列不同長度的DNA片段，所以未與特定蛋白結合的DNA切割后的片段長度是不同的，C錯誤；
D、由于當DNA分子中的某一區段與特異的轉錄因子蛋白質結合后，加入DNaseI酶時該區段會得到保護，在凝膠電泳放射性自顯影圖片上會出現一個空白區“足跡”，通過觀察是否有“足跡”，就可以判斷是否有能與DNA進行特異性結合的目標蛋白，所以此方法可篩選能與DNA進行特異性結合的目標蛋白，D正確。
故選D。
3．為制備帶有熒光標記的DNA探針，研究人員在反應系統內只添加了DNA聚合酶、緩沖液、H2O和4種dNTP（dN—Pα～Pβ～Pγ，其中dGTP被熒光標記）的反應管①～③中分別加入適量單鏈DNA（如圖）。形成的雙鏈DNA區遵循堿基互補配對原則，且在本實驗的溫度條件下不能產生小于9個連續堿基對的雙鏈DNA區。下列分析正確的是（ ）
反應管①：5′-GGCTATAGCCAGA-3′
反應管②：5′-GTTTCGCGATGGC-3′；3′-AGCGCTACCGATG-5′
反應管③：5′-CCAGGAGATTGC-3′；3′-CCTCTAACGATC-5′
A．實驗中需要用熒光物質對dGTP的γ位磷酸基團進行標記
B．DNA聚合酶沿模板鏈將dNTP逐個連接到引物的5′端
C．反應管②的反應系統內因缺乏模板或引物不能進行PCR擴增
D．實驗結束后，能得到帶有熒光標記DNA探針的反應管只有③
【答案】D
【分析】子鏈的延伸方向為5'→3'，由題意可知，在本實驗的溫度條件下不能產生小于9個連續堿基對的雙鏈DNA區，要能得到帶有熒光標記的DNA探針，需要能根據所提供的模板進行擴增，且擴增子鏈種含有A。
【詳解】A、dGTP的γ位與β位之間的高能磷酸鍵會斷裂為PCR提供能量，因此若對dGTP的γ位磷酸基團進行標記，則標記不會出現在子鏈中，需要用熒光物質對dGTP的α位磷酸基團進行標記，A錯誤；
B、DNA聚合酶沿模板鏈將dNTP逐個連接到引物的3′端，B錯誤；
C、反應管②的兩條單鏈DNA分子之間具有互補的序列，既是模板又是引物，可以進行PCR，但雙鏈DNA區之外的5'端模板鏈中沒有堿基C，不能與被熒光標記的dGTP結合，因此不能制備帶有熒光標記的DNA探針，C錯誤；
D、①中兩條單鏈DNA分子之間具有互補的序列，但雙鏈DNA區之外的3'端無模板，因此無法進行DNA合成，不能得到帶有熒光標記的DNA探針，③中兩條單鏈DNA分子之間具有互補的序列，且雙鏈DNA區之外的5'端有模板和堿基C，在模板鏈的3'端能連接上被熒光標記的dGTP，因此進行DNA合成能得到帶有熒光標記的DNA探針，D正確。
故選D。
題型6 基因工程中選酶問題
1．為篩選出能與SARS病毒的S蛋白特異性結合的受體蛋白，研究人員利用基因工程技術，在S蛋白末端添加TAP標簽（能特異性地與人和哺乳動物體內IgG類抗體結合）形成S-TAP融合蛋白，再利用該標簽在病毒敏感細胞中純化出S蛋白及其相互作用的蛋白質，部分過程如圖。回答下列問題。

注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶識別序列，各限制酶識別序列及切割后產生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示啟動子；Kozak序列是調控基因表達的重要序列且不含限制酶識別序列。
(1)為成功構建重組質粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR擴增S基因時，需在F引物的5'端外側依次添加 序列。PCR時新合成鏈的延伸方向是 （填“5′→3′”或“3′→5′”）。
(2)使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，DNA分子的遷移速率與 有關。
(3)在該重組質粒pcDNA3.1-S-TAP中，T7的作用是 ，重組質粒中還應該有的結構有 。
(4)為檢測轉染細胞中是否表達出了S-TAP融合蛋白，科研人員將轉染細胞置于載玻片，洗滌、固定后，滴加帶有熒光標記的 稀釋液，熒光顯微鏡下觀察，若出現熒光標記，則說明轉染細胞中表達出了S-TAP融合蛋白。
【答案】(1) Kozak和SmaⅠ酶 5′→3′
(2)凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象
(3) RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA 終止子、標記基因、復制原點
(4)IgG類抗體
【分析】基因工程是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。基因工程包括四個基本步驟：目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。
【詳解】（1）依題意，Kozak序列是調控基因表達的重要序列且不含限制酶識別序列，T7表示啟動子，根據構建的重組質粒圖示可分析，在S基因的上游加入了Kozak序列以調控S基因表達，故要在F引物的5'端外側添加Kozak序列；目的基因和質粒要連接構成表達載體，根據T7啟動子的方向及質粒上的酶切位點可知，S基因上游不能用XhoI（S基因會被XhoI酶切），應該有用Smal酶切，故F引物的5'端外側還要添加SmaI酶識別序列；PCR是體外DNA復制技術，DNA復制的方向是新鏈的5′→3′，故PCR時新合成鏈的延伸方向是5′→3′。
（2）PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來。
（3）依題意，T7表示啟動子，啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA。基因表達載體是載體的一種，包含目的基因、標記基因、啟動子、終止子、復制原點等。結合圖示可知，基因表達載體中已有啟動子、目的基因，還應有的結構是終止子、標記基因、復制原點。
（4）依題意，S蛋白末端添加TAP標簽能特異性地與人和哺乳動物體內IgG類抗體結合，若要檢測轉染細胞中是否表達出了S-TAP融合蛋白，可滴加帶有熒光標記的IgG類抗體稀釋液，置熒光顯微鏡下觀察，若出現熒光標記，則說明轉染細胞中表達出了S-TAP融合蛋白。
2．水體中的雌激素能使斑馬魚細胞產生E蛋白，激活卵黃蛋白原（vtg）基因的表達，因此斑馬魚可用于監測環境雌激素污染程度。為了實現可視化監測，科學家將圖1中的vtg基因與圖2中Luc基因載體連接，形成vtg-Luc基因重組載體，成功培育了轉基因斑馬魚，當極微量雌激素污染水體，斑馬魚的肝臟就發出熒光。Luc表示熒光素酶基因（無啟動子），Kanr為卡那霉素抗性基因，ori為復制起點，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI為限制酶，→表示轉錄方向。
注：圖1DNA片段不含有圖2所示限制酶的識別序列
(1)為使vtg基因與Luc基因載體形成重組載體，選用限制酶 切割Luc基因載體可降低“空載”概率。通過PCR技術獲取vtg基因時，需設計合適的引物。依據圖示信息，推測引物1包含的堿基序列為5′ 3′。（寫出已知的所有堿基序列）
(2)將“vtg-Luc基因重組載體”導入大腸桿菌中進行擴增，為便于篩選，應將大腸桿菌接種在含 的培養基中，轉基因成功的斑馬魚只在肝臟中發出熒光指示污染，其原因是 。
(3)Luc基因載體上有一段P2A序列，其功能如圖所示，據此推測P2A的作用 。
(4)進一步研究發現，E蛋白能與vtg基因啟動子的特定序列結合，啟動該基因的表達。已知vtg基因啟動子含區域1和區域2，為研究E蛋白的結合位點，設計如下實驗：用限制酶將啟動子切割成含區域1和區域2的兩個片段，將兩個酶切片段分別與Luc基因載體連接，連接位點位于Luc基因的上游，形成兩種重組載體。將重組載體分別導入斑馬魚的 ，待發育成熟后，往水體中添加 進行檢測。
【答案】(1) Bcl I和Hind Ⅲ 5'-TGATCAAACTAT-3'
(2) 卡那霉素 vtg基因在肝臟中特異性表達
(3)有助于序列兩側的基因表達成獨立的蛋白質
(4) 受精卵 雌激素和熒光素
【分析】基因工程的步驟：
（1）提取目的基因：基因組文庫中獲取、cDNA文庫中獲取。
（2）目的基因與運載體結合：將目的基因與運載體結合的過程，實際上是不同來源的DNA重新組合的過程。如果以質粒作為運載體，首先要用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現一個缺口，露出黏性末端。然后用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端（部分限制性內切酶可切割出平末端，擁有相同效果）。
（3）將目的基因導入受體細胞：將目的基因導入受體細胞是實施基因工程的第三步。目的基因的片段與運載體在生物體外連接形成重組DNA分子后，下一步是將重組DNA分子引入受體細胞中進行擴增。
（4）目的基因的檢測和表達。
【詳解】（1）由圖可知，限制酶BsrGI會破壞Luc，因此不能選擇BsrGI，Luc基因載體上存在兩個BamHI識別位點，因此不能選擇BamHI，為防止目的基因和載體的自身環化和反向連接，因此需選用兩種限制酶，即選擇BelI、HindIII切割Luc基因載體可降低“空載”概率。根據啟動子的位置和基因載體上限制酶的位置，因此需要在引物1上添加限制酶BelI識別序列，因此引物1包含的堿基序列為5′TGATCAAACTAT3′。
（2）Kanr為卡那霉素抗性基因做為標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇，因此為便于篩選，應將大腸桿菌接種在含卡那霉素的培養基中；轉基因成功的斑馬魚只在肝臟中發出熒光指示污染，說明vtg基因只在肝臟中特異性表達。
（3）由圖可知2A肽的作用可使兩側基因形成完整蛋白，即P2A有助于序列兩側的基因表達成獨立的蛋白質。
（4）可利用顯微注射法將目的基因導入動物的受精卵中。由題意可知，在含有雌激素的污水中，轉基因斑馬魚可發出熒光，因此可在斑馬魚發育成熟后，往水體中添加雌激素和熒光素檢測是否發熒光。
題型7 PCR引物設計及電泳條帶問題
1．大豆中轉錄調控因子Y 蛋白可以和某些基因啟動子序列結合，促進其表達以增強大豆對干旱和鹽脅迫的抗性。研究人員通過逆轉錄獲得Y 基因并將其下游終止密碼子對應序列剔除，然后與載體上綠色熒光蛋白基因 (GFP) 進行拼接獲得融合基因。成功表達的Y-GFP融合蛋白可用于Y 蛋白調控機理的研究。
(1)研究中首先要對Y基因進行PCR擴增，擴增過程中復性的目的是 。圖甲所示Y基因序列為轉錄的 (填“模板鏈”或“非模板鏈”)。已知EcoRI識別序列為5'-GAATTC-3'，BamHI識別序列為5'-GGATCC-3'，這些限制酶識別序列不影響融合蛋白基因的表達。為使Y基因正確接入載體并成功表達出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游擴增引物應 為5'- -3'(包括添加的限制酶識別序列，共寫12個堿基)。
(2)將初步構建的Y-GFP 基因表達載體轉入大豆細胞后，對經潮霉素篩選得到的兩個不同細胞系總蛋白進行抗體檢測，電泳結果如圖乙所示。其中細胞系 能成功表達出Y-GFP融合蛋白 。
(3)為探究Y 蛋白能否與S 基因(大豆類固醇化合物合成的關鍵基因)啟動子序列結合，用S基因啟動子序列制作的探針進行相關實驗，實驗結果如圖丙所示。已知Y 蛋白與DNA 序列結合后，可在凝膠電泳中產生阻滯條帶。據圖分析，Y 蛋白 (填“能”或“不能”) 與S 基因啟動子序列結合，相比于a 條帶，b條帶放射性低的原因是
(4)過表達Y基因或施加外源大豆類固醇化合物均可顯著增強大豆對干旱和鹽脅迫的抗性。綜上所述，Y蛋白增強大豆對干旱和鹽脅迫抗性的機理是 。
【答案】(1) 使引物通過堿基互補配對與模板DNA單鏈結合 非模板鏈 GGATCCATGTTC
(2)2
(3) 能 100倍未標記的探針與同位素標記的探針競爭性結合Y蛋白，導致b處帶有放射性的阻滯條帶減少
(4)Y蛋白(通過與S基因啟動子序列結合)促進S基因表達，促進固醇類化合物生成，增強物對干旱和鹽脅迫的抗性
【分析】基因工程的基本操作步驟主要包括四步：①目的基因的獲取；②基因表達載體的構建；③將目的基因導入受體細胞；④目的基因的檢測與表達。其中，基因表達載體的構建是基因工程的核心。
【詳解】（1）在PCR擴增過程中，復性的目的是使引物通過堿基互補配對與模板DNA單鏈結合，這是DNA聚合酶能夠沿著模板鏈延伸合成新的DNA鏈的前提。轉錄出來的信使RNA，翻譯時的起始密碼子應該是AUG，AUG應該跟模板鏈TAC是互補配對的，跟非模板鏈ATG是相同的，圖中Y基因單鏈部分，左端起始位置是ATG剛好跟信使RNA的起始位置是相同的，故圖甲所示Y基因序列為轉錄的非模板鏈。據題圖分析可知，Y基因上面沒有那個EcoRI和BamHI的識別序列，所以要擴增Y基因的時，引物的5'端是要加上EcoRI和BamHI的識別序列，根據載體結構，左端是啟動子，右端是終止子，圖中Y基因單鏈部分是非模板鏈，所以Y基因是從左到右與載體部分連接。故在Y基因的左端連接EcoRI的識別序列，Y基因的右端連接BamHI的識別序列。即Y基因的下游擴增引物上面應該加BamHI的識別序列，再根據題干信息“在獲得Y 基因并將其下游終止密碼子對應序列剔除”可知，Y基因下游最左端的三個堿基轉錄為終止密碼子，故這三個堿基要剔除，所以為使Y基因正確接入載體并成功表達出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游擴增引物應 為5'- GGATCCATGTTC -3'。
（2）將初步構建的Y GFP基因表達載體轉入大豆細胞后，需要對經潮霉素篩選得到的細胞系進行抗體檢測以確認是否成功表達出Y GFP融合蛋白。根據圖乙的電泳結果可以看出，細胞系2在預期位置出現了明顯的條帶而細胞系1沒有，因此可以判斷細胞系2能成功表達出Y GFP融合蛋白。
（3）根據圖丙的實驗結果和已知信息，可以看出Y蛋白與DNA序列結合后，可以在凝膠電泳中產生阻滯條帶。而實驗組（加入Y蛋白）的條帶相對于對照組（未加入Y蛋白）產生了阻滯，說明Y蛋白能與S基因啟動子序列結合。相比于a條帶（對照組），b條帶（實驗組）放射性低的原因是100倍未標記的探針與同位素標記的探針競爭性結合Y蛋白，導致b處帶有放射性的阻滯條帶減少。
（4）根據題目信息和分析結果，Y蛋白增強大豆對干旱和鹽脅迫抗性的機理是Y蛋白與S基因啟動子序列結合，促進S基因的表達，進而促進大豆固醇類化合物的合成，從而增強大豆對干旱和鹽脅迫的抗性。
2．RCA是一種核基因（rca）編碼的葉綠體蛋白。為研究RCA對光合作用的影響及機理，科研人員構建反義rca基因表達載體（rca基因反向插入表達載體），利用農桿菌轉化法導入大豆細胞，成功獲得rca基因沉默的轉基因品種（如圖1），①~⑥表示相關過程。
(1)參與過程①的酶有 （至少寫兩種）。在設計引物擴增rca基因時，不能選定rca基因的M端的5'－TCAGAGCCAATTGGCT－3'和N端的5'－AGTTCACTG－GCCAGTG－3'序列，分別作為引物2和引物1的設計區，原因是 。已知①過程rca基因的b鏈和獲取它的模板mRNA互補，依據圖1中給出的引物1設計區的堿基序列及限制酶的信息，從5'端到3'端寫出引物1的堿基序列 （只寫出前8個堿基即可）。
(2)過程②用C4pdk啟動子替換Ti質粒上原有啟動子的目的是 ，過程④常用的方法是 ，⑤過程后可用含抗生素 的培養基篩選出轉化成功的大豆細胞。
(3)科研人員將野生型大豆和轉基因大豆在適宜的光照條件下進行培養，一段時間后分別測定相關指標，結果如圖2（Rubisco是光合作用暗反應中的一種關鍵酶）。據圖分析，RCA對光合作用的影響及機理是 。
【答案】(1) 反（逆）轉錄酶、熱穩定DNA聚合酶、RNA酶（核酸酶H） 引物1（2）中或兩個引物1（2）之間因存在互補序列而相互連接成雙鏈結構，不能和模板鏈結合 5'－CTCGAGGT－3'
(2) 驅動目的基因在光誘導下在葉肉細胞中特異性表達 鈣離子處理法（或感受態細胞法） 潮霉素
(3)通過提高Rubisco活力來促進光合作用
【分析】基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：可利用PCR技術擴增和人工合成。
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
（3）將目的基因導入受體細胞
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測；①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質：抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
【詳解】（1）過程①為反轉錄PCR，因此需要的酶有反（逆）轉錄酶、熱穩定DNA聚合酶、RNA酶（核酸酶H），在設計引物擴增rca基因時，不能選定rca基因的M端的5'－TCAGAGCCAATTGGCT－3'和N端的5'－AGTTCACTG－GCCAGTG－3'序列，分別作為引物2和引物1的設計區，這是因為引物1（2）中或兩個引物中存在互補的堿基序列，因而會形成雙鏈結構，進而無法和模板鏈結合，導致擴增失敗。 目的基因rca基因中已經存在BamH Ⅰ和Sal Ⅰ的酶切位點（質粒上也已有Sal Ⅰ的酶切位點”，所以在rca基因的上游不宜再選用Sal Ⅰ，這樣會破壞目的基因，而應該選用與Sal Ⅰ產生相同黏性末端的Xho Ⅰ（同尾酶）。所以引物Ⅰ的堿基序列應該是5'-CTCGAGGT-3'。這樣，質粒上用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ切割，rca基因用BglⅡ（與BamH Ⅰ屬于同尾酶）和Xho Ⅰ切割。
（2）啟動子是一段DNA序列，因此啟動子的基本單位是脫氧核苷酸，C4pdk啟動子是受光誘導的強啟動子，驅動目的基因在光誘導下載葉肉細胞中特異性表達，經過程②替換 Ti質粒上原有啟動子的目的是可使目的基因在大豆葉肉細胞中特異性表達。過程④是將重組質粒導入到農桿菌中，常用的方法Ca2+處理農桿菌（感受態細胞法）。由圖可知T-DNA內部含有潮霉素抗性基因，因此⑤過程后可用含潮霉素的培養基篩選出轉染成功的大豆細胞。
（3）與野生型大豆相比，轉基因大豆的rca基因沉默，無RCA蛋白，光合速率降低，則可知RCA對玉米的光合作用具有促進作用。由圖可知，rca基因沉默時Rubisco活力下降，因此可推測RCA對大豆的光合作用的作用機理為RCA可提高Rubisco活力，促進暗反應，進而促進光合作用。
3．滾環擴增技術（RCA）是借鑒自然界中病原生物體環狀DNA分子滾環式復制方式發展起來的一種核酸擴增方法，在致病菌、核酸腫瘤標記物、蛋白質、生物小分子和病毒檢測領域有著廣泛應用。圖1為RCA原理示意圖。具核梭桿菌為一種強粘附性消化道細菌，侵入腸黏膜后可誘導局部炎癥和細胞因子的表達增加，導致結直腸腫瘤的形成。科研人員采用基于RCA的熒光標記滾環擴增檢測方法，實現了在微量樣品及復雜環境下的高靈敏度、高特異性的檢測。圖2為熒光標記滾環擴增檢測過程示意圖，過程②是使鎖式探針環化的過程。其中nusG基因為具核梭桿菌的特異性基因，鎖式探針為依據nusG基因序列設計出來的單鏈DNA分子，由兩端的檢測臂和無關序列組成。只有當環境中存在靶核酸序列時，鎖式探針才能完成成環連接反應。檢測探針中的熒光基團（FAM）距離淬滅基團（BHQ-1）比較近時，熒光會被淬滅。

(1)由圖1推測，Phi29DNA聚合酶的作用是 。與常規PCR相比，RCA缺乏 環節，因此可推測RCA擴增過程中使用的Phi29DNA聚合酶不具有 的特性。
(2)過程②鎖式探針完成成環連接反應需要 的催化。腸道中含有多種微生物，為保證檢測的特異性，在設計鎖式探針時需保證 ，同時還需注意無關序列中不含 。
(3)若檢測樣品存在具核梭桿菌，檢測探針中熒光基團發出熒光的原理是 。該檢測方法具有高靈敏度的原因是 。
【答案】(1) 能既需催化磷酸二酯鍵的形成，也能催化氫鍵的斷裂 變性 耐高溫
(2) DNA連接酶 檢測臂中含nusG基因的特異性序列 其它微生物的特異性堿基序列
(3) 長重復單鏈DNA與檢測探針特異性結合，導致探針兩端的FAM與BHQ-1距離增大，發出熒光 長重復單鏈DNA中可同時結合多個檢測探針，從而使熒光強度增加
【分析】PCR是體外模擬DNA復制的過程，其原理是DNA雙鏈復制。體內DNA復制過程中需要模板、原料、能量、引物和酶等，PCR過程中原料和能量由dNTP提供，酶是熱穩定DNA聚合酶（Taq酶）。
【詳解】（1）由圖1可知，以單鏈環狀DNA為模板可在Phi29DNA聚合酶作用下形成滾動形成長重復單鏈DNA，說明Phi29DNA聚合酶既需催化磷酸二酯鍵的形成，也需催化氫鍵的斷裂；由于模板是單鏈DNA，因此擴增時不需要解旋形成單鏈，故與常規PCR相比，RCA缺乏變性環節，即該擴增過程不需要在高溫條件下進行，因此可說明RCA擴增過程中所使用的Phi29DNA聚合酶不具有耐高溫特性；
（2）過程②為鎖式探針進行連接以實現環化，即在nusG基因一條鏈與鎖式探針堿基互補配對的前提下，通過DNA連接酶形成磷酸二酯鍵將鎖式探針連接形成環狀，因此②過程中需要的酶是DNA連接酶；在設計鎖式探針時需保證檢測臂中含nusG基因的特異性序列，同時還需注意無關序列中不含其它微生物的特異性堿基序列，防止擴增的長重復單鏈中含有其它微生物的特定堿基序列；
（3）若檢測樣品存在具核酸桿菌，經圖2中②-④過程得到的長重復單鏈DNA與檢測探針特異性結合，導致探針兩端的FAM與BHQ-1距離增大，發出熒光；由于長重復單鏈DNA中可同時結合多個檢測探針，從而使熒光強度增加，因此提高了該檢測方法的靈敏度。
題型8 外源基因插入及基因序列問題
1．由P基因編碼的P蛋白是一種水通道蛋白，該蛋白在植物調節水分吸收方面發揮著重要作用。科研人員成功培育出超量表達P蛋白的轉基因玉米。培育過程中所用DNA片段和Ti質粒的酶切位點如圖1所示。
(1)構建基因表達載體時，切割Ti質粒應選用 酶。從切割DNA片段和Ti質粒到構建基因表達載體完成共需 種酶。
(2)將農桿菌浸泡過的玉米愈傷組織進行植物組織培養，培養基中需加入 （填“潮霉素”、“卡那霉素”或“潮霉素或卡那霉素”）進行篩選，理由是 。篩選出的愈傷組織最終培養成轉基因玉米。
(3)農桿菌轉化法除了用于獲取轉基因植物外，還可以通過T-DNA插入基因內部使基因沉默，獲得突變體。為了獲得mm突變體，某科研小組利用野生型MM，通過農桿菌轉化法使基因M沉默。由于T-DNA插入的位置是隨機的，為確定T-DNA是否插入M基因中，該小組采用“三引物法”進行PCR擴增，即采用三種引物（LP、RP、BP），LP、RP為與目的基因片段互補的特異引物，BP為插入T-DNA的特異引物，如圖所示。（說明：T-DNA插入基因后，會阻止被插入基因兩端引物的擴增產物的形成）根據下表中三種樣品的電泳結果判斷樣品 是純合突變體，理由是 。
引物種類樣品序號 LP+RP BP+RP
樣品1 有大片段 無
樣品2 有大片段 有小片段
樣品3 無 有小片段
【答案】(1) EcoRⅠ和SpeⅠ酶 5
(2) 潮霉素 潮霉素基因位于T-DNA中，會與目的基因一同轉移到玉米愈傷組織細胞的染色體上
(3) 3 樣品1表現為能合成大片段，其基因型為MM，樣品3中插入了T-DNA片段，表現為無擴增大片段出現，其基因型可表示為mm。
【分析】基因工程技術的基本步驟：
(1) 目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。
(2) 基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
(3) 將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。
(4) 目的基因的檢測與鑒定。
【詳解】（1）構建基因表達載體時，切割目的基因需要用到的限制酶為MunⅠ和XbaⅠ，結合各種限制酶的識別序列可知，EcoRⅠ和SpeⅠ分別和MunⅠ和XbaⅠ為同尾酶，因此，切割Ti質粒應選用EcoRⅠ和SpeⅠ酶。從切割DNA片段和Ti質粒到構建基因表達載體完成共需四種限制酶和一種DNA連接酶，共需要5種酶。
（2）將農桿菌浸泡過的玉米愈傷組織進行植物組織培養，培養基中需加入潮霉素進行篩選，因為潮霉素基因位于T-DNA中，會與目的基因一同轉移到玉米愈傷組織細胞的染色體上，因此凡是成功導入目的基因的愈傷組織細胞應該具有對潮霉素的抗性。進而用篩選出的愈傷組織最終培養成轉基因玉米。
（3）農桿菌轉化法除了用于獲取轉基因植物外，還可以通過T-DNA插入基因內部使基因沉默，獲得突變體。為了獲得mm突變體，某科研小組利用野生型MM，通過農桿菌轉化法使基因M沉默。由于T-DNA插入的位置是隨機的，為確定T-DNA是否插入M基因中，該小組采用“三引物法”進行PCR擴增，即采用三種引物（LP、RP、BP），LP、RP為與目的基因片段互補的特異引物，BP為插入T-DNA的特異引物，如圖所示。結合題圖是以及題目信息可知，樣品1沒有插入相應的T-DNA片段，其基因型為MM，樣品3中插入了T-DNA片段，表現為無擴增大片段出現，其基因型可表示為mm，而樣品2的基因型可表示為Mm。即根據下表中三種樣品的電泳結果判斷樣品3是純合突變體。
2．研究發現基因L能夠通過脫落酸信號途徑調控大豆的逆境響應。利用基因工程技術編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaI切點處插入大豆基因L的向導DNA序列，將載體導入大豆細胞后，其轉錄產物可引導核酸酶特異性結合基因組上的目標序列并發揮作用。載體信息、目標基因L部分序列及相關結果等如圖所示。
(1)用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目標基因L時，所用的引物越短，引物特異性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因組DNA，理論上可產生的黏性末端最多有 種。載體信息如圖甲所示，經BsaI酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5'- -3'和5'- -3'。
(2)重組載體通過農桿菌導入大豆細胞，使用抗生素 篩選到具有該抗生素抗性的植株①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點如圖乙所示，PCR產物完全酶切后的電泳結果如圖丙所示。據圖可判斷選用的限制酶是 ，其中純合的突變植株是 （填序號）。
(3)實驗中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測發現其體細胞中只有1條染色體有T-DNA插入。用抗生素篩選這個植株的自交子代，其中突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例為 ，篩選出的敏感植株可用于后續的品種選育。
【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3'
(2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④
(3)1/4
【分析】【關鍵能力】
（1）信息獲取與加工
題干關鍵信息 所學知識 信息加工
黏性末端的種類 基因工程的工具 BsaI切割產生的黏性末端是NNNN，四個堿基最多可能有256種排列順序
抗生素篩選 目的基因的檢測與鑒定 重組載體通過農桿菌導入大豆細胞當中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通過使用卡那霉素篩選到具有該抗生素抗性的植株
（2）邏輯推理與論證
【詳解】（1）引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，用于PCR的引物長度通常為20~30個核苷酸。由此可知，在利用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目的基因時，所用的引物越短，則引物的特異性就越低。根據題意可知，限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因組DNA，圖中給出的只是載體信息，大豆基因組無法從圖中看出。只能根據理論來推測，BsaI切割產生的黏性末端是NNNN，四個堿基最多可能有256種排列順序，故答案應為 256。根據圖甲所示的載體信息，經BsaI酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5'-CAAT-3'、5'-GTTT-3'。
（2）根據圖示信息可知，重組載體通過農桿菌導入大豆細胞當中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通過使用卡那霉素篩選到具有該抗生素抗性的植株。根據圖甲可知，目標基因L的目標序列跟突變序列之間的差異只有在Sac Ⅰ酶切位點上存在差異，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ這兩個酶切位點完全相同，根據圖丙及題意可知，所展示的電泳結果可知，要以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，并對PCR產物完全酶切后進行電泳從而判斷植株含有的是目標序列還是突變序列，因此只能選用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突變序列存在酶切位點，但是目標序列沒有，因此經過該酶酶切后突變序列的電泳條帶會出現兩條，目標序列是一條帶，根據圖丙結果可知，只有④為純和突變的植株。
（3）根據題意可知，在實驗當中獲得了一株基因l成功突變的純合之中，已知該植株具有抗生素抗性，經過檢測發現其體細胞中只有一條染色體含有T-DNA插入。根據圖示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素來篩選該植株進行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例為1/2，不含T-DNA（對抗生素敏感）的配子比例為1/2，因此突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例應該為1/2×1/2=1/4，純突變位點純合且具有抗生素抗性的植株所占比例應該為3/4，可以篩選出的敏感植株可用于后續的品種選育。
題型9 重組基因中引物選擇
1．科研人員構建了可表達J-V5融合蛋白的重組質粒并進行了檢測，該質粒的部分結構如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。

(1)與圖甲中啟動子結合的酶是 。除圖甲中標出的結構外，作為載體，質粒還需具備的結構有 （答出2個結構即可）。
(2)構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物 。已知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的 （填“a鏈”或“b鏈”）相應部分的序列相同。
(3)重組質粒在受體細胞內正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應蛋白是否表達以及表達水平，結果如圖乙所示。其中，出現條帶1證明細胞內表達了 ，條帶2所檢出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重組質粒上的J基因表達的。
【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位點、標記基因、復制原點等
(2) F2和R1或F1與R2
a鏈
(3) J-V5融合蛋白 不是
【分析】基因工程的關鍵步驟是構建基因表達載體，基因表達載體主要由啟動子、目的基因、標記基因和終止子組成，其中標記基因用于篩選重組DNA分子，可以是四環素、氨芐青霉素等抗性基因，也可以是熒光蛋白基因或產物能顯色的基因。
【詳解】（1）基因表達載體的構建啟動子是為了啟動下游基因的“表達”，表達首先需要轉錄，因此RNA聚合酶識別和結合的部位才是轉錄的起始。作為運載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點；②要有標記基因（如抗性基因），以便于重組后重組子的篩選；③能在宿主細胞中穩定存在并復制；④是安全的，對受體細胞無害，而且要易從供體細胞分離出來，圖中甲有啟動子和終止子等，因此質粒還需具備的結構有限制酶的切割位點、標記基因、復制原點等。
（2）據圖甲可知，引物F2與R1或F1與R2結合部位包含J基因的堿基序列，因此推測為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，進行PCR檢測時，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物F2和R1或F1與R2。b是模板鏈，而根據圖上啟動子和終止子的位置可知轉錄方向是圖上從左向右，對應的模板鏈方向應該是3’-5'，非模板鏈（也就是a鏈）是5'-3'；考慮到DNA復制的方向是子鏈的5’-3'，引物基礎上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物結合的單鏈其方向是3'-5'；圖中F1是前引物，在左側，所以其配對的單鏈是3’-5'的b鏈，故其序列應該與a鏈相應部分的序列相同。
（3）據圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測，均出現條帶1，說明條帶1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗體檢測出現條帶2，抗V5抗體檢測不出現條帶2，說明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質粒上的融合的J基因表達的。
2．某種類型的白血病由蛋白P引發，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理，需構建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質結合，但不影響P或P△的功能。
(1)為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是 、為使PCR產物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR擴增得到的P基因經酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導入細胞后，融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同。據圖甲分析，出現該問題的原因是 。修改擴增P基因時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是 。
(3)融合蛋白表達成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經含FLAG抗體的介質，分離出與介質結合的物質并用UBC抗體檢測，檢測結果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③組結果的差異推測，藥物A的作用是 ；由②④組或③⑤組的差異推測，P△中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根據以上結果推測，藥物A治療該病的機理是 。
【答案】(1) 能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對、短單鏈核酸
5'端
(2) P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸，導致mRNA的密碼子被錯位讀取。
在引物中的EcoRⅠ識別序列3'端添加1個堿基
(3) 增強FLAG-P與UBC的結合 參與P與UBC的結合
(4)藥物A通過增強P與UBC結合促進P降解。
【分析】PCR過程：①變性：當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解旋為單鏈；②溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合；③延伸：當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
【詳解】（1）引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核苷酸，因此設計擴增P基因的引物，需要兩種引物分別與兩條模板鏈3'端的堿基序列互補。DNA聚合酶延伸時，是將脫氧核苷酸加到引物的3'端，為了不破壞目的基因，該限制酶識別序列應添加在引物的5'端。
（2）融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同，說明P基因翻譯時出錯。由圖可看出，在轉錄出的mRNA中，限制酶識別序列對應的最后兩個堿基與P基因對應的第一個堿基構成一個密碼子，導致讀碼框改變，翻譯出的氨基酸序列改變，可通過在EcoRⅠ識別序列3'端添加1個堿基，使其堿基數目加上FLAG的堿基數目為3的倍數，這樣能保證P基因轉錄出的mRNA上的讀碼框不改變，能夠正常翻譯。
（3）①組僅添加UBC，處理后，用UBC抗體檢測，不出現雜交帶；②組添加UBC和FLAG-P，出現雜交帶；③組添加UBC、藥物A和FLAG-P，雜交帶更加明顯，說明藥物A的作用是促進UBC與FLAG-P的結合。由②④組或③⑤組的差異在于②③組使用FLAG-P，出現雜交帶；④⑤組使用FLAG-P△，不出現雜交帶，據此推測P△中缺失的特定序列是與UBC結合的關鍵序列。
（4）根據（3）的分析推測，藥物A促進UBC與FLAG-P的結合，從而促進蛋白P被蛋白酶識別并降解，達到治療的目的。
【點睛】本題難點在于分析翻譯出錯的原因，需要結合翻譯相關知識對圖進行仔細分析方可得出結論。
3．人類γ基因啟動子上游的調控序列中含有 BCL11A 蛋白結合位點，該位點結合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列，解除對γ基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療。科研人員擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉化和熒光檢測，以確定 BCL11A 蛋白結合位點的具體位置。相關信息如圖所示。
（1）為將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，需在引物末端添加限制酶識別序列。據圖可知，在 F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所對應的限制酶是 。本實驗中，從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要 種酶。
（2）將構建的載體導入除去 BCL11A 基因的受體細胞，成功轉化后，含 F1～F6與 R 擴增產物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含 F7與 R 擴增產物的受體細胞無熒光。含 F7 與 R 擴增產物的受體細胞無熒光的原因是 。
（3）向培養液中添加適量的雌激素，含 F1～F4與 R 擴增產物的受體細胞不再有熒光，而含 F5～F6與 R 擴增產物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調控序列上與引物序列所對應的位置不含有 BCL11A 蛋白的結合位點序列，據此結果可推測，BCL11A 蛋白結合位點位于 ，理由是 。
【答案】 SalI EcoRI 6 F7與R擴增產物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達 引物 F4 與 F5 在調控序列上所對應序列之間的區段上 根據有無熒光情況判斷，F1～F4 與 R 擴增產物上均有結合位點，因此結合位點位于 F4 所對應調控序列的下游（右側）；F5～F6 與 R 擴增產物上均無結合位點，可知結合位點位于 F5 所對應調控序列的上游（左側），所以結合位點位于引物 F4 與 F5 在調控序列上所對應序列之間的區段上
【分析】1、據題意可知，科研人員擴增了γ基因上游不同長度的片段，據圖中注釋可知，F1~F7以及R位置均為引物，故擴增的序列分別是引物F1和引物R之間的序列，引物F2和引物R之間的序列，引物F3和引物R之間的序列，引物F4和引物R之間的序列，引物F5和引物R之間的序列，引物F6和引物R之間的序列，引物F7和引物R之間的序列；
2、據圖中對限制酶的注釋可知，限制酶Mun Ⅰ 識別并切割后的黏性末端與限制酶EcoR Ⅰ 識別并切割后的黏性末端相同，限制酶Xho Ⅰ 識別并切割后的黏性末端與限制酶Sal Ⅰ 識別并切割后的黏性末端相同。
【詳解】（1）據題意可知，需要將擴增后的產物定向插入并指導熒光蛋白基因的表達，則含有啟動子的擴增后的產物讀取方向與熒光蛋白基因的讀取方向一致，故擴增后的產物中的R端與熒光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 識別序列端結合，才能保證擴增后的產物定向插入并指導熒光蛋白基因的表達。要做到定向插入，需要引物末端兩端添加限制酶的識別序列，且被限制酶識別并切割后，兩端的黏性末端不能相同。而擴增后的產物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的識別位點，故在引物末端添加限制酶的識別序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所識別，故應該選用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 識別序列，據圖中對限制酶的注釋可知，限制酶Mun Ⅰ 識別并切割后的黏性末端與限制酶EcoR Ⅰ 識別并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所對應的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所對應的限制酶是Sal Ⅰ ；熒光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的識別位點，故對載體使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。綜上所述，對載體使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，對擴增后的產物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 識別序列，然后在DNA連接酶的催化作用下，連接形成重組載體；產物擴增中需要使用Taq酶催化，合成更多的產物，故從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要6種酶，分別是Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA連接酶；
（2）受體細胞中已經除去 BCL11A 基因，故擴增產物中的 BCL11A 蛋白結合位點，不會抑制熒光蛋白基因的表達；基因的表達需要RNA聚合酶與啟動子結合，才能完成熒光蛋白基因的轉錄過程；含 F1～F6與 R 擴增產物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含 F7 與 R 擴增產物的受體細胞無熒光，則可能是F7與R擴增產物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達；
（3）向培養液中添加適量的雌激素，此時重組載體上的BCL11A基因表達，產生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白與BCL11A 蛋白結合位點結合后，導致熒光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 與 R 擴增產物的受體細胞不再有熒光，則說明BCL11A 蛋白結合位點結合后在引物F4與引物R之間的序列上；含 F5～F6 與 R 擴增產物的受體細胞仍有熒光，則說明BCL11A 蛋白結合位點結合后在引物F5的上游序列，故據此結果可推測，BCL11A 蛋白結合位點位于引物 F4 與 F5 在調控序列上所對應序列之間的區段上。
【點睛】對基因工程中PCR技術的掌握，對基因工程的第二步，基因表達載體的構建的過程的分析，雙酶切法的應用，限制酶的作用和切割特點，是解決本題的關鍵。
題型10 基因工程和孟德爾定律關聯考題
1．某二倍體兩性植物，抗病與感病、高稈與矮稈、耐鹽與鹽敏感分別由A/a、B/b、D/d三對基因控制，各相對性狀均為完全顯性。研究發現，在正常條件下，三對等位基因表達正常。在干旱脅迫下，只考慮上述三對基因的個體形成的配子中，某個基因的表達會因與其位于同一條染色體上的其他基因的影響而被抑制。為研究上述性狀的遺傳特性，選用該植物抗病矮稈耐鹽品系（甲）和感病高稈鹽敏感品系（乙）在不同條件下進行了雜交實驗，實驗結果如表所示。不考慮突變和交換。
組別 環境條件 親本 F1表型及比例
實驗一 正常條件 甲（）×乙（） 均為抗病矮稈耐鹽
實驗二 干旱脅迫 甲（）×乙（） 均為抗病高稈耐鹽
(1)依據 （填“實驗一”或“實驗二”或“實驗一或實驗二”）可判斷出三對相對性狀的顯隱性，理由是 。
(2)若實驗一的F1自交后代中抗病矮稈所占比例為 ，可確定A/a和B/b兩對等位基因位于一對同源染色體上。
(3)在干旱脅迫下，選取實驗二F1自交獲得的F2中感病高稈耐鹽植株的葉片為材料，通過PCR檢測每株個體中控制這3種性狀的所有等位基因，以輔助確定這些基因在染色體上的相對位置關系。對被檢測群體中所有個體按PCR產物的電泳條帶組成（即基因型）相同的原則歸類后，預期電泳圖譜只有I或Ⅱ兩種類型，如下圖所示。已知各基因的PCR產物通過電泳均可區分，其中條帶①和⑤分別代表基因D和a。
①圖中條帶②代表的基因是 。
②若電泳圖譜為類型I，請在答題卡方框內畫出F1個體三對等位基因的位置關系。 （用橫線代表染色體，圓點代表基因）
③若電泳圖譜為類型Ⅱ，被檢測群體在F2中所占的比例為 ，其中能穩定遺傳的比例為 。
(4)由上述信息可知，在干旱脅迫下，F1形成的配子中 基因受到與其位于同一條染色體上基因的影響而表達受抑制；若（3）中電泳圖譜為類型Ⅱ，則干旱條件下F1減數分裂形成 （填“雌配子”、“雄配子”或“雌配子和雄配子”）時，該基因的表達會受到抑制，判斷依據是 。
【答案】(1) 實驗一 實驗一正常條件下，基因表達正常，具有相對性狀的親本雜交，F1均表現為抗病矮稈耐鹽
(2)3/4
(3) b（高桿基因/控制高桿的基因） 3/16 1/3
(4) B（矮桿基因/控制矮桿的基因） 雌配子和雄配子 若只有一種配子（雄配子）中該基因表達受抑制，則Ⅱ中感病高稈耐鹽植株各基因PCR產物電泳的結果只有一種類型，與假設不符合。（或Ⅱ中左側個體為BB/aaBBDD，為高桿，說明B在雌雄配子中均受到抑制；或者若只有一方配子中B被抑制，則與電泳圖譜不符合。）
【分析】自由組合的實質：當具有兩對（或更多對）相對性狀的親本進行雜交，在子一代產生配子時，在等位基因分離的同時，非同源染色體上的基因表現為自由組合。其實質是非等位基因自由組合，即一對染色體上的等位基因與另一對染色體上的等位基因的分離或組合是彼此間互不干擾的，各自獨立地分配到配子中去。因此也稱為獨立分配定律。
【詳解】（1）在正常條件下，三對等位基因表達正常在干旱脅迫下，只考慮上述三對基因的個體形成的配子中，某個基因的表達會因與其位于同一條染色體上的其他基因的影響而被抑制，因此要判斷顯隱性應該在正常條件下，實驗一正常條件下，基因表達正常，具有相對性狀的親本雜交，F1均表現為抗病矮稈耐鹽，抗病、矮稈、耐鹽為顯性。
（2）若A/a和B/b兩對等位基因位于一對同源染色體上，則抗病矮稈耐鹽品系（甲AABB）和感病高稈鹽敏感品系（乙aabb）雜交，F1為AaBb，F1產生的配子為AB、ab，F1自交后代為AABB、AaBb、aabb，抗病矮稈（A_B_）所占比例為3/4。
（3）①圖譜I中只有3條帶和4條帶，說明感病高稈都是隱性基因控制，而不是其它基因影響，而耐鹽個體有DD或Dd，因此感病高稈耐鹽植株的基因型為aabbDD、aabbDd，條帶①和⑤分別代表基因D和a，②代表b，③代表d。②若電泳圖譜為類型I，F1中感病高稈沒有aaB_或A_bb的基因型，說明親本中A與B連鎖，a與b連鎖，而D/d與前兩對基因在兩對染色體上， 因此F1的位置關系為。③若電泳圖譜為類型Ⅱ，感病高稈耐鹽植株對應的條帶有3種和5種，條帶①和⑤分別代表基因D和a，耐鹽有DD和Dd兩種，故④表示B基因，②表示b，③代表d，B與D連鎖，且D抑制B的表述使B_表現為高稈，類型Ⅱ，感病高稈耐鹽植株對應的基因型為aaBBDD（1/4×1/4）、aaBbDd（1/4×1/2），占比為3/16；其中能穩定遺傳（aaBBDD）的比例為1/3。
（4）由上述信息可知，在干旱脅迫下，F1形成的配子中B基因受到同一條染色體上的D基因的抑制；若只有一種配子（雄配子）中該基因表達受抑制，則Ⅱ中感病高稈耐鹽植株各基因PCR產物電泳的結果只有一種類型，與假設不符合，因此若（3）中電泳圖譜為類型Ⅱ，則干旱條件下F1減數分裂形成雌配子和雄配子時，該基因的表達會受到抑制。
2．突變體是植物功能基因組學研究的基礎材料，科研人員利用玉米轉座酶基因和D元件的雙熒光載體的轉座系統（如圖甲所示），進行二穗短柄草突變體培育實驗。轉座酶可識別D元件兩端的反向重復序列并將其切離。此外，轉座酶能夠不斷將D元件重新連接到染色體的任意位置，即完成了“轉座”過程。相關實驗過程、結果如下圖所示。
(1)使用引物F1/R1通過PCR技術可特異性擴增轉座酶基因，原因是 ；可選用 基因作為篩選基因檢測植物是否被農桿菌成功轉化。
(2)為了檢測圖中載體中的D元件是否成功在二穗短柄草基因組中發生切離，分別使用F2/R2引物和F2/R4引物對T0代轉基因陽性苗進行PCR檢測，已知若D元件未發生切離，使用F2/R4引物進行PCR擴增不出條帶。據圖丙所示植株1至10的電泳結果，既含有轉座的細胞又含有未發生轉座的細胞的植株是 ，原因是 。
(3)對T0代陽性植株自交得到的T1代的幼根同時觀察綠色熒光（GFP）和紅色熒光（RFP），得到4組結果：①GFP（+）、RFP（+）；②GFP（+）、RFP（-）；③GFP（-）、RFP（+）；④GFP（-）、RFP（-）。根據上述實驗結果推測含有D元件且D元件遺傳穩定性高的是 （填序號）組。
(4)研究發現，D元件隨機插入染色體后獲得具有突變表型的植物個體的比率較低，可能的原因有 。
【答案】(1) 引物是根據轉座酶基因的一段已知序列設計合成的（或：引物能與轉座酶基因的cDNA特異性結合，與轉座酶基因互補的序列） HPH（潮霉素抗性基因）、GFP（綠色熒光蛋白基因）、RFP（紅色熒光蛋白基因））
(2) 2-9組 使用F2/R2引物PCR檢測有條帶，說明檢測的細胞中D元件未切離；使用F2/R4引物進行PCR檢測有條帶，說明檢測的細胞中D元件已切離
(3)③
(4)插入的是非基因序列（或未選擇表達的基因或內含子或非編碼區等，插入D元件后引發的突變為隱性突變，插入D元件后表達的蛋白質功能未受影響或影響不大）
【分析】1 、PCR技術需要引物的主要原因在于DNA聚合酶只能從3'端延伸DNA鏈，而不能從頭開始合成DNA 。引物的作用是為DNA聚合酶提供一個起始點，使其能夠沿著模板鏈合成新的DNA鏈；
2、基因工程共四個步驟：第一步，獲取目的基因；第二步，基因表達載體的構建；第三步，將目的基因導入受體細胞；第四步，目的基因的檢測與鑒定。
【詳解】（1）引物是根據目的基因（轉座酶基因）兩端的堿基序列設計的，引物F1/R1能與轉座酶基因兩端的特定序列互補配對，所以使用引物F1/R1通過PCR技術可特異性擴增轉座酶基因。由圖甲可知，載體上含有HPH（潮霉素抗性基因）、GFP（綠色熒光蛋白基因）、RFP（紅色熒光蛋白基因）），當植物被農桿菌成功轉化后，這些基因會進入植物細胞，可通過檢測來判斷植物是否被成功轉化，所以可選用HPH（潮霉素抗性基因）、GFP（綠色熒光蛋白基因）、RFP（紅色熒光蛋白基因））作為篩選基因檢測植物是否被農桿菌成功轉化；
（2）由題意可知，使用F2/R2引物擴增的是包含D元件的片段，使用F2/R4引物擴增時，若D元件未發生切離則擴增不出條帶。觀察圖丙，植株2-9組用F2/R2引物擴增出條帶，說明細胞中D元件未切離；用F2/R4引物也擴增出條帶，說明部分細胞中的D元件發生了切離（因為未切離時F2/R4擴增不出條帶），所以既含有轉座的細胞又含有未發生轉座的細胞的植株是2-9組；
（3）由圖甲可知，D元件插入在綠色熒光蛋白基因（GFP）中，若D元件穩定存在，會破壞GFP基因，導致不產生綠色熒光；紅色熒光蛋白基因（RFP）與D元件的轉座無關。①組GFP(+)、RFP(+)，說明D元件可能發生了轉座，從GFP基因中切離出來，使得GFP基因能正常表達；②組GFP(+)、RFP(-)，不符合載體的基因結構特點（正常載體有RFP基因），可能是異常情況；③組GFP (-)、RFP(+)，說明D元件穩定存在于GFP基因中，破壞了GFP基因，且RFP基因正常表達，所以含有D元件且D元件遺傳穩定性高的是③組；④組GFP (-)、RFP(-)，不符合載體的基因結構特點（正常載體有RFP基因），可能是異常情況；
（4）D元件隨機插入染色體后獲得具有突變表型的植物個體的比率較低，可能的原因有插入的是非基因序列（或未選擇表達的基因或內含子或非編碼區等，插入D元件后引發的突變為隱性突變，插入D元件后表達的蛋白質功能未受影響或影響不大）。
3．帕金森病（PD）嚴重威脅中老年人健康。單唾液酸四己糖神經節苷脂（GM1）是臨床用于治療PD的藥物之一。天然豬腦中的GM1含量低，但合成GM1的原料GD1和GT1的含量較多，GD1和GT1可在唾液酸酶的作用下生成GM1。研究人員從某菌中獲取唾液酸酶基因M，與質粒P構建成基因表達載體M—P，導入大腸桿菌中，以獲得唾液酸酶高產菌株，用以滿足工業化生產GM1的需求。目的基因部分序列、質粒P信息、相關限制酶識別序列及切割位點如圖1、圖2、圖3所示。
(1)啟動子是 識別和結合的部位。當誘導物存在時，誘導型啟動子可 目的基因的表達。圖2質粒P中的GD誘導型啟動子可誘導M基因以a鏈為模板鏈進行轉錄，據此推測M基因的轉錄從其 （填“左側”或“右側”）開始。
(2)利用PCR技術擴增M基因時，需依據圖1中的已知堿基序列等信息設計引物，設計的兩引物堿基序列為5′- -3′（寫出8個堿基）和5′ 3′（寫出8個堿基）。所用的引物越短，引物特異性越 （填“高”或“低”）。
(3)將基因表達載體M—P導入大腸桿菌前，一般先用 （填物質）處理大腸桿菌，其目的是 。
(4)為檢測M基因的表達情況，可以采用 的方法對提取的受體大腸桿菌的蛋白質進行檢測。
【答案】(1) RNA聚合酶 啟動 右側
(2) GAATTCCT GGATCCAT 低
(3) Ca2+ 增大大腸桿菌細胞膜的通透性，有利于構建好的重組質粒轉入受體細胞大腸桿菌種
(4)抗原—抗體雜交
【分析】DNA連接酶和DNA聚合酶是兩種不同的酶，主要的區別就在于它們的底物是不一樣的，DNA連接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯鍵，但是DNA連接酶連接的是DNA片段，DNA聚合酶主要就是將單個脫氧核糖核苷酸按照順序連接到DNA鏈上。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞常用顯微注射技術；將目的基因導人微生物細胞常用Ca2+處理法。
【詳解】（1）啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位。當誘導物存在時，誘導型啟動子可啟動目的基因的表達。M基因以a鏈為轉錄模板鏈，基因轉錄時從模板鏈的3'開始，因此據此推測M基因的轉錄從其右側開始。
（2）結合質粒中啟動子的方向可知，目的基因a鏈3′端連接啟動子，5′端連接終止子，為了能使擴增后的目的基因與質粒正向連接，需要在目的基因的左右兩側分別添加限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的識別序列，所以需要在PCR擴增儀中加入的引物序列為5'-GAATTCCT-3'和5'-GGATCCAT-3'。引物越短，則其與目標序列配對的專一性越“低”。
（3）Ca2+處理大腸桿菌，可以增大細胞膜的通透性，大腸桿菌變為感受態的大腸桿菌，有利于構建好的重組質粒轉入受體細胞大腸桿菌。
（4）為檢測 M 基因是否成功表達，可對受體菌提取的蛋白質進行抗原—抗體雜交的方法對提取的受體大腸桿菌的蛋白質進行檢測。
21世紀教育網(www.21cnjy.com)押題10 基因表達與基因工程中PCR關聯考題
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題型02 DNA復制中自修復和岡崎片段問題
題型03雙脫氧測序法
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題型10基因工程和孟德爾定律關聯考題
猜押考點 3年真題 考情分析 押題依據
基因表達與基因工程中PCR關聯考題 2021年山東卷第25題 2022年山東卷第13、25題 2023年山東卷第5、25題 2024年山東卷第5、25題 2025年新高考生物新結構體系下，基因表達與基因工程中PCR關聯題型更注重考察學生的審題能力和知識點掌握的全面和準確性；以基礎知識為引導，深入考察延伸思路。 題目更加注重綜合性、應用性、創新性，對知識點的背景和應用有更多的掌握。 基因工程題型要求考生在細讀題干的基礎上，依據題目提供的信息，聯系所學的知識和方法，實現信息的遷移，達到靈活解題的目的；遇到新情境問題，應耐心讀題，分析題干信息及隱含的知識點，弄清新定義的性質，按新定義的要求，“照章辦事”，逐條分析、驗證、運算，使問題得以解決. 難度適中，可以預測2025年選擇題拓展題目命題方向將會以新情境信息題型展開命題．
題型1 融合基因中PCR的應用
1．（多選）丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一種傳染病。為研制針對HCV的多肽疫苗，某研究小組構建LTB-R9-Bp融合基因的過程如圖，進而構建出融合基因表達載體，其中LTB是一種免疫增強劑基因，R9-Bp是HCV兩個相連的包膜蛋白基因。下列說法正確的是（ ）
A．PCR反應體系中需加入待擴增的模板、引物、原料以及耐高溫的DNA聚合酶
B．若要大量擴增LTB-R9-Bp融合基因，可選擇引物P2和引物P3繼續進行PCR
C．融合基因表達載體的組成元件有融合基因、標記基因、啟動子和終止密碼子等
D．若利用轉基因植物生產該疫苗，需用到基因工程、植物組織培養和抗原抗體雜交技術
題型2 DNA復制中自修復和岡崎片段問題
1．已知紫外線（UV）可誘導DNA單鏈上相鄰的T之間相互結合形成嘧啶二聚體，阻礙堿基正常配對而導致復制錯誤引起突變，DNA修復機制對維持遺傳穩定性至關重要。研究人員發現某細菌中存在兩種如圖所示修復機制：①光復活修復：光復活酶（PRE）在可見光下直接切割二聚體，恢復原結構；②暗修復：無需光照，通過切除損傷單鏈并重新合成。下列說法正確的是（ ）

A．PRE可將嘧啶二聚體的磷酸二酯鍵斷開
B．暗修復過程中還需消耗原料、能量和引物
C．PRE基因發生堿基替換后，在光照下PRE的修復功能可能正常
D．UV誘導DNA形成嘧啶二聚體引起的變異不可遺傳
2．端粒學說是細胞衰老的假說之一，研究發現，端粒縮短與DNA復制方式有關。人體細胞內DNA復制部分過程如圖所示。下列敘述錯誤的是（ ）
A．圖示體現了DNA半保留復制、雙向復制的特點
B．圖示引物為短單鏈核酸，復制過程中會被酶切除
C．PCR擴增的原理與生物體內DNA復制的原理相同
D．端粒縮短的原因是新合成的子鏈5'端變短
3．我國科學家敲除豬的糖抗原合成基因（β4GalNT2），轉入相應的調節基因后，將基因編輯豬的單個腎移植給獼猴，同時切除獼猴的自體雙腎，最終移植腎存活184天。在移植成功5個月內，獼猴的移植腎功能完全正常，之后出現逐漸加重的蛋白尿。下列說法正確的是（ ）
A．基因編輯豬的成功體現了動物細胞的全能性
B．出現蛋白尿的原因主要是腎小管細胞凋亡導致
C．豬和獼猴腎臟的差異體現了基因的選擇性表達
D．敲除β4GalNT2能改變膜蛋白種類，降低免疫排斥反應
4．一段雙鏈DNA的一條核苷酸鏈上有2個胞嘧啶（C），其中1個C被甲基化生成5-甲基胞嘧啶（5-mC），C與5-mC進一步被氧化脫氨基分別生成胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）。細胞內存在尿嘧啶錯配修復系統，該系統能在U的兩側將核苷酸單鏈切開，清除兩切點間包含U的核苷酸片段后再合成正確的片段。下列說法錯誤的是（ ）
A．尿嘧啶錯配修復系統具有限制酶、DNA聚合酶和DNA連接酶的功能
B．在修復并進行復制的過程中，可能使用4種核苷酸作為原料
C．修復時，以切口處末端核苷酸鏈為引物延伸正確DNA片段
D．若未被修復，復制兩次后，兩個位點的C才都會被A替代
題型3雙脫氧測序法
1．雙脫氧測序法是第一代DNA測序方法。在4支試管中分別加入4種dNTP和少量的1種ddNTP進行PCR，再把PCR產物變性，利用電泳進行分離，根據結果確定特定堿基的位置。通過該方法測定并比較某疾病患者與對照個體DNA模板鏈的一段堿基序列，結果如圖所示。下列敘述錯誤的是（ ）

注：dNTP是PCR的四種原料；雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四種；在DNA聚合酶作用下，ddNTP與dNTP競爭核苷酸鏈延長位點，以加入ddATP的體系為例：若配對的為ddATP，延伸終止；若配對的為dATP，繼續延伸。
A．上述PCR反應體系中模板鏈需要足夠多 B．患者該段序列中某位點的堿基C突變為T
C．5'－TAGTGCCCATC－3'為對照個體的一段序列 D．沿電泳方向，核苷酸鏈長度逐漸減小
2．采用焦磷酸光化測序法進行DNA測序的原理是：將待測DNA鏈固定到一個磁珠上，將磁珠包被在單個油水混合小滴（乳滴）中，在該乳滴里進行獨立的DNA復制，四種脫氧核苷三磷酸依照T、A、C、G的順序一個一個進入該乳滴，如果發生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸（PPi），PPi經過一系列酶促反應后發出熒光。下列說法錯誤的是（ ）

A．脫氧核苷三磷酸通過磷酸二酯鍵把脫氧核苷酸接到多核苷酸鏈的3'-OH末端
B．PPi經過一系列的酶促反應后，釋放出的能量一部分可轉化為光能
C．當胞嘧啶脫氧核苷三磷酸進入后能發出熒光，說明此位置模板鏈上為G
D．若將四種脫氧核苷三磷酸同時加入反應體系中，可大大提高DNA測序的效率
3．凝膠阻滯試驗（EMSA）的基本原理是：熒光標記的DNA與蛋白質結合后分子量增大，電泳后通過熒光檢測可在相應位置顯示出阻滯條帶。已知O2蛋白通過與ZmGRAS11基因啟動子區的motif序列結合來調控ZmGRAS11基因的表達，科學家為證實motif序列是與O2蛋白結合的關鍵序列，利用熒光標記的motif序列作為指示探針，無熒光標記的motif序列（WT）和無熒光標記的突變motif序列（M1～M6）作為7種競爭探針，進行EMSA試驗，實驗結束后進行熒光檢測，結果如下圖所示，下列說法錯誤的是（ ）
注：“+”表示加入相應物質；“-”表示未加入相應物質；競爭探針足夠多
A．圖中“？”是指熒光標記的指示探針
B．泳道3無阻滯條帶的原因是O2蛋白全部與WT探針結合
C．在競爭探針中引入突變可評估突變對競爭探針與O2蛋白結合的影響
D．突變對探針M4～M6與O2蛋白結合能力影響相對較小的是M4、M5
題型4 DNA的粗提取實驗
1．關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是（　　）
A．整個提取過程中可以不使用離心機
B．研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應充分搖勻再倒入燒杯中
C．鑒定過程中DNA雙螺旋結構不發生改變
D．僅設置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾
題型5 DNA不同片段間互為引物的問題
1．制備熒光標記的DNA探針時，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標記的dATP）的反應管①~④中，分別加入如表所示的適量單鏈DNA。已知形成的雙鏈DNA區遵循堿基互補配對原則，且在本實驗的溫度條件下不能產生小于9個連續堿基對的雙鏈DNA區。能得到帶有熒光標記的DNA探針的反應管有（　　）
反應管 加入的單鏈DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A．①② B．②③ C．①④ D．③④
2．用DNaseI酶切割DNA分子，可產生一系列不同長度的DNA片段，且相鄰片段只相差1個核苷酸。當DNA分子中的某一區段與特異的轉錄因子蛋白質結合后，加入DNaseI酶時該區段會得到保護，在凝膠電泳放射性自顯影圖片上會出現一個空白區“足跡”，這種檢測DNA序列的方法稱為DNaseI足跡法。上述過程如圖所示，下列說法正確的是（ ）

A．需設置不添加DNaseI酶的對照組
B．對照組的每個DNA分子只發生一次磷酸二酯鍵的斷裂
C．未與特定蛋白結合的DNA切割后的片段長度相同
D．此方法可篩選能與DNA進行特異性結合的目標蛋白
3．為制備帶有熒光標記的DNA探針，研究人員在反應系統內只添加了DNA聚合酶、緩沖液、H2O和4種dNTP（dN—Pα～Pβ～Pγ，其中dGTP被熒光標記）的反應管①～③中分別加入適量單鏈DNA（如圖）。形成的雙鏈DNA區遵循堿基互補配對原則，且在本實驗的溫度條件下不能產生小于9個連續堿基對的雙鏈DNA區。下列分析正確的是（ ）
反應管①：5′-GGCTATAGCCAGA-3′
反應管②：5′-GTTTCGCGATGGC-3′；3′-AGCGCTACCGATG-5′
反應管③：5′-CCAGGAGATTGC-3′；3′-CCTCTAACGATC-5′
A．實驗中需要用熒光物質對dGTP的γ位磷酸基團進行標記
B．DNA聚合酶沿模板鏈將dNTP逐個連接到引物的5′端
C．反應管②的反應系統內因缺乏模板或引物不能進行PCR擴增
D．實驗結束后，能得到帶有熒光標記DNA探針的反應管只有③
題型6 基因工程中選酶問題
1．為篩選出能與SARS病毒的S蛋白特異性結合的受體蛋白，研究人員利用基因工程技術，在S蛋白末端添加TAP標簽（能特異性地與人和哺乳動物體內IgG類抗體結合）形成S-TAP融合蛋白，再利用該標簽在病毒敏感細胞中純化出S蛋白及其相互作用的蛋白質，部分過程如圖。回答下列問題。

注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶識別序列，各限制酶識別序列及切割后產生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示啟動子；Kozak序列是調控基因表達的重要序列且不含限制酶識別序列。
(1)為成功構建重組質粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR擴增S基因時，需在F引物的5'端外側依次添加 序列。PCR時新合成鏈的延伸方向是 （填“5′→3′”或“3′→5′”）。
(2)使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，DNA分子的遷移速率與 有關。
(3)在該重組質粒pcDNA3.1-S-TAP中，T7的作用是 ，重組質粒中還應該有的結構有 。
(4)為檢測轉染細胞中是否表達出了S-TAP融合蛋白，科研人員將轉染細胞置于載玻片，洗滌、固定后，滴加帶有熒光標記的 稀釋液，熒光顯微鏡下觀察，若出現熒光標記，則說明轉染細胞中表達出了S-TAP融合蛋白。
2．水體中的雌激素能使斑馬魚細胞產生E蛋白，激活卵黃蛋白原（vtg）基因的表達，因此斑馬魚可用于監測環境雌激素污染程度。為了實現可視化監測，科學家將圖1中的vtg基因與圖2中Luc基因載體連接，形成vtg-Luc基因重組載體，成功培育了轉基因斑馬魚，當極微量雌激素污染水體，斑馬魚的肝臟就發出熒光。Luc表示熒光素酶基因（無啟動子），Kanr為卡那霉素抗性基因，ori為復制起點，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI為限制酶，→表示轉錄方向。
注：圖1DNA片段不含有圖2所示限制酶的識別序列
(1)為使vtg基因與Luc基因載體形成重組載體，選用限制酶 切割Luc基因載體可降低“空載”概率。通過PCR技術獲取vtg基因時，需設計合適的引物。依據圖示信息，推測引物1包含的堿基序列為5′ 3′。（寫出已知的所有堿基序列）
(2)將“vtg-Luc基因重組載體”導入大腸桿菌中進行擴增，為便于篩選，應將大腸桿菌接種在含 的培養基中，轉基因成功的斑馬魚只在肝臟中發出熒光指示污染，其原因是 。
(3)Luc基因載體上有一段P2A序列，其功能如圖所示，據此推測P2A的作用 。
(4)進一步研究發現，E蛋白能與vtg基因啟動子的特定序列結合，啟動該基因的表達。已知vtg基因啟動子含區域1和區域2，為研究E蛋白的結合位點，設計如下實驗：用限制酶將啟動子切割成含區域1和區域2的兩個片段，將兩個酶切片段分別與Luc基因載體連接，連接位點位于Luc基因的上游，形成兩種重組載體。將重組載體分別導入斑馬魚的 ，待發育成熟后，往水體中添加 進行檢測。
題型7 PCR引物設計及電泳條帶問題
1．大豆中轉錄調控因子Y 蛋白可以和某些基因啟動子序列結合，促進其表達以增強大豆對干旱和鹽脅迫的抗性。研究人員通過逆轉錄獲得Y 基因并將其下游終止密碼子對應序列剔除，然后與載體上綠色熒光蛋白基因 (GFP) 進行拼接獲得融合基因。成功表達的Y-GFP融合蛋白可用于Y 蛋白調控機理的研究。
(1)研究中首先要對Y基因進行PCR擴增，擴增過程中復性的目的是 。圖甲所示Y基因序列為轉錄的 (填“模板鏈”或“非模板鏈”)。已知EcoRI識別序列為5'-GAATTC-3'，BamHI識別序列為5'-GGATCC-3'，這些限制酶識別序列不影響融合蛋白基因的表達。為使Y基因正確接入載體并成功表達出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游擴增引物應 為5'- -3'(包括添加的限制酶識別序列，共寫12個堿基)。
(2)將初步構建的Y-GFP 基因表達載體轉入大豆細胞后，對經潮霉素篩選得到的兩個不同細胞系總蛋白進行抗體檢測，電泳結果如圖乙所示。其中細胞系 能成功表達出Y-GFP融合蛋白 。
(3)為探究Y 蛋白能否與S 基因(大豆類固醇化合物合成的關鍵基因)啟動子序列結合，用S基因啟動子序列制作的探針進行相關實驗，實驗結果如圖丙所示。已知Y 蛋白與DNA 序列結合后，可在凝膠電泳中產生阻滯條帶。據圖分析，Y 蛋白 (填“能”或“不能”) 與S 基因啟動子序列結合，相比于a 條帶，b條帶放射性低的原因是
(4)過表達Y基因或施加外源大豆類固醇化合物均可顯著增強大豆對干旱和鹽脅迫的抗性。綜上所述，Y蛋白增強大豆對干旱和鹽脅迫抗性的機理是 。
2．RCA是一種核基因（rca）編碼的葉綠體蛋白。為研究RCA對光合作用的影響及機理，科研人員構建反義rca基因表達載體（rca基因反向插入表達載體），利用農桿菌轉化法導入大豆細胞，成功獲得rca基因沉默的轉基因品種（如圖1），①~⑥表示相關過程。
(1)參與過程①的酶有 （至少寫兩種）。在設計引物擴增rca基因時，不能選定rca基因的M端的5'－TCAGAGCCAATTGGCT－3'和N端的5'－AGTTCACTG－GCCAGTG－3'序列，分別作為引物2和引物1的設計區，原因是 。已知①過程rca基因的b鏈和獲取它的模板mRNA互補，依據圖1中給出的引物1設計區的堿基序列及限制酶的信息，從5'端到3'端寫出引物1的堿基序列 （只寫出前8個堿基即可）。
(2)過程②用C4pdk啟動子替換Ti質粒上原有啟動子的目的是 ，過程④常用的方法是 ，⑤過程后可用含抗生素 的培養基篩選出轉化成功的大豆細胞。
(3)科研人員將野生型大豆和轉基因大豆在適宜的光照條件下進行培養，一段時間后分別測定相關指標，結果如圖2（Rubisco是光合作用暗反應中的一種關鍵酶）。據圖分析，RCA對光合作用的影響及機理是 。
3．滾環擴增技術（RCA）是借鑒自然界中病原生物體環狀DNA分子滾環式復制方式發展起來的一種核酸擴增方法，在致病菌、核酸腫瘤標記物、蛋白質、生物小分子和病毒檢測領域有著廣泛應用。圖1為RCA原理示意圖。具核梭桿菌為一種強粘附性消化道細菌，侵入腸黏膜后可誘導局部炎癥和細胞因子的表達增加，導致結直腸腫瘤的形成。科研人員采用基于RCA的熒光標記滾環擴增檢測方法，實現了在微量樣品及復雜環境下的高靈敏度、高特異性的檢測。圖2為熒光標記滾環擴增檢測過程示意圖，過程②是使鎖式探針環化的過程。其中nusG基因為具核梭桿菌的特異性基因，鎖式探針為依據nusG基因序列設計出來的單鏈DNA分子，由兩端的檢測臂和無關序列組成。只有當環境中存在靶核酸序列時，鎖式探針才能完成成環連接反應。檢測探針中的熒光基團（FAM）距離淬滅基團（BHQ-1）比較近時，熒光會被淬滅。

(1)由圖1推測，Phi29DNA聚合酶的作用是 。與常規PCR相比，RCA缺乏 環節，因此可推測RCA擴增過程中使用的Phi29DNA聚合酶不具有 的特性。
(2)過程②鎖式探針完成成環連接反應需要 的催化。腸道中含有多種微生物，為保證檢測的特異性，在設計鎖式探針時需保證 ，同時還需注意無關序列中不含 。
(3)若檢測樣品存在具核梭桿菌，檢測探針中熒光基團發出熒光的原理是 。該檢測方法具有高靈敏度的原因是 。
題型8 外源基因插入及基因序列問題
1．由P基因編碼的P蛋白是一種水通道蛋白，該蛋白在植物調節水分吸收方面發揮著重要作用。科研人員成功培育出超量表達P蛋白的轉基因玉米。培育過程中所用DNA片段和Ti質粒的酶切位點如圖1所示。
(1)構建基因表達載體時，切割Ti質粒應選用 酶。從切割DNA片段和Ti質粒到構建基因表達載體完成共需 種酶。
(2)將農桿菌浸泡過的玉米愈傷組織進行植物組織培養，培養基中需加入 （填“潮霉素”、“卡那霉素”或“潮霉素或卡那霉素”）進行篩選，理由是 。篩選出的愈傷組織最終培養成轉基因玉米。
(3)農桿菌轉化法除了用于獲取轉基因植物外，還可以通過T-DNA插入基因內部使基因沉默，獲得突變體。為了獲得mm突變體，某科研小組利用野生型MM，通過農桿菌轉化法使基因M沉默。由于T-DNA插入的位置是隨機的，為確定T-DNA是否插入M基因中，該小組采用“三引物法”進行PCR擴增，即采用三種引物（LP、RP、BP），LP、RP為與目的基因片段互補的特異引物，BP為插入T-DNA的特異引物，如圖所示。（說明：T-DNA插入基因后，會阻止被插入基因兩端引物的擴增產物的形成）根據下表中三種樣品的電泳結果判斷樣品 是純合突變體，理由是 。
引物種類樣品序號 LP+RP BP+RP
樣品1 有大片段 無
樣品2 有大片段 有小片段
樣品3 無 有小片段
2．研究發現基因L能夠通過脫落酸信號途徑調控大豆的逆境響應。利用基因工程技術編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaI切點處插入大豆基因L的向導DNA序列，將載體導入大豆細胞后，其轉錄產物可引導核酸酶特異性結合基因組上的目標序列并發揮作用。載體信息、目標基因L部分序列及相關結果等如圖所示。
(1)用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目標基因L時，所用的引物越短，引物特異性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因組DNA，理論上可產生的黏性末端最多有 種。載體信息如圖甲所示，經BsaI酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5'- -3'和5'- -3'。
(2)重組載體通過農桿菌導入大豆細胞，使用抗生素 篩選到具有該抗生素抗性的植株①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點如圖乙所示，PCR產物完全酶切后的電泳結果如圖丙所示。據圖可判斷選用的限制酶是 ，其中純合的突變植株是 （填序號）。
(3)實驗中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測發現其體細胞中只有1條染色體有T-DNA插入。用抗生素篩選這個植株的自交子代，其中突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例為 ，篩選出的敏感植株可用于后續的品種選育。
題型9 重組基因中引物選擇
1．科研人員構建了可表達J-V5融合蛋白的重組質粒并進行了檢測，該質粒的部分結構如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。

(1)與圖甲中啟動子結合的酶是 。除圖甲中標出的結構外，作為載體，質粒還需具備的結構有 （答出2個結構即可）。
(2)構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物 。已知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的 （填“a鏈”或“b鏈”）相應部分的序列相同。
(3)重組質粒在受體細胞內正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應蛋白是否表達以及表達水平，結果如圖乙所示。其中，出現條帶1證明細胞內表達了 ，條帶2所檢出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重組質粒上的J基因表達的。
2．某種類型的白血病由蛋白P引發，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理，需構建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質結合，但不影響P或P△的功能。
(1)為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是 、為使PCR產物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR擴增得到的P基因經酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導入細胞后，融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同。據圖甲分析，出現該問題的原因是 。修改擴增P基因時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是 。
(3)融合蛋白表達成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經含FLAG抗體的介質，分離出與介質結合的物質并用UBC抗體檢測，檢測結果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③組結果的差異推測，藥物A的作用是 ；由②④組或③⑤組的差異推測，P△中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根據以上結果推測，藥物A治療該病的機理是 。
3．人類γ基因啟動子上游的調控序列中含有 BCL11A 蛋白結合位點，該位點結合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列，解除對γ基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療。科研人員擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉化和熒光檢測，以確定 BCL11A 蛋白結合位點的具體位置。相關信息如圖所示。
（1）為將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，需在引物末端添加限制酶識別序列。據圖可知，在 F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所對應的限制酶是 。本實驗中，從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要 種酶。
（2）將構建的載體導入除去 BCL11A 基因的受體細胞，成功轉化后，含 F1～F6與 R 擴增產物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含 F7與 R 擴增產物的受體細胞無熒光。含 F7 與 R 擴增產物的受體細胞無熒光的原因是 。
（3）向培養液中添加適量的雌激素，含 F1～F4與 R 擴增產物的受體細胞不再有熒光，而含 F5～F6與 R 擴增產物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調控序列上與引物序列所對應的位置不含有 BCL11A 蛋白的結合位點序列，據此結果可推測，BCL11A 蛋白結合位點位于 ，理由是 。
題型10 基因工程和孟德爾定律關聯考題
1．某二倍體兩性植物，抗病與感病、高稈與矮稈、耐鹽與鹽敏感分別由A/a、B/b、D/d三對基因控制，各相對性狀均為完全顯性。研究發現，在正常條件下，三對等位基因表達正常。在干旱脅迫下，只考慮上述三對基因的個體形成的配子中，某個基因的表達會因與其位于同一條染色體上的其他基因的影響而被抑制。為研究上述性狀的遺傳特性，選用該植物抗病矮稈耐鹽品系（甲）和感病高稈鹽敏感品系（乙）在不同條件下進行了雜交實驗，實驗結果如表所示。不考慮突變和交換。
組別 環境條件 親本 F1表型及比例
實驗一 正常條件 甲（）×乙（） 均為抗病矮稈耐鹽
實驗二 干旱脅迫 甲（）×乙（） 均為抗病高稈耐鹽
(1)依據 （填“實驗一”或“實驗二”或“實驗一或實驗二”）可判斷出三對相對性狀的顯隱性，理由是 。
(2)若實驗一的F1自交后代中抗病矮稈所占比例為 ，可確定A/a和B/b兩對等位基因位于一對同源染色體上。
(3)在干旱脅迫下，選取實驗二F1自交獲得的F2中感病高稈耐鹽植株的葉片為材料，通過PCR檢測每株個體中控制這3種性狀的所有等位基因，以輔助確定這些基因在染色體上的相對位置關系。對被檢測群體中所有個體按PCR產物的電泳條帶組成（即基因型）相同的原則歸類后，預期電泳圖譜只有I或Ⅱ兩種類型，如下圖所示。已知各基因的PCR產物通過電泳均可區分，其中條帶①和⑤分別代表基因D和a。
①圖中條帶②代表的基因是 。
②若電泳圖譜為類型I，請在答題卡方框內畫出F1個體三對等位基因的位置關系。 （用橫線代表染色體，圓點代表基因）
③若電泳圖譜為類型Ⅱ，被檢測群體在F2中所占的比例為 ，其中能穩定遺傳的比例為 。
(4)由上述信息可知，在干旱脅迫下，F1形成的配子中 基因受到與其位于同一條染色體上基因的影響而表達受抑制；若（3）中電泳圖譜為類型Ⅱ，則干旱條件下F1減數分裂形成 （填“雌配子”、“雄配子”或“雌配子和雄配子”）時，該基因的表達會受到抑制，判斷依據是 。
2．突變體是植物功能基因組學研究的基礎材料，科研人員利用玉米轉座酶基因和D元件的雙熒光載體的轉座系統（如圖甲所示），進行二穗短柄草突變體培育實驗。轉座酶可識別D元件兩端的反向重復序列并將其切離。此外，轉座酶能夠不斷將D元件重新連接到染色體的任意位置，即完成了“轉座”過程。相關實驗過程、結果如下圖所示。
(1)使用引物F1/R1通過PCR技術可特異性擴增轉座酶基因，原因是 ；可選用 基因作為篩選基因檢測植物是否被農桿菌成功轉化。
(2)為了檢測圖中載體中的D元件是否成功在二穗短柄草基因組中發生切離，分別使用F2/R2引物和F2/R4引物對T0代轉基因陽性苗進行PCR檢測，已知若D元件未發生切離，使用F2/R4引物進行PCR擴增不出條帶。據圖丙所示植株1至10的電泳結果，既含有轉座的細胞又含有未發生轉座的細胞的植株是 ，原因是 。
(3)對T0代陽性植株自交得到的T1代的幼根同時觀察綠色熒光（GFP）和紅色熒光（RFP），得到4組結果：①GFP（+）、RFP（+）；②GFP（+）、RFP（-）；③GFP（-）、RFP（+）；④GFP（-）、RFP（-）。根據上述實驗結果推測含有D元件且D元件遺傳穩定性高的是 （填序號）組。
(4)研究發現，D元件隨機插入染色體后獲得具有突變表型的植物個體的比率較低，可能的原因有 。
3．帕金森病（PD）嚴重威脅中老年人健康。單唾液酸四己糖神經節苷脂（GM1）是臨床用于治療PD的藥物之一。天然豬腦中的GM1含量低，但合成GM1的原料GD1和GT1的含量較多，GD1和GT1可在唾液酸酶的作用下生成GM1。研究人員從某菌中獲取唾液酸酶基因M，與質粒P構建成基因表達載體M—P，導入大腸桿菌中，以獲得唾液酸酶高產菌株，用以滿足工業化生產GM1的需求。目的基因部分序列、質粒P信息、相關限制酶識別序列及切割位點如圖1、圖2、圖3所示。
(1)啟動子是 識別和結合的部位。當誘導物存在時，誘導型啟動子可 目的基因的表達。圖2質粒P中的GD誘導型啟動子可誘導M基因以a鏈為模板鏈進行轉錄，據此推測M基因的轉錄從其 （填“左側”或“右側”）開始。
(2)利用PCR技術擴增M基因時，需依據圖1中的已知堿基序列等信息設計引物，設計的兩引物堿基序列為5′- -3′（寫出8個堿基）和5′ 3′（寫出8個堿基）。所用的引物越短，引物特異性越 （填“高”或“低”）。
(3)將基因表達載體M—P導入大腸桿菌前，一般先用 （填物質）處理大腸桿菌，其目的是 。
(4)為檢測M基因的表達情況，可以采用 的方法對提取的受體大腸桿菌的蛋白質進行檢測。
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