資源簡介

考點1　植物細胞工程
1．植物組織培養技術——原理：植物細胞的全能性
(1)植物組織培養中添加蔗糖的目的是提供營養和調節滲透壓。
(2)脫分化階段不需要光，再分化階段需要光。
(3)生長素與細胞分裂素的比值高時，促進根的分化、抑制芽的形成；比值低時，促進芽的分化、抑制根的形成。
(4)體內細胞未表現全能性的原因：在特定的時間和空間條件下，細胞中的基因會選擇性地表達。
2．植物體細胞雜交技術——原理：植物細胞的全能性、細胞膜的流動性
(1)圖中過程①用纖維素酶和果膠酶處理去除細胞壁，得到的原生質體包括細胞膜、細胞質和細胞核三部分。
(2)酶解去壁前用較高滲透壓溶液處理細胞：使細胞處于微弱的質壁分離狀態，有利于完整的原生質體的釋放，防止原生質體被破壞。
(3)圖中過程②的誘導方法有電融合法、離心法、聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+—高pH融合法等。
(4)原生質體融合成功的標志是雜種細胞再生出細胞壁。
3．植物體細胞雜交和有性雜交的比較
1．(2024·湖北卷)植物甲抗旱、抗病性強，植物乙分蘗能力強、結實性好。科研人員通過植物體細胞雜交技術培育出兼有甲、乙優良性狀的植物丙，過程如下圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
A．過程①中酶處理的時間差異，原因可能是兩種親本的細胞壁結構有差異
B．過程②中常采用滅活的仙臺病毒或PEG誘導原生質體融合
C．過程④和⑤的培養基中均需要添加生長素和細胞分裂素
D．可通過分析植物丙的染色體，來鑒定其是否為雜種植株
B　[酶解是為了去除植物細胞的細胞壁，過程①中酶處理的時間不同，原因可能是兩種親本的細胞壁結構有差異，A正確；過程②為原生質體的融合，常用PEG誘導原生質體融合，滅活的仙臺病毒可誘導動物細胞融合，不能用于植物細胞融合，B錯誤；過程④脫分化和⑤再分化的培養基中均需要添加生長素和細胞分裂素，但在兩個過程中比例不同，C正確；可通過分析植物丙的染色體，來鑒定其是否為雜種植株，D正確。]
2．(2024·黑、吉、遼卷)迷迭香酸具有多種藥理活性。進行工廠化生產時，先誘導外植體形成愈傷組織，再進行細胞懸浮培養獲得迷迭香酸，加入誘導劑茉莉酸甲酯可大幅提高產量。下列敘述錯誤的是(　　)
A．迷迭香頂端幼嫩的莖段適合用作外植體
B．誘導愈傷組織時需加入NAA和脫落酸
C．懸浮培養時需將愈傷組織打散成單個細胞或較小的細胞團
D．茉莉酸甲酯改變了迷迭香次生代謝物的合成速率
B　[迷迭香頂端幼嫩的莖段含有較高的生長素和細胞分裂素，適合用作外植體，A正確；誘導愈傷組織時需加入NAA和細胞分裂素，B錯誤；懸浮培養時需將愈傷組織打散成單個細胞或較小的細胞團，C正確；加入誘導劑茉莉酸甲酯可大幅提高產量，推測茉莉酸甲酯改變了迷迭香次生代謝物的合成速率，D正確。]
判斷與填空
1．研究者通過體細胞雜交技術，探索利用條斑紫菜和擬線紫菜培育雜種紫菜。從食用紫菜的動物消化道內提取蛋白酶，用于去除細胞壁。(2023·江蘇卷T13) (×)
提示：紫菜細胞的細胞壁的主要成分是纖維素和果膠，用蛋白酶無法去除細胞壁。
2．利用植物細胞培養技術在離體條件下對單個細胞或細胞團進行培養使其增殖，可獲得植物細胞的某些次生代謝物。次生代謝物是植物所必需的，但含量少，應選擇產量高的細胞進行培養。(2023·山東卷T14) (×)
提示：次生代謝物不是植物生長所必需的，其含量少，可以通過增加細胞的數量來增加次生代謝物的產量。
3．人參皂苷是人參的主要活性成分。科研人員分別誘導人參根與胡蘿卜根產生愈傷組織并進行細胞融合，以提高人參皂苷的產率。高Ca2+—高pH溶液可促進細胞融合。(2023·廣東卷T12) (√)
4．在藍莓組織培養過程中，宜選用藍莓成熟葉片為材料制備外植體。(2022·遼寧卷T14) (×)
提示：宜選用藍莓幼嫩葉片為材料制備外植體，因為幼嫩葉片細胞分裂旺盛、易培養。
5．植物組織培養技術常用于商業化生產：其過程一般為：無菌培養物的建立→培養物增殖→生根培養→試管苗移栽及鑒定。提高培養基中生長素與細胞分裂素的比值，有利于誘導生根。(2021·江蘇卷T5) (√)
6．植物細胞合成的賴氨酸達到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關鍵酶的活性，導致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調節方式屬于__________。根據這種調節方式，在培養基中添加______________________，用于篩選經人工誘變的植物懸浮細胞，可得到抗賴氨酸類似物的細胞突變體，通過培養獲得再生植株。(2023·浙江6月卷T23)
提示：負反饋調節　過量賴氨酸類似物
7．利用帶側芽的莖段獲得叢狀苗的過程與利用莖段誘導產生愈傷組織再獲得叢狀苗的過程相比，前者總培養時間________，且不經歷__________過程，因而其遺傳性狀穩定，是大多數植物快速繁殖的常用方法。(2020·浙江7月卷T29)
提示：短　脫分化
8．植物組織培養技術可與基因工程技術相結合獲得轉基因植株。將含有目的基因的細胞培養成一個完整植株的基本程序是______________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________(用流程圖表示)。(2019·全國Ⅱ卷T38)
提示：含目的基因的細胞愈傷組織小植株
植物細胞工程的基本技術
1．(2024·廣東茂名三模)轉錄因子Gh1和GhE1能調控棉花愈傷組織細胞的生長發育，參與體細胞胚胎發生過程中細胞命運的重塑，其機制如圖所示。下列相關分析正確的是(　　)
A．將愈傷組織細胞在脫分化培養基上繼續培養可得到幼苗
B．Gh1基因發生甲基化可能會抑制愈傷組織細胞的增殖
C．促進GhE1基因的表達可促進愈傷組織分化成根等器官
D．Gh1與GhE1單獨作用均能調控GhPs基因的表達
B　[將脫分化產生的愈傷組織，在再分化培養基上繼續培養可得到幼苗，A錯誤；Gh1基因發生甲基化，則會抑制Gh1基因的表達，不能與GhE1基因的表達產物形成復合物調控GhPs的表達，從而抑制愈傷組織細胞的增殖，B正確；促進GhE1基因的表達，可能會導致GhPs基因的表達產物增多，從而促進愈傷組織細胞的增殖，抑制愈傷組織分化成根等器官，C錯誤；Gh1基因與GhE1基因表達后形成的蛋白質相互結合可調控GhPs基因的表達，Gh1與GhE1單獨作用不能調控GhPs基因的表達，D錯誤。]
2．(2024·湖南衡陽模擬)現有甲、乙兩個煙草品種(2n＝48)，其基因型分別為aaBB和AAbb，A/a、B/b這兩對基因位于非同源染色體上。在光強度大于800 lx時，甲、乙兩種煙草都不能生長，這是它們中各自存在的一對隱性純合基因(aa或bb)作用的結果。取甲、乙兩煙草品種的花粉分別培養成植株，將它們的葉肉細胞制成原生質體并混合，然后使之融合，誘導產生細胞團。隨后將誘導產生的細胞團放到光強度大于800 lx的光下培養，結果有的細胞團不能分化，有的能分化發育成植株。如果只考慮原生質體的兩兩融合，下列敘述正確的是(　　)
A．過程①是在無菌水中進行，需要纖維素酶和果膠酶
B．過程②是在固體培養基中進行，可用滅活的病毒誘導
C．過程③培養基中通常添加蔗糖作碳源和能源
D．能分化的細胞團發育成的植株自交，后代在光強度大于800 lx的光下，能生長的植株占7/16
C　[過程①是在等滲或較高滲溶液中進行，而不是在無菌水中進行，A錯誤；過程②是誘導融合，需要在液體培養基中進行，滅活的病毒可誘導動物細胞融合，B錯誤；過程③培養基中通常添加蔗糖作碳源和能源，C正確；據題分析可知，基因型為AaBb的細胞團能分化發育成植株，該植株自交產生的后代中，在光強度大于800 lx的光下能生長的植株的基因型為A_B_，所占比例為3/4×3/4＝9/16，D錯誤。]
植物體細胞工程的應用
3．(2024·湖南長沙二模)紅豆杉(2n＝24)能產生具有高抗癌活性的紫杉醇，柴胡(2n＝12)生長迅速。紅豆杉—柴胡是通過植物細胞工程培育的一種既能產生紫杉醇，又能迅速生長的雜交植株。部分培育過程如圖所示。下列有關敘述正確的是(　　)
A．獲得原生質體的過程需要用纖維素酶和胰蛋白酶去除細胞壁
B．過程①可用高Ca2+—高pH融合法誘導，利用了細胞膜的流動性
C．過程②的培養基中需添加適量的生長素類和赤霉素類植物生長調節劑
D．紅豆杉—柴胡雜種植株是二倍體，能夠產生可育配子
B　[植物細胞壁的成分主要是纖維素和果膠，獲得原生質體的過程需要用纖維素酶和果膠酶去除植物細胞的細胞壁，A錯誤；過程①是誘導原生質體融合，可用高Ca2+—高pH融合法，利用了細胞膜的流動性，B正確；過程②為脫分化，該過程需要在培養基中添加適量的生長素類和細胞分裂素類植物生長調節劑，C錯誤；紅豆杉—柴胡雜種植株是異源四倍體而不是二倍體，能夠產生可育配子，D錯誤。]
4．(2024·山東淄博二模)鐵皮石斛是名貴中藥，其有效成分生物堿為細胞的次生代謝物。研究人員將鐵皮石斛的營養芽采用組織培養技術培養成擬原球莖(PLBs，類似愈傷組織)，培養過程中PLBs重量、生物堿含量的變化如圖。下列說法錯誤的是(　　)
A．在培養前應對營養芽進行消毒，在火焰旁進行接種操作可減少污染
B．因新生營養芽的細胞分化程度低，作外植體培養時容易誘導形成PLBs
C．誘導營養芽形成PLBs的過程稱為細胞的脫分化，生物堿為該過程提供營養
D．與黑暗條件相比，PLBs在光照條件下的生長起始時間早、快速生長時間長
C　[在接種前對外植體進行消毒，并在火焰旁進行接種可減少污染，A正確；選用新生營養芽為外植體是因為其分化程度低、分裂能力旺盛且幾乎不攜帶病毒，作外植體培養時容易誘導形成PLBs，B正確；生物堿為細胞的次生代謝物，不能提供營養，C錯誤；由圖可知，與黑暗條件下相比，PLBs在光照條件下的生長起始時間早、快速生長時間長，D正確。]
考點2　動物細胞工程和胚胎工程
1．動物細胞培養
(1)動物細胞培養中兩次使用胰蛋白酶的作用不同：
第一次：處理剪碎的組織，使其分散成單個細胞；
第二次：使貼壁生長的細胞從瓶壁上脫落下來。
(2)區分原代培養和傳代培養的關鍵是：是否分瓶培養。
2．克隆動物培育的流程
3．胚胎早期發育過程
4．胚胎移植的生理學基礎
5．“試管羊”“克隆羊”和“轉基因羊”的產生過程比較
1．(2024·黑、吉、遼卷)從小鼠胚胎中分離獲取胚胎成纖維細胞進行貼壁培養，在傳代后的不同時間點檢測細胞數目，結果如圖。下列敘述正確的是(　　)
A．傳代培養時，培養皿需密封防止污染
B．選取①的細胞進行傳代培養比②更合理
C．直接用離心法收集細胞進行傳代培養
D．細胞增長進入平臺期可能與細胞密度過大有關
D　[傳代培養時需要營造無菌、無毒以及95%空氣＋5%CO2的氣體環境，而非密封，A錯誤；處于指數增長期的細胞形態和生理特性相對穩定，適合進行傳代培養，離體培養的細胞生命力比較脆弱，需要適應培養基的環境，傳代最好在細胞生長覆蓋瓶底80%～90%進行，選取②的細胞進行傳代培養比①更合理，B錯誤；對于貼壁生長的細胞進行傳代培養時，先需要用胰蛋白酶等處理，使之分散為單個細胞，然后再用離心法收集，C錯誤；細胞密度過大、營養物質減少、代謝廢物增多，都會導致細胞停止分裂而進入平臺期，D正確。]
2．(不定項)(2024·江西卷)某病毒顆粒表面有一特征性的大分子結構蛋白S(含有多個不同的抗原決定基，每一個抗原決定基能夠刺激機體產生一種抗體)。為了建立一種靈敏、高效檢測S蛋白的方法，研究人員采用雜交瘤技術制備了抗-S單克隆抗體(如圖)。下列說法正確的是(　　)
A．利用膠原蛋白酶處理，可分散貼壁生長的骨髓瘤細胞
B．制備的單克隆抗體A和單克隆抗體B是相同的單克隆抗體
C．用于生產單克隆抗體的雜交瘤細胞可傳代培養，但不能凍存
D．單克隆抗體A和單克隆抗體B都能夠特異性識別S蛋白
AD　[膠原蛋白酶可以催化分解細胞外的膠原蛋白，因此利用膠原蛋白酶處理，可分散貼壁生長的骨髓瘤細胞，A正確；由于S蛋白含有多個不同的抗原決定基，每一個抗原決定基能夠刺激機體產生一種抗體，單克隆抗體A和單克隆抗體B可能來自不同的雜交瘤細胞，因此制備的單克隆抗體A和單克隆抗體B不一定是相同的單克隆抗體，B錯誤；用于生產單克隆抗體的雜交瘤細胞可傳代培養，也可凍存，C錯誤；單克隆抗體A和單克隆抗體B都來自篩選出的雜交瘤細胞，因此都能夠特異性識別S蛋白上的抗原決定基，D正確。]
3．(2024·湖北卷)研究者探究不同濃度的雌激素甲對牛的卵母細胞和受精卵在體外發育的影響，實驗結果如下表所示。根據實驗數據，下列敘述錯誤的是(　　)
甲的濃度 (μg/mL) 卵母細 胞(個) 第一極體 排出(個) 成熟率 (%) 卵裂數 (個) 卵裂率 (%)
0 106 70 66.0 28 40.0
1 120 79 65.8 46 58.2
10 113 53 46.9 15 28.3
100 112 48 42.8 5 10.4
A．實驗結果說明甲抑制卵裂過程
B．甲濃度過高抑制第一極體的排出
C．添加1 μg/mL的甲可提高受精后胚胎發育能力
D．本實驗中，以第一極體的排出作為卵母細胞成熟的判斷標準
A　[由表可知，甲低濃度時促進卵裂，高濃度時抑制卵裂，A錯誤；對照組第一極體排出個數為70個，甲濃度過高(＞10 μg/mL，第一極體排出個數＜70)抑制第一極體的排出，B正確；添加1 μg/mL的甲，卵裂數和卵裂率均增大，即該條件可提高受精后胚胎發育能力，C正確；據題分析可知，作為卵母細胞成熟的判斷標準是第一極體的排出，D正確。]
判斷與填空
1．營養供應充足時，傳代培養的胚胎干細胞不會發生接觸抑制。(2023·海南卷T7) (×)
提示：營養供應充足時，傳代培養的胚胎干細胞也會發生接觸抑制。
2．甲狀旁腺激素(PTH)水平是人類多種疾病的重要診斷指標。研究者制備單克隆抗體用于快速檢測PTH，需要制備用PTH免疫的小鼠。(2023·北京卷T12) (√)
3．科學家采用體外受精技術獲得紫羚羊胚胎，并將其移植到長角羚羊體內，使后者成功妊娠并產仔，該工作有助于恢復瀕危紫羚羊的種群數量。此過程不涉及的操作有細胞核移植。(2023·廣東卷T3) (√)
4．在家畜優良品種培育過程中常涉及胚胎工程的相關技術，其中胚胎分割技術提高了移植胚胎的成活率。(2023·浙江1月卷T12) (×)
提示：胚胎分割可以獲得多個胚胎，分割次數越多，分割后胚胎成活率越小。
5．哺乳動物體外受精后的早期胚胎培養不需要額外提供營養物質。(2022·江蘇卷T4) (×)
提示：哺乳動物體外受精后的早期胚胎培養所需營養物質與體內基本相同，例如需要有糖、氨基酸、無機鹽等。
6．興趣小組開展小鼠原代神經元培養的研究，結果發現其培養的原代神經元生長緩慢，其原因不可能是實驗材料取自小鼠胚胎的腦組織。(2022·湖北卷T7) (√)
7．將骨髓瘤細胞和B淋巴細胞混合，經誘導后融合的細胞即為雜交瘤細胞。(2021·江蘇卷T11) (×)
提示：將骨髓瘤細胞和B淋巴細胞混合，經誘導融合后的細胞不都是雜交瘤細胞，還有B淋巴細胞自身融合的細胞、骨髓瘤細胞自身融合的細胞等。
8．在克隆哺乳動物過程中，通常作為核移植受體細胞的是去核的初級卵母細胞。(2020·天津卷T1) (×)
提示：在克隆哺乳動物過程中，通常選擇減數分裂Ⅱ中期的去核卵母細胞作為受體細胞，即次級卵母細胞。
9．經遺傳改造的小鼠胚胎干細胞注入囊胚，通過胚胎工程的相關技術可以獲得具有不同遺傳特性的實驗小鼠。胚胎移植前要檢查胚胎質量并在囊胚或原腸胚階段移植。(2020·山東卷T14) (×)
提示：胚胎移植通常選擇囊胚期之前的階段，如桑葚胚或囊胚階段。
10．與小鼠骨髓瘤細胞融合前，已免疫的脾細胞(含漿細胞)______________(填“需要”或“不需要”)通過原代培養擴大細胞數量；添加脂溶性物質PEG可促進細胞融合，該過程中PEG對細胞膜的作用是
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。(2023·湖北卷T22)
提示：不需要　使細胞接觸處的磷脂分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合
11．與胚胎細胞核移植技術相比，體細胞核移植技術的成功率更低，原因是______________________________________________________________________________________。(2021·湖南卷T22)
提示：動物胚胎細胞分化程度低，恢復其全能性相對容易，而動物體細胞分化程度高，恢復其全能性十分困難
動物細胞的培養及核移植
1．(2024·廣東佛山二模)卡鉑為廣譜抗腫瘤藥，通過抑制DNA復制而起效。卡鉑微溶于水，其水溶液在光下不穩定，溶液中的Cl－也會促進其分解。臨床上用5%葡萄糖溶液與卡鉑制成卡鉑試劑后注射治療，口服無效。相關實驗的設計思路如下圖，下列說法正確的是(　　)
A．本實驗的自變量是卡鉑試劑和DNA復制抑制劑的有無
B．本實驗可用生理鹽水代替5%葡萄糖溶液來配制卡鉑試劑
C．本實驗預期結果為①與④組數據接近，②與③組數據接近
D．宮頸癌細胞培養時的氣體環境是95%氧氣和5% CO2
A　[由題圖分析可知，本實驗的自變量是卡鉑試劑、DNA復制抑制劑的有無，A正確；生理鹽水中含Cl－，會促進卡鉑的分解，失去療效，因此不可用生理鹽水代替5%葡萄糖溶液來配制卡鉑試劑，B錯誤；①組不會抑制DNA的復制，④組會抑制DNA的復制，所以預期實驗結果不相近，C錯誤；宮頸癌細胞培養時的氣體環境是95%空氣和5% CO2，D錯誤。]
2．(2024·吉林松原聯考)種間體細胞核移植(iSCNT)將供體動物體細胞與來自不同種、科、目或綱的家畜(馴養動物)的去核卵母細胞融合并激活，以獲得較多的重構胚，進而獲得動物個體，是體細胞核移植(SCNT)中極具潛力的研究方向之一。由于多種野生動物數量稀少且呈持續下降趨勢，因此采集精子或卵子開展常規輔助生殖較為困難，甚至無法完成，而從活體或死后不久的野生動物體內采集體細胞利用iSCNT技術獲得動物個體，可在一定程度上維持瀕危動物數量。下列敘述正確的是(　　)
A．iSCNT技術必須通過顯微操作技術將供體細胞的細胞核取出，然后注入去核的卵母細胞
B．若從野生動物體內采集到的體細胞數目較少，可先用添加動物血清的固體培養基進行培養
C．iSCNT技術的原理是動物細胞核具有全能性，操作過程中可用Ca2+激活重構胚
D．同一野生動物經iSCNT技術獲得的多個重構胚中，遺傳物質可能不完全相同
D　[據題分析可知，iSCNT技術可以通過顯微操作技術將供體細胞注入去核的卵母細胞，A錯誤；若從野生動物體內采集到的體細胞數目較少，可先用添加動物血清的液體培養基進行培養，以增加體細胞的數目，B錯誤；iSCNT技術的原理是動物細胞核具有全能性，操作過程中可用Ca2+載體激活重構胚，C錯誤；在種間體細胞核移植過程中，去核的卵母細胞來自不同種、科、目或綱的家畜(馴養動物)，獲得的重構胚的細胞質遺傳物質可能不同，因此同一野生動物經iSCNT技術獲得的多個重構胚中，遺傳物質可能不完全相同，D正確。]
動物細胞融合及單克隆抗體
3．(2024·河北衡水二模)科研人員研發出單克隆抗體—肺癌藥物偶聯物，以減少肺癌藥物對正常細胞的傷害，基本流程如下。下列相關敘述正確的是(　　)
A．注射的特定抗原是正常肺細胞和肺癌細胞共有的大分子
B．抗體—肺癌藥物偶聯物中a代表肺癌藥物，b代表抗體
C．經②③最終得到的雜交瘤細胞只能產生針對肺癌細胞的抗體
D．抗體—肺癌藥物偶聯物只能定向運輸至肺癌細胞，將其殺傷
C　[根據題意可知，科研人員研發出單克隆抗體—肺癌藥物偶聯物，以減少肺癌藥物對正常細胞的傷害，據此可推測，該單抗制備過程中需要注射的特定抗原是肺癌細胞特有的大分子，A錯誤；抗體—肺癌藥物偶聯物中b代表肺癌藥物，a代表抗體，B錯誤；經②③兩次篩選最終得到的雜交瘤細胞只能產生針對肺癌細胞的抗體，而后對其進行大量體外或體內培養，獲得特定的抗體，C正確；抗體—肺癌藥物偶聯物能運輸到全身各處，但只能定向作用至肺癌細胞，將其殺傷，D錯誤。]
4．(不定項)(2024·湖南長郡中學模擬)一種抗體只能結合一種抗原。科研工作者設法獲得一種三特異性抗體，實現對小鼠多發性骨髓瘤細胞(MM)的選擇性殺傷，作用機理如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A．同時給小鼠注射3種抗原可刺激小鼠漿細胞分泌得到三特異性抗體
B．推測T淋巴細胞中也會大量表達CD38基因
C．三特異性抗體通過T細胞的活化并釋放細胞因子提高對MM的殺傷力
D．三特異性抗體與CD28和TCR結合可保持較高的T細胞數量和活性
CD　[一種漿細胞只能分泌一種抗體，A錯誤；據題意可知，三特異性抗體能實現對小鼠多發性骨髓瘤細胞(MM)的選擇性殺傷，原因是CD38基因在正常體細胞中不表達或者表達量很低，B錯誤；三特異性抗體能促進T細胞活化產生并釋放細胞因子，細胞因子會促進T淋巴細胞的活化，從而提高機體對MM的殺傷力，C正確；據圖可知，一方面三特異性抗體與T細胞膜上的CD28結合，抑制T細胞死亡，另一方面特異性抗體與T細胞膜上的TCR結合，促進T細胞活化，所以三特異性抗體與CD28和TCR結合可保持較高的T細胞數量和活性，D正確。]
胚胎工程技術及其應用
5．(2024·廣西南寧二模)目前發現的雙胞胎有同卵雙胞胎、異卵雙胞胎和“半同卵雙胞胎”。1對“半同卵小姐弟雙胞胎”形成過程如圖所示，圖中染色單體分離后分別移向細胞的三個不同方向，從而分裂成a、b、c三個細胞，染色體全部來自父系的“合子”致死。其中兩個細胞發育成姐弟二人。下列說法正確的是(　　)
A．受精卵發育為桑葚胚的過程是在透明帶內完成的，孵化后進入囊胚期階段
B．卵子在子宮內發育成熟并完成受精過程
C．若細胞a的染色體組成為MP1，則細胞b的染色體組成為MP2
D．這對雙胞胎來源于母親的染色體相同，來源于父親的染色體不一定不同
C　[囊胚期時，囊胚進一步擴大，會導致透明帶破裂，胚胎從其中伸展出來，這一過程叫作孵化，A錯誤；卵子在輸卵管內發育成熟并完成受精過程，B錯誤；來自母系的染色體為M，來自父系的染色體為P1、P2，經過復制后，染色體進行組合，若細胞a的染色體組成為MP1，細胞c的染色體均來自父親，其染色體組成為P1P2，細胞b的染色體組成為MP2，C正確；細胞a的染色體組成為MP1，細胞b的染色體組成為MP2，這對雙胞胎發育為姐弟，來源于父親的性染色體不同，D錯誤。]
6．(2024·海南海口一模)近年來由于棲息地喪失和人為捕獵，亞洲黑熊數量驟減，科學家期望通過體內受
精、胚胎移植等方法拯救亞洲黑熊，其過程如下圖。以下說法正確的是(　　)
A．胚胎工程一般采用促性腺激素釋放激素處理A使其超數排卵
B．E后代遺傳性狀與A和C一致，F后代遺傳性狀與B一致
C．D受體雌性必須和A、B同期發情處理
D．A排出的卵子必須培養成熟到MⅡ期才能與C的獲能精子受精
D　[胚胎工程一般采用促性腺激素處理A使其超數排卵，A錯誤；E后代(由A的卵細胞和C的精子體內受精形成的受精卵發育形成)遺傳物質來源于A和C，E后代遺傳性狀與A和C一致，而F后代(A的卵細胞提供細胞質，B提供細胞核)遺傳物質來源于A和B，F后代遺傳性狀大部分與B一致，少部分與A相同，B錯誤；D受體雌性接受來自動物園亞洲黑熊♀A體內的胚胎，所以必須和動物園亞洲黑熊♀A同期發情處理，而野生亞洲黑熊♀B只需要提供體細胞，所以不需要同期發情處理，C錯誤；A超數排卵排出的細胞必須培養成熟到MⅡ期才具有受精能力，因此A排出的卵子必須培養成熟到MⅡ期才能與C的獲能精子受精，D正確。]
考點3　基因工程和蛋白質工程
1．基因工程的基本工具
2．基因工程的基本操作程序
提醒：辨析農桿菌轉化法中的“兩次拼接與兩次導入”
(1)兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA中；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受體細胞的染色體DNA上。
(2)兩次導入：第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌；第二次導入是指將含目的基因的T-DNA導入受體細胞。
3．PCR
(1)PCR的原理與條件等
(2)PCR反應過程
(3)PCR過程中引物的設計
①引物設計有3條基本原則
首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體等結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。
②引物設計的注意事項
A．引物的長度一般為20～30 bp，常用的是18～27 bp，但不應大于38 bp，因為過長會導致其延伸溫度大于74 ℃，不適于耐高溫的DNA聚合酶進行反應。
b．引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3′端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3′端出現3 個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發概率增加。
c．引物序列的GC含量一般為40～60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。
d．對引物的修飾一般是在5′端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR 產物的載體的相應序列而確定。值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR，因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況下只能退而求其次，盡量去滿足條件。
4．蛋白質工程
5．DNA的粗提取與鑒定
6．DNA片段的擴增及電泳鑒定
1．(2024·山東卷)研究發現基因L能夠通過脫落酸信號途徑調控大豆的逆境響應。利用基因工程技術編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaⅠ切點處插入大豆基因L的向導DNA序列，將載體導入大豆細胞后，其轉錄產物可引導核酸酶特異性結合基因組上的目標序列并發揮作用。載體信息、目標基因L部分序列及相關結果等如圖所示。
(1)用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目標基因L時，所用的引物越短，引物特異性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上可產生的黏性末端最多有________種。載體信息如圖甲所示，經BsaⅠ酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5′-________-3′和5′-________-3′。
(2)重組載體通過農桿菌導入大豆細胞，使用抗生素________篩選到具有該抗生素抗性的植株①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點如圖乙所示，PCR產物完全酶切后的電泳結果如圖丙所示。據圖可判斷選用的限制酶是________，其中純合的突變植株是________(填序號)。
(3)實驗中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測發現其體細胞中只有1條染色體有T-DNA插入。用抗生素篩選這個植株的自交子代，其中突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例為________，篩選出的敏感植株可用于后續的品種選育。
[解析]　(1)在利用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目的基因時，所用的引物越短，則引物的特異性就越低。結合BsaⅠ識別序列可知，BsaⅠ酶切后產生的黏性末端含有4個堿基，故若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上可產生的黏性末端最多有4×4×4×4＝44種。根據圖甲所示的載體信息，經BsaⅠ酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5′-GTTT-3′和5′-CAAT-3′。(2)根據圖示信息可知，重組載體通過農桿菌導入大豆細胞當中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通過使用卡那霉素篩選到具有該抗生素抗性的植株。根據圖甲可知，目標基因L的目標序列跟突變序列之間的差異只有在SacⅠ酶切位點上存在差異，BamHⅠ和EcoRⅠ這兩個酶切位點完全相同，根據圖丙及題意可知，以題述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，并對PCR產物完全酶切后進行電泳從而判斷植株含有的是目標序列還是突變序列，因此只能選用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突變序列存在酶切位點，但是目標序列沒有，因此經過該酶酶切后突變序列的電泳條帶會出現兩個條帶，目標序列是一個條帶，根據圖丙結果可知，只有④為純合的突變植株。(3)根據題意可知，在實驗當中獲得了一株基因L成功突變的純合植株，已知該植株具有抗生素抗性，經過檢測卻發現其體細胞中只有一條染色體有T-DNA插入。根據圖示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素來篩選該植株進行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例為1/2，不含T-DNA(對抗生素敏感)的配子比例為1/2，因此突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例應該為1/2×1/2＝1/4，突變位點純合且具有抗生素抗性的植株所占比例應該為3/4，篩選出的敏感植株可用于后續的品種選育。
[答案]　(1)低　44　GTTT　CAAT　(2)卡那霉素　SacⅠ　④　(3)1/4
2．(2024·廣東卷)駒形桿菌可合成細菌纖維素(BC)并將其分泌到胞外組裝成膜。作為一種性能優異的生物材料，BC膜應用廣泛。研究者設計了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表達載體，將其轉入駒形桿菌后構建出一株能合成BC膜并可實現光控染色的工程菌株，為新型紡織原料的綠色制造及印染工藝升級提供了新思路(圖一)。
回答下列問題：
(1)研究者優化了培養基的____________(答兩點)等營養條件，并控制環境條件，大規模培養工程菌株后可在氣液界面處獲得BC菌膜(菌體和 BC膜的復合物)。
(2)研究者利用T7 噬菌體來源的RNA聚合酶(T7RNAP)及藍光光敏蛋白標簽，構建了一種可被藍光調控的基因表達載體(光控原理見圖二a，載體的部分結構見圖二b)。構建載體時，選用了通用型啟動子 PBAD(被工程菌 RNA 聚合酶識別)和特異型啟動子PT7(僅被T7RNAP識別)。為實現藍光控制染色，啟動子①②及③依次為________________，理由是__________________________________
____________________________________________________________________。
(3)光控表達載體攜帶大觀霉素(抗生素)抗性基因。長時間培養時在培養液中加入大觀霉素，其作用為_________________________________________________
____________________________________________________________________(答兩點)。
(4)根據預設的圖案用藍光照射已長出的BC菌膜并繼續培養一段時間，隨后將其轉至染色池處理，發現只有經藍光照射的區域被染成黑色，其原因是
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(5)有企業希望生產其他顏色圖案的BC膜。按照上述菌株的構建模式提出一個簡單思路：__________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析]　(1)培養基的營養物質包括水、無機鹽、碳源、氮源等，研究者培養工程菌，需要優化培養基的碳源、氮源等營養條件，并控制環境條件。(2)題圖二a分析可知，藍光照射下，T7RNAP N端-nMag與pMag-T7RNAP C端結合，導致無活性的T7RNAP變成有活性的T7RNAP，結合圖一，藍光處理后，RNA聚合酶(T7RNAP)識別啟動子①使基因1轉錄獲得相應的mRNA，再以其為模板通過翻譯過程獲得酪氨酸酶，酪氨酸酶從而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可見基因2和3正常表達無活性產物，被藍光激活后再啟動基因1表達，綜合分析可知，為實現藍光控制染色，啟動子①②及③依次為PT7、PBAD和PBAD。(3)光控表達載體攜帶大觀霉素(抗生素)抗性基因。長時間培養時在培養液中加入大觀霉素，其作用為抑制雜菌和去除丟失質粒的菌株。(4)由(2)分析可知，細胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表達并合成黑色素，故用藍光照射已長出的BC菌膜并繼續培養一段時間，隨后將其轉至染色池處理，發現只有經藍光照射的區域被染成黑色。(5)由(2)分析可知，題干信息的設計思路最終BC膜被染成黑色，希望生產其他顏色圖案的BC膜，則需要將酪氨酸酶替換成催化其他色素合成的酶。
[答案]　(1)碳源、氮源　(2)PT7、PBAD和PBAD　基因2和3正常表達無活性產物，被藍光激活后再啟動基因1表達　(3)抑制雜菌；去除丟失質粒的菌株　(4)該處細胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表達并合成黑色素　(5)將酪氨酸酶替換成催化其他色素合成的酶
判斷與填空
1．構建重組質粒需要使用DNA連接酶。屬于DNA連接酶底物。(2023·湖北卷T22) (√)
2．關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，離心研磨液是為了加速DNA的沉淀。(2022·山東卷T13) (×)
提示：離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀。
3．采用基因工程技術調控植物激素代謝，可實現作物改良。用特異啟動子誘導表達iaaM(生長素合成基因)可獲得無子果實。(2022·江蘇卷T6) (√)
4．我國考古學家利用現代人的DNA序列設計并合成了一種類似磁鐵的“引子”，成功將極其微量的古人類DNA從提取自土壤沉積物中的多種生物的DNA中識別并分離出來，用于研究人類起源及進化。設計“引子”前不需要知道古人類的DNA序列。(2021·山東卷T4) (√)
5．某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。增加模板DNA的量可減少反應中非特異條帶的產生。(2021·湖北卷T16) (×)
提示：增加模板DNA的量可以提高反應速度，但不能有效減少反應中非特異條帶。
6．熱啟動PCR可提高擴增效率，方法之一是：先將除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后，加熱到80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增，與常規PCR相比，熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物。(2021·江蘇卷T23) (√)
7．用PCR反應擴增DA1基因，用限制性內切核酸酶對PCR產物和________進行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DA1基因可以正常表達，其上下游序列需具備__________________。(2023·廣東卷T20)
提示：運載體　啟動子和終止子
8．農桿菌侵染植物細胞時，可將外源基因遞送到植物細胞中的原因是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。(2023·海南卷T20)
提示：農桿菌細胞內含Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA轉移并整合到受體細胞染色體DNA上
9．制備重組乙肝疫苗時，需要利用重組表達載體將乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)導入酵母細胞中表達。重組表達載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是________。能識別載體中的啟動子并驅動目的基因轉錄的酶是____________________________________________________________________。
(2023·全國甲卷T38)
提示：篩選　RNA聚合酶
10．為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是___________________________________________。為使PCR產物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。(2022·山東卷T25)
提示：能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對、短單鏈核酸　5′端
11．某病人腎小管上皮細胞纖毛異常，為了分析纖毛相關基因X是否發生了變異，對基因X進行了PCR擴增與產物測序。從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至2.0 mo1/L的目的是____________。PCR擴增時，需在__________________________催化下，在引物________端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。(2022·江蘇卷T24)
提示：溶解DNA　耐高溫的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)　3′
基因工程的原理及應用
1．(2024·湖北八市聯考)HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。雞卵清蛋白是由輸卵管上皮細胞中卵清蛋白基因特異性表達后分泌至輸卵管內，參與構成雞蛋清的蛋白質。下圖是利用基因工程技術制備HA蛋白雞輸卵管生物反應器的過程。幾種可供選擇的限制酶識別序列如下，下列說法錯誤的是(　　)
A．①為逆轉錄過程，該過程需要逆轉錄酶、4種游離的脫氧核苷酸等組分
B．目的基因與雞卵清蛋白基因啟動子拼接前應先在目的基因兩端分別引入HindⅢ和EcoRⅠ的識別序列
C．利用PCR技術擴增目的基因時，復性溫度偏低、引物特異性差均可導致產物中出現部分非目標序列
D．基因表達載體導入受精雞胚的胚盤可以使用顯微注射法
B　[圖中①以禽流感病毒RNA形成目的基因DNA過程，為逆轉錄過程，需要的酶是逆轉錄酶，逆轉錄合成的是DNA，需要4種脫氧核苷酸作為原料，A正確；目的基因兩端引入BamHⅠ和EcoRⅠ的識別序列，進而使目的基因能夠與雞卵清蛋白基因啟動子、載體正確連接，構建基因表達載體，B錯誤；PCR技術擴增目的基因時，若復性溫度偏低，則可能導致引物與非目的基因序列部分配對，進而擴增出非目標序列，引物特異性差也會導致和非目的基因序列部分配對，導致產物中出現部分非目標序列，C正確；受體細胞為動物細胞時通常采用顯微注射法，因此基因表達載體導入受精雞胚的胚盤可以使用顯微注射法，D正確。]
2．(2024·山東泰安二模)為獲得轉Gata3-RFP融合基因純合小鼠，科研人員將紅色熒光蛋白基因(RFP)插入含Gata3基因的載體中，然后導入小鼠受精卵，獲得能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌、雄小鼠各一只。利用熒光蛋白活體成像系統進行檢測，發現兩者均為陽性RFP轉基因小鼠。相關限制酶識別序列及限制酶識別位點如圖甲所示，A、B、C、F、R為不同引物。
(1)在PCR反應溶液中常添加________，其作用是__________________________。在利用PCR擴增RFP編碼區序列的過程中，需要設計引物F和R，在兩個引物的________(填“3′”或“5′”)端需分別插入___________的限制酶識別序列，以使RFP基因能正確插入載體中。用于擴增RFP編碼區序列的引物需滿足的條件是________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(2)在RFP基因的擴增及重組載體的構建過程中，需要的工具酶有______________________________________。
(3)將實驗獲得的兩只雌、雄雜合子小鼠(P)進行雜交獲得F1若干，選取1～5五只小鼠，從中提取含Gata3基因的相關DNA片段，設計了引物A和C用于PCR擴增，擴增產物電泳結果如圖乙所示，則________小鼠是Gata3-RFP基因純合子小鼠；若用引物A和B進行PCR擴增，________(填“能”或“不能”)區分RFP轉基因陽性小鼠中的雜合子和純合子，原因是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)為制備大量單鏈DNA片段，研究人員常采用不對稱PCR技術。其基本原理是采用不等量的一對引物，經若干次循環后，低濃度的引物(限制性引物)被消耗盡，以后的循環只產生高濃度引物(非限制性引物)的延伸產物，結果獲得大量單鏈DNA(ss-DNA)。若反應體系中原有100個模板DNA，最初10個循環后限制性引物耗盡，再進行20個循環，理論上可制備ss-DNA________個(用科學計數法表示)，在這30個循環中ss-DNA的產生量主要受______________________________的影響。
[解析]　(1)PCR的全稱是聚合酶鏈式反應，真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活，所以PCR反應溶液中一般要添加Mg2+，其作用是激活DNA聚合酶的活性。若要對RFP基因進行擴增，需在引物的5′端添加限制酶識別序列，因為引物對應區段也屬于調控序列，若在3′端添加限制酶識別序列，會導致限制酶的切割位點位于調控序列內部，進行相應酶切時，調控序列會被破壞。RFP基因的終止子在右側(即轉錄方向為從左到右)，故插入的調控序列應顛倒進行插入，即設計時：R引物末端插入對應下方載體的MunⅠ酶切位點，F引物末端插入對應下方載體的XhoⅠ酶切位點，又因為RFP基因中含有的XhoⅠ和MunⅠ酶切位點，因此不能用XhoⅠ和MunⅠ酶來切割，否則會破壞基因序列。結合題干中所給的5種限制酶的識別序列，XhoⅠ和SalⅠ互為同尾酶(即切割不同的DNA片段但產生相同的黏性末端的一類限制性內切酶)；MunⅠ和EcoRⅠ互為同尾酶。因此可通過使用同尾酶進行替代，即剪切擴增產物時，F末端添加的序列所對應的限制酶應選擇SalⅠ，這樣可以與下方載體中XhoⅠ的酶切位點結合；同理R末端應選用與MunⅠ同尾的EcoRⅠ剪切。這樣利用產生相同黏性末端的同尾酶對擴增產物和載體進行酶切，可以保證既能得到有效片段，又能使之正確轉錄。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，由于擴增目的基因時有兩條模板鏈，設計引物時，兩種引物要分別與兩條模板鏈3′端的堿基序列互補。(2)在RFP基因的擴增及重組載體的構建過程中，需要限制酶，且載體構建過程中用到DNA擴增技術，所以還需要Taq DNA聚合酶，載體構建完成還需要DNA連接酶將DNA片段連接起來。(3)Gata3-RFP基因為大片段，故結合圖乙可知1和5小鼠是Gata3-RFP基因純合子小鼠。由圖乙可知，RFP轉基因陽性小鼠中的雜合子和純合子兩種陽性小鼠提取的相關DNA片段擴增產物的電泳結果均只有一條條帶，故用引物A和B進行PCR擴增，不能區分RFP轉基因陽性小鼠中的雜合子和純合子。(4)100個模板DNA，最初10個循環后限制性引物耗盡，再進行20個循環，理論上可制備ss-DNA：100×20×210＝2.048×106。根據題干“經若干次循環后，低濃度的引物(限制性引物)被消耗盡，以后的循環只產生高濃度引物(非限制性引物)的延伸產物”可知，該過程中ss-DNA的產生量主要受限制性引物和非限制性引物比例的影響。
[答案]　(1)Mg2+　激活DNA聚合酶的活性　5′　SalⅠ、EcoRⅠ　分別與兩條模板鏈(RFP編碼區序列)3′端的堿基序列互補　(2)Taq DNA聚合酶、DNA連接酶、限制酶　(3)1和5　不能　兩種陽性小鼠提取的相關DNA片段擴增產物的電泳結果均只有一條條帶　(4)2.048×106　限制性引物和非限制性引物比例
DNA片段的擴增及電泳鑒定
3．(2024·湖北武漢二模)油菜的綠葉對黃化葉為顯性。與綠葉基因相比，黃化葉基因有一個堿基對發生了改變，從而出現一個限制酶B的酶切位點。為鑒定某綠葉油菜的基因型，提取其DNA進行了PCR和電泳。下列敘述正確的是(　　)
A．需設計能與目的基因結合的雙鏈DNA作為PCR引物
B．應在PCR擴增體系中添加Mg2+，以激活DNA聚合酶
C．可適當降低復性的溫度，以減少PCR中非特異性條帶的產生
D．用酶B作用后進行電泳，若有2條電泳條帶可判斷為雜合子
B　[PCR引物一般是單鏈DNA，A錯誤；PCR過程中用到了緩沖液，緩沖液中一般要添加Mg2+用于激活DNA聚合酶，B正確；復性溫度過低會增加PCR中非特異性條帶，C錯誤；用酶B作用后進行電泳，得到2條條帶，據此無法判斷是否為雜合子，D錯誤。]
4．(2024·廣東梅州二模)光敏色素基因在調節作物生長發育中具有重要作用。為探討玉米中光敏色素基因A(含大約256個堿基對)在棉花種質資源創制中的利用價值，研究人員將光敏色素基因A轉入棉花中，對棉花受體細胞進行檢測，并通過電泳技術分析結果。該過程所用質粒與含光敏色素基因的DNA上相關限制酶的酶切位點分別如圖甲、乙所示，電泳檢測結果如圖丙。下列相關敘述正確的是(　　)
A．為構建正確連接的表達載體，應選用BamHⅠ和HindⅢ這兩種限制酶
B．PCR擴增目的基因過程中每次循環都要經歷一次升溫和兩次降溫
C．表達載體導入受體細胞后，可用含四環素的選擇培養基進行初步篩選
D．由圖丙電泳結果可知，1、2、3、4號轉基因棉花均培育成功
C　[由圖分析可知，構建基因表達載體時，應選用BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶，A錯誤；PCR反應過程中每次循環都要經歷目的各不相同的兩次升溫(第一次使目的基因變性，第二次使目的基因延伸)和一次降溫(使目的基因復性)，B錯誤；在構建基因表達載體的過程中，卡那霉素抗性基因被破壞，而四環素抗性基因在目的基因表達載體中存在，因此，在表達載體導入受體細胞后，可用含四環素的選擇培養基進行初步篩選，C正確；光敏色素基因A含大約256個堿基對，由圖丙電泳結果可知，1、2、3、4號均成功導入光敏色素基因A，但轉基因棉花是否培育成功還需要進行生物個體水平上的鑒定，D錯誤。]
DNA的粗提取及鑒定實驗
5．(2024·山東青島一模)“DNA的粗提取與鑒定”的實驗步驟：研磨→去雜質→析出→鑒定。某研究小組欲探究不同的去雜質方法對實驗結果的影響，實驗結果如下表所示。下列說法錯誤的是(　　)
去雜質方式 沉淀質量/g DNA濃度/(ng/μL) OD260/OD280 二苯胺鑒定
離心 0.068 81.5 1.53 藍色
4 ℃冰箱靜置 0.102 8 336.4 1.41
注：OD260與OD280的比值可檢查DNA純度。純DNA的OD260/OD280為1.8，當存在蛋白質污染時，這一比值會明顯降低。
A．豬肝和菜花均可作為提取DNA的材料
B．對研磨液進行離心是為了加速DNA的沉淀
C．離心法可以獲得更高純度的DNA
D．析出時的離心轉速明顯高于去雜質時的離心轉速
B　[DNA的粗提取與鑒定實驗中，應選擇富含DNA的材料，豬肝和菜花均可作為提取DNA的材料，A正確；離心研磨液的目的是加速沉淀，離心能夠加速細胞膜、細胞器、一些較大雜質的沉淀，離心法可以獲得更高純度的DNA，B錯誤，C正確；析出時的離心轉速明顯高于去雜質時的離心轉速，D正確。]
蛋白質工程及應用
6．(2024·天津和平區二模)人工接種純種毛霉生產的腐乳滋味平淡、香氣不佳，研究人員欲從自然發酵的傳統腐乳中篩選出新的毛霉菌株改良腐乳風味。他們想通過改造M4菌株形成新的單菌株毛霉發酵工藝，下圖為M4菌株改造的基本思路。關于圖中M4菌株改造的基本思路，下列說法錯誤的是(　　)
A．預期的A指活力更高的蛋白酶或脂肪酶
B．獲得A的基本策略是定點突變
C．獲取目的基因時可采用PCR技術
D．預期產品一定具備預期的蛋白質功能
D　[腐乳制作的原理主要是利用毛霉等微生物產生的蛋白酶、脂肪酶的催化作用，蛋白質最終被水解為氨基酸，脂肪被水解為甘油和脂肪酸，故預期的A指活力更高的蛋白酶或脂肪酶，A正確；根據應有的氨基酸序列，推測基因的堿基序列，進而可通過定點突變獲取目的基因，B正確；獲取目的基因時可采用PCR技術，該技術是體外擴增目的基因的技術，可實現短時間獲得大量目的基因，C正確；理論上預期產品應該具備預期的蛋白質功能，但在實際操作過程中可能存在技術上或者其他方面的問題，可能導致獲得的蛋白質沒有相應的功能，D錯誤。]
課后限時集訓(十三)　細胞工程和基因工程
(建議用時：30分鐘)
一、選擇題
1．(2024·甘肅卷)蘭州百合栽培過程中易受病毒侵染，造成品質退化。某研究小組嘗試通過組織培養技術獲得脫毒苗，操作流程如下圖。下列敘述正確的是(　　)
A．①為脫分化過程，1號培養基中的愈傷組織是排列規則的薄壁組織團塊
B．②為再分化過程，愈傷組織細胞分化時可能會發生基因突變或基因重組
C．3號培養基用于誘導生根，其細胞分裂素濃度與生長素濃度的比值大于1
D．百合分生區附近的病毒極少，甚至無病毒，可以作為該研究中的外植體
D　[在脫分化過程中，1號培養基中的愈傷組織是排列不規則的薄壁組織團塊，A錯誤；愈傷組織細胞分化時可能會發生基因突變，但基因重組發生在減數分裂過程中，而愈傷組織細胞的分化過程是有絲分裂，所以不會發生基因重組，B錯誤；3號培養基用于誘導生根，其細胞分裂素濃度與生長素濃度的比值應該小于1，C錯誤；百合分生區附近的病毒極少，甚至無病毒，因此可以作為該研究中的外植體，D正確。]
2．(2024·湖北武漢模擬預測)青霉菌(屬真菌)發酵為高耗氧過程，透明顫菌(屬細菌)可通過在低氧條件下高表達血紅蛋白以促進氧氣供應和增強細胞呼吸。下圖為將透明顫菌的血紅蛋白引入青霉菌的方案。下列說法錯誤的是(　　)
A．處理①、②中都可以用溶菌酶去除細胞壁
B．處理③可用電融合法或者聚乙二醇融合法
C．處理④需將融合細胞接種在缺乏甲硫氨酸和精氨酸的培養基上
D．為驗證方案是否成功可在低氧條件下培養雜種菌株并檢測其密度
A　[透明顫菌屬于細菌，細胞壁的成分主要是肽聚糖，可用溶菌酶去除細胞壁，但青霉菌是真菌，細胞壁成分主要是幾丁質，不能用溶菌酶去除細胞壁，A錯誤；處理③可用物理法電融合法或化學法聚乙二醇等誘導融合，B正確；處理④在缺乏甲硫氨酸和精氨酸的培養基培養融合細胞，能夠生長的即為雜種菌株，C正確；青霉菌(屬真菌)發酵為高耗氧過程，透明顫菌(屬細菌)可通過在低氧條件下高表達血紅蛋白以促進氧氣供應和增強細胞呼吸，為驗證方案是否成功可在低氧條件下培養雜種菌株并檢測其密度，D正確。]
3．(2024·福建福州模擬)植物體細胞通常被誘導為愈傷組織后才能表現全能性。研究發現，愈傷組織的中層細胞是根或芽再生的源頭干細胞，其在不同條件下，通過基因的特異性表達調控生長素、細胞分裂素的作用，表現出不同的效應(見下表)。已知生長素的生理作用大于細胞分裂素時有利于根的再生；反之，有利于芽的再生。下列推論合理的是(　　)
條件 基因表達產物和相互作用 效應
① WOX5 維持未分化狀態
② WOX5＋PLT 誘導出根
③ WOX5＋ARR2，抑制ARR5 誘導出芽
A．WOX5失活后，中層細胞會維持干細胞特性
B．WOX5＋PLT可能有利于愈傷組織中生長素的積累
C．ARR5促進細胞分裂素積累或提高細胞對細胞分裂素的敏感性
D．體細胞中生長素和細胞分裂素具有協同作用
B　[根據表格信息可知，WOX5能維持未分化狀態，使植物細胞保持分裂能力強、較高的全能性，若WOX5失活后，中層細胞會喪失干細胞分裂能力強、分化程度低的特性，A錯誤；由題干信息“生長素的生理作用大于細胞分裂素時有利于根的再生”，再結合表格信息，WOX5＋PLT可能誘導出根，可推測WOX5＋PLT可能有利于愈傷組織中生長素的積累，B正確；由題意可知，生長素的生理作用小于細胞分裂素時有利于芽的再生，而抑制ARR5能誘導出芽，可知ARR5被抑制時細胞分裂素較多，故可推測ARR5抑制細胞分裂素積累或降低細胞對細胞分裂素的敏感性，C錯誤；出芽或出根都是生長素與細胞分裂素含量不均衡時才會發生，故可推測體細胞中生長素和細胞分裂素的作用可能相互抑制，D錯誤。]
4．(2024·山東聊城二模)灌流式培養是在細胞培養管內，一邊不斷注入新鮮培養基，一邊將培養液的上清液不斷移出。區別傳統的懸浮培養，灌流式培養可避免因細胞密度過大、有害代謝物積累等因素而使細胞分裂受阻的現象出現。下列敘述正確的是(　　)
A．灌流式培養的細胞會貼壁生長，但不會出現接觸抑制的現象
B．灌流是在細胞密度達到一定濃度或者營養物質低于一定濃度時進行的
C．灌流速率越高，營養物質利用越充分
D．向培養管注入的新鮮培養基中補充動物血清是為了防止雜菌污染
B　[據題分析可知，灌流式培養的動物細胞可以避免出現貼壁生長的現象，A錯誤；灌流是在細胞密度達到一定濃度或者營養物質低于一定濃度時進行的，B正確；過高的灌流速率，會導致培養的細胞不能及時利用營養物質，而使營養物質不能得到充分利用，C錯誤；補充動物血清是為了提供動物細胞培養所需要的營養物質和某種生長因子，D錯誤。]
5．(2024·湖北華中師大附中模擬)慢性乙型肝炎由乙肝病毒(HBV)感染引起，HBV在患者體內持續存在且含量較高。E肽是HBV的一種外殼蛋白，可作為抗原被宿主免疫系統識別并應答。為治療和預防慢性乙肝，科研人員設計了以下方案，合理的是(　　)
A．輸入乙肝康復者的血清可治療和長期預防乙肝
B．將E蛋白重組到腺病毒基因組中可制成乙肝疫苗
C．利用單克隆抗體技術獲得的抗E蛋白抗體，可用于檢測乙肝
D．將E蛋白對應的mRNA制成疫苗，可刺激機體在血漿中表達出E蛋白
C　[乙肝康復者的血清中含有對抗乙肝病毒的抗體，因而可治療乙肝，但抗體不具有長久性，A錯誤；將E蛋白的相關基因重組到腺病毒基因組中可制成乙肝疫苗，B錯誤；利用單克隆抗體技術獲得的抗E蛋白抗體，可用于檢測乙肝病毒的存在，C正確；將E蛋白對應的mRNA制成疫苗，可進入細胞內編碼出相應的抗原蛋白，進而刺激機體產生特異性免疫反應，而E蛋白的合成過程不會發生在血漿中，D錯誤。]
6．(2024·甘肅卷)甘加藏羊是甘肅高寒牧區的優良品種，是季節性發情動物，每年產羔一次，每胎一羔，繁殖率較低。為促進畜牧業發展，研究人員通過體外受精、胚胎移植等胚胎工程技術提高藏羊的繁殖率，流程如下圖。下列敘述錯誤的是(　　)
A．藏羊甲需用促性腺激素處理使其卵巢卵泡發育和超數排卵
B．藏羊乙的獲能精子能與剛采集到的藏羊甲的卵母細胞受精
C．受體藏羊丙需和藏羊甲進行同期發情處理
D．后代丁的遺傳物質來源于藏羊甲和藏羊乙
B　[促性腺激素能作用于卵巢，藏羊甲需用促性腺激素處理使其卵巢卵泡發育和超數排卵，A正確；從卵巢中剛采集的卵母細胞需培養成熟(減數分裂Ⅱ中期)后才可與獲能的精子進行體外受精，B錯誤；在胚胎移植前要對接受胚胎的受體和供體進行同期發情處理，使受體的生理狀況相同，因此受體藏羊丙需和藏羊甲進行同期發情處理，C正確；后代丁是由藏羊甲的卵細胞和藏羊乙的精子結合形成的受精卵發育而來，因此后代丁的遺傳物質來源于藏羊甲和藏羊乙，D正確。]
7．(2024·湖南卷)某同學將質粒DNA進行限制酶酶切時，發現DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是(　　)
A．限制酶失活，更換新的限制酶
B．酶切條件不合適，調整反應條件如溫度和酶的用量等
C．質粒DNA突變導致酶識別位點缺失，更換正常質粒DNA
D．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶
B　[限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應更換新的限制酶，A正確；酶切條件不合適通常會使切割效果下降，調整反應條件如溫度和pH等，調整酶的用量沒有作用，B錯誤；質粒DNA突變會導致限制酶識別位點缺失，進而造成限制酶無法進行切割，此時應更換為正常質粒，C正確；質粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。]
8．(2024·廣東汕頭二模)當水稻處于高Na＋環境時，細胞膜上的轉運蛋白SOS1可借助膜兩側的H＋濃度梯度將Na＋排到細胞外。某研究團隊擬構建SOS1基因和綠色熒光蛋白基因(GFP)的融合基因轉入水稻基因組，以期增強水稻的抗鹽能力。下列敘述錯誤的是(　　)
A．水稻通過轉運蛋白SOS1以主動運輸的方式將Na＋運輸到細胞外
B．將SOS1基因插入表達載體中不可選用限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ
C．檢測GFP基因是否以正確方向連接到質粒可用引物F1和R2進行擴增
D．檢測F2和R2的擴增結果能確定水稻是否為SOS1-GFP基因的純合子
D　[由題意可知，當水稻處于高Na＋環境時，細胞膜上的轉運蛋白SOS1可借助膜兩側的H＋濃度梯度以主動運輸的方式將Na＋排到細胞外，A正確；SOS1基因含有限制酶BamHⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ的酶切位點，所以將SOS1基因插入表達載體中不可選用限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ，B正確；檢測GFP基因是否以正確方向連接到質粒可用引物F1和R2進行擴增，C正確；F2和R2為綠色熒光蛋白基因(GFP)的引物，無法檢測到是否含有SOS1基因，D錯誤。]
9．(2024·江西卷)γ-氨基丁酸在醫藥等領域有重要的應用價值。利用L-谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脫羧是高效生產γ-氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導入生產菌株E.coliA。構建了以L-谷氨酸鈉為底物高效生產γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列敘述正確的是(　　)
A．上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB
B．E.coliB發酵生產γ-氨基丁酸時，L-谷氨酸鈉的作用是供能
C．E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質粒
A　[題意顯示，研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導入生產菌株E.coliA，說明可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB，A正確；題意顯示，用L-谷氨酸脫羧酶(gadB)催化L-谷氨酸脫羧是高效生產γ-氨基丁酸的重要途徑之一，E.coliB中能表達L-谷氨酸脫羧酶(gadB)，因此可用E.coliB發酵生產γ-氨基丁酸，該過程中L-谷氨酸鈉是反應原料，而非起供能作用，B錯誤；將目的基因(gadB)導入菌株E.coliA構建高效生產γ-氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ-氨基丁酸，C錯誤；據題中信息無法推斷出是否有其他酶能夠替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質粒，D錯誤。]
10．(2024·湖北武漢二模)水中E物質污染會導致魚類雌性化異常。將綠色熒光蛋白(GFP)基因、Ga14蛋白基因等轉入斑馬魚，可用于監測水體E物質，下圖中ERE和UAS是兩種誘導型啟動子，分別被E物質—受體復合物和Ga14蛋白特異性激活，啟動下游基因表達。下列敘述錯誤的是(　　)
A．斑馬魚的某些細胞存在E物質的受體
B．ERE直接驅動了GFP基因的表達
C．用于監測E物質污染的轉基因斑馬魚最好是不育的
D．基因表達載體最好以顯微注射法導入斑馬魚受精卵
B　[將綠色熒光蛋白(GFP)基因、Ga14蛋白基因等轉入斑馬魚，可用于監測水體 E 物質，推測斑馬魚的某些細胞存在 E 物質的受體，A正確；結合題圖，ERE誘導Ga14基因轉錄，其翻譯產物Ga14蛋白與USA結合驅動了GFP基因的表達，這是一個間接驅動而非直接驅動的過程，B錯誤；用于監測 E 物質污染的轉基因斑馬魚最好是不育的，避免因有性生殖帶來的基因污染，C正確；基因表達載體最好以顯微注射法導入斑馬魚受精卵，受精卵全能性高，基因成功表達的概率大，D正確。]
11．(不定項)(2024·湖南岳陽模擬)東南景天中的HMA3基因能編碼Cd(鎘)轉運蛋白，Cd轉運蛋白能將土壤中的Cd吸收進體內，現欲將東南景天中的HMA3基因轉入欒樹，以增強欒樹對Cd的富集能力，從而有效治理Cd污染，科研人員利用下圖結構構建重組DNA，圖1為HMA3基因所在DNA示意圖，圖2為質粒結構示意圖，下列敘述錯誤的是(　　)
A．欲獲取HMA3基因，可用引物1、引物2進行PCR循環至少2輪獲得
B．用凝膠電泳鑒定PCR產物，引物1、引物2擴增的產物可得3條條帶
C．構建含HMA3和GFP基因的重組質粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的識別序列
D．用含潮霉素的培養基篩選受體細胞，能生長的為含重組質粒的受體細胞
ABD　[由于引物接在了目的基因的兩側，因此經過兩輪PCR后，可獲得與HMA3基因等長的DNA單鏈，故若要獲取HMA3基因，可用引物1、引物2進行PCR循環至少3輪獲得，A錯誤；用凝膠電泳鑒定PCR產物，引物1、引物2擴增的產物可能會得到引物帶、引物二聚體帶、目的擴增產物帶和非目的擴增產物帶等多條不同的條帶，B錯誤；構建含HMA3和GFP基因的重組質粒時，需要有啟動子和終止子序列，又不破壞GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的識別序列，C正確；質粒上含有潮霉素抗性基因，用含潮霉素的培養基篩選受體細胞，能生長的為含重組質粒或含普通質粒的受體細胞，D錯誤。]
12．(不定項)(2024·山東濰坊三模)CRISPR/Cas9基因編輯技術根據靶基因序列設計向導sgRNA，精確引導核酸酶Cas9切割與sgRNA配對的DNA，相關酶在修復斷裂DNA的過程中會改變連接部位的堿基序列。科研人員通過刪除編碼PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白質的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如圖1所示。將體外轉錄獲得的Cas9mRNA和sgRNA導入小鼠的受精卵中，獲得了12只基因編輯小鼠。利用PCR鑒定小鼠的基因型，電泳結果如圖2所示。已知P1和P2是PCR的引物。下列相關分析錯誤的是(　　)
A．敲除2、3、4片段引起的變異屬于染色體變異
B．敲除前，根據敲除的位置需要設計3個sgRNA
C．圖2中，4和12個體雜交的子代均為敲除純合子
D．圖2中，3、5、7個體的體內均能檢測到PD-1
ABD　[據圖分析，將野生型基因內部的部分堿基剪切，改變的是基因內部的堿基序列，屬于可遺傳變異中的基因突變，A錯誤；分析圖1可知，要將基因的2、3、4共3個片段切除，需要設計2個sgRNA，B錯誤；基因敲除后，其核苷酸數量減少，電泳時移動速度快，距離加樣孔的位置遠，4和12個體均為基因敲除純合子，因此4和12個體雜交的子代均為基因敲除純合子，C正確；3個體的基因未敲除，5個體為基因敲除雜合子，7個體為基因敲除純合子，因此3和5體內均能檢測到PD-1，7個體檢測不到PD-1，D錯誤。]
二、非選擇題
13．(2024·廣東廣州二模)癌癥的免疫療法通過重新激活抗腫瘤的免疫細胞，克服腫瘤的免疫逃逸，科研人員在不斷研究中發現多種免疫治療方法的結合是提高治療效果的途徑之一。請回答下列問題：
(1)免疫系統能夠識別和清除突變的細胞，這體現了免疫系統的________功能。
(2)由于基因突變，癌細胞表面物質發生改變，如某些種類癌細胞表面高表達膜蛋白PSMA和PD-L1。圖1中PD-L1能抑制T細胞的活化，使癌細胞發生免疫逃逸。臨床上可利用PD-1的單克隆抗體進行癌癥治療，據圖1推測，其原因是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)CD28是T細胞表面受體，T細胞的有效激活依賴于CD28在癌細胞與T細胞結合部位的聚集。因此，科研人員嘗試構建既能結合PSMA，又能結合CD28的雙特異性抗體PSMA×CD28，誘導T細胞定向殺傷癌細胞，如圖2所示。
制備過程：先將________________分別注射到小鼠體內，分離出B淋巴細胞，誘導其與小鼠的骨髓瘤細胞融合，篩選得到________________，再誘導兩種細胞融合。成功融合的細胞會表達兩種L鏈和兩種H鏈，由于________________會產生多種抗體，因此還需進行篩選，才能獲得所需的雙特異性抗體PSMA×CD28。
(4)科研人員將癌細胞和T細胞共同培養，加入不同抗體，比較不同抗體對T細胞活化的作用。實驗各組由活化T細胞產生的細胞因子IL-2含量如圖3所示，實驗結果說明________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析]　(1)免疫系統能夠識別和清除突變的細胞，這體現了免疫系統的免疫監視功能。(2)圖1中癌細胞表面的PD-L1和T細胞表面的PD-1結合，抑制T細胞的活化。PD-1的單克隆抗體與PD-1特異性結合，阻斷了PD-L1和PD-1的結合，避免PD-L1抑制T細胞的活化。(3)制備雙特異性抗體PSMA×CD28，則抗原是CD28和PSMA，將兩種物質分別注射到小鼠體內，分離出兩類B淋巴細胞，將這兩類B淋巴細胞分別和小鼠的骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞，再誘導雜交瘤細胞融合。成功融合的細胞會表達兩種L鏈和兩種H鏈，所需的雙特異性抗體PSMA×CD28是特定的L鏈和H鏈結合形成的，由于L鏈和H鏈隨機組合，因此還需要進行篩選，才能獲得所需的抗體。(4)自變量是抗體種類，分析圖3可知，PSMA×CD28和PD-1單抗聯合使用能夠顯著激活T細胞，且在一定范圍內激活作用隨抗體濃度的增加而增強；單獨使用PSMA×CD28或PD-1單抗都不能顯著激活T細胞。
[答案]　(1)免疫監視　(2)PD-1的單克隆抗體與PD-1結合，阻斷了PD-1和PD-L1的結合，避免PD-L1抑制T細胞的活化　(3)PSMA、CD28　兩種雜交瘤細胞　L鏈和H鏈隨機組合　(4)PSMA×CD28和PD-1單抗聯合使用能夠顯著激活T細胞，且在一定范圍內激活作用隨抗體濃度的增加而增強；單獨使用PSMA×CD28或PD-1單抗都不能顯著激活T細胞(合理即可)
14．(2024·山東濰坊二模)A蛋白是某種激素合成的關鍵酶。為鑒定該激素合成的部位及生理作用，科研團隊利用無縫克隆技術將A蛋白結合蛋白基因(P基因)與葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合，構建A蛋白檢測探針，通過農桿菌轉化法導入擬南芥進行實驗。相關原理、過程及質粒的結構如下圖所示。
注：①bar為抗草甘膦(一種除草劑)基因，Tetr為四環素抗性基因，Ampr為氨芐青霉素抗性基因；②F1、F2、R1、R2為引物；③BamHⅠ、SmaⅠ、BclⅠ為限制酶。
(1)無縫克隆時所需的酶除T5核酸外切酶外還有____________________________。用無縫克隆技術構建GUS-P融合基因的關鍵是R2引物5′端序列與_________________互補。
(2)利用雙酶切法將融合基因插入Ti質粒，選用的限制酶為________________。擴增融合基因所需的引物R1和F2應選用下列引物組合為________。
①5′-…CTTGGATGAT-3′
②5′-…TAAGTTGTCT-3′
③5′-…ATTCAACAGA-3′
④5′-…TCTGTTGAAT-3′
(3)利用農桿菌轉化法將融合基因導入農桿菌、擬南芥細胞的過程中，需要篩選兩次，這兩次篩選分別是______________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈藍色，將轉基因擬南芥置于不同培養液中培養一段時間，然后分離不同部位的組織分別加入X-Gluc進行鑒定，結果如下表所示：
部位 根 莖 葉
完全培養液 藍色 淺藍 淺藍
缺磷培養液 深藍 藍色 淺藍
分析表明，該激素最主要的合成部位是________，通過實驗結果分析該激素的生理作用是____________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析]　(1)由題圖信息可知，利用無縫克隆技術將A蛋白結合蛋白基因(P基因)與葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合，構建A蛋白檢測探針，所以無縫克隆時所需的酶除T5核酸外切酶外還有DNA聚合酶和DNA連接酶。DNA的兩條鏈是反向平行的，用無縫克隆技術構建GUS-P融合基因的關鍵是R2引物5′端序列與F1(或P基因左側)3′端序列互補。(2)利用雙酶切法將融合基因插入Ti質粒選用的限制酶為BclⅠ和SmaⅠ。根據融合基因的放大圖可知，擴增時以DNA的兩條鏈分別作模板，擴增融合基因所需的引物R1和F2應選用下列引物組合為3′端序列可以與④5′-…TCTGTTGAAT-3′配對，5′端序列的互補鏈可以與①5′-…CTTGGATGAT-3′配對，因此選用的引物組合為①④。(3)利用農桿菌轉化法將融合基因導入農桿菌、擬南芥細胞的過程中，需要篩選兩次，這兩次篩選分別是先篩選出能在含四環素培養基上生長而不能在含氨芐青霉素培養基上生長的農桿菌，再用含草甘膦的培養基篩選出導入融合基因的擬南芥細胞。(4)葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈藍色，根據表格可知，在完全培養液中，只有根呈現藍色，說明該激素最主要的合成部位是根，與完全培養液相比，在缺磷培養液中，根的顏色變為深藍，而在含磷的完全培養液中出現藍色，說明該激素的生理作用是促進植物對磷元素的吸收。
[答案]　(1)DNA聚合酶和DNA連接酶　F1(或P基因左側)3′端序列　(2)BclⅠ和SmaⅠ　①④
(3)先篩選出能在含四環素培養基上生長而不能在含氨芐青霉素培養基上生長的農桿菌，再用含草甘膦的培養基篩選出導入融合基因的擬南芥細胞　(4)根　促進植物對磷元素的吸收
(教師用書獨具)
(2024·湖南衡陽三模)Ⅰ.復椰子樹屬棕櫚復椰子屬，樹高15～30米，樹干通直，直徑約30厘米，葉呈大扇形，長7米，寬2米，雌雄異株。復椰子樹的雌花從受粉到果實成熟需要10～13年之久，種子發芽期也需3年，而且要求烈日照曬。由于復椰子樹種子形狀奇特，體積龐大(重達20千克，直徑30厘米)有些人將它用作容器，如今復椰子樹已瀕臨滅絕。復椰子果肉煮湯飲服，有治療久咳和止血的功效。有人想到了一個好的方法，制造“人工種子”，解決復椰子樹的種子形成時間漫長的問題。其操作流程如下：
(1)圖中的外植體是_______________________，先用________沖洗，再消毒。常用的消毒劑是_____________________________(寫兩種)。
(2)人工種皮除了有保護作用以外，還要有________性，以滿足胚狀體代謝的需要。為了保證胚狀體在適宜條件下成功發芽發育成幼苗，而不會腐敗變質，人工胚乳除加入適量的養分(如水、無機鹽、有機碳源)外，還可以適當添加農藥、抗生素、有益菌等。為了促進胚狀體的生長發育，還可以向人工種皮中加入一些_________________________(填“植物激素”“植物生長調節劑”或“生長素類似物”)。
Ⅱ.科研人員構建了可表達WRK10-MYC融合蛋白的重組農桿菌 Ti質粒并成功轉化植物細胞得到轉基因植株，該質粒的部分結構如圖2所示，其中Kan為卡那霉素抗性基因，Hyg為潮霉素抗性基因，MYC標簽序列編碼標簽短肽 MYC，WRK10 蛋白為轉錄因子。
(3)位于 Ti 質粒不同位置的卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因的作用分別是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
圖中啟動子的方向與對應基因轉錄的方向一致，從編碼鏈的角度分析 P1 和 P2方向不同的原因是___________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)已知利用LP 和 RP擴增結果為大帶，BP 和 RP擴增結果為小帶。可用圖中三引物進行兩次PCR 的方法鑒定轉基因植物后代中的純合轉基因植株。T-DNA 插入植物染色體DNA分子后會抑制原插入位點兩側引物的擴增產物的出現，則純合轉基因植株 PCR 檢測結果為________(填“大帶”“大帶和小帶”或“小帶”)。
[解析]　(1)進行植物組織培養時，離體的植物器官、組織或細胞被稱為外植體。外植體消毒過程中，用酒精擦拭雙手和超凈工作臺臺面，將流水充分沖洗后的外植體用酒精消毒30 s，然后立即用無菌水清洗2～3次，再用次氯酸鈉溶液處理30 min后，立即用無菌水清洗2～3次。(2)胚狀體相當于種子中的胚，若氧氣不足，細胞無氧呼吸產生酒精，會導致人工種子壞死，故種皮除有保護作用外，還要有透氣性。人工胚乳要為胚狀體的發育提供營養物質，故要加入適量的養分(如水、無機鹽、有機碳源)；外界環境中許多微生物與胚狀體的細胞競爭營養物質，也可能寄生在胚狀體細胞中，故可以適當添加農藥、抗生素、有益菌等；植物生長調節劑是人類合成的，對植物生長、發育有重要調節作用的化學物質，具有原料廣泛、容易合成、效果穩定等優點，為了促進胚狀體的生長發育，還可以向人工種皮中加入一些植物生長調節劑。(3)構建了可表達WRK10-MYC 融合蛋白的重組農桿菌Ti質粒并成功轉化植物細胞得到轉基因植株，先構建含有重組 Ti 質粒的農桿菌，然后在讓該農桿菌去侵染植物細胞，如圖，Hyg為潮霉素抗性基因，位于T-DNA 片段上，故卡那霉素抗性基因可用于篩選成功轉化的農桿菌(或用于篩選重組農桿菌或成功導入了質粒的農桿菌)；潮霉素抗性基因可用于篩選成功轉化的植物細胞(或篩選轉基因植物細胞或成功導入了目的基因的植物細胞)。基因轉錄的方向是5′→3′，而啟動子的方向與對應基因轉錄的方向一致，故P1和P2方向不同的原因是潮霉素抗性基因的編碼鏈是 b 鏈(或Hyg基因所對應的編碼鏈是b鏈)，WRK10基因的編碼鏈是a鏈。(4)BP位點在T-DNA片段上，又T-DNA 插入植物染色體 DNA 分子后會抑制原插入位點兩側引物的擴增產物的出現，故純合轉基因植株 PCR 檢測結果為 BP 和 RP 擴增的小帶。
[答案]　(1)離體的植物器官、組織或細胞　流水　酒精和次氯酸鈉溶液　(2)透氣　植物生長調節劑　(3)卡那霉素抗性基因可用于篩選成功轉化的農桿菌(或用于篩選重組農桿菌或成功導入了質粒的農桿菌)；潮霉素抗性基因可用于篩選成功轉化的植物細胞(或篩選轉基因植物細胞或成功導入了目的基因的植物細胞)　潮霉素抗性基因的編碼鏈是b鏈(或Hyg基因所對應的編碼鏈是b鏈)，WRK10基因的編碼鏈是a鏈　(4)小帶
21世紀教育網(www.21cnjy.com)考點1　植物細胞工程
1．植物組織培養技術——原理：植物細胞的全能性
(1)植物組織培養中添加蔗糖的目的是提供營養和調節滲透壓。
(2)脫分化階段不需要光，再分化階段需要光。
(3)生長素與細胞分裂素的比值高時，促進根的分化、抑制芽的形成；比值低時，促進芽的分化、抑制根的形成。
(4)體內細胞未表現全能性的原因：在特定的時間和空間條件下，細胞中的基因會________________。
2．植物體細胞雜交技術——原理：植物細胞的全能性、細胞膜的流動性
(1)圖中過程①用____________________處理去除細胞壁，得到的原生質體包括細胞膜、細胞質和細胞核三部分。
(2)酶解去壁前用較高滲透壓溶液處理細胞：使細胞處于微弱的質壁分離狀態，有利于完整的原生質體的釋放，防止原生質體被破壞。
(3)圖中過程②的誘導方法有________、離心法、________________________、高Ca2+—高pH融合法等。
(4)原生質體融合成功的標志是________________________________。
3．植物體細胞雜交和有性雜交的比較
1．(2024·湖北卷)植物甲抗旱、抗病性強，植物乙分蘗能力強、結實性好。科研人員通過植物體細胞雜交技術培育出兼有甲、乙優良性狀的植物丙，過程如下圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
A．過程①中酶處理的時間差異，原因可能是兩種親本的細胞壁結構有差異
B．過程②中常采用滅活的仙臺病毒或PEG誘導原生質體融合
C．過程④和⑤的培養基中均需要添加生長素和細胞分裂素
D．可通過分析植物丙的染色體，來鑒定其是否為雜種植株
2．(2024·黑、吉、遼卷)迷迭香酸具有多種藥理活性。進行工廠化生產時，先誘導外植體形成愈傷組織，再進行細胞懸浮培養獲得迷迭香酸，加入誘導劑茉莉酸甲酯可大幅提高產量。下列敘述錯誤的是(　　)
A．迷迭香頂端幼嫩的莖段適合用作外植體
B．誘導愈傷組織時需加入NAA和脫落酸
C．懸浮培養時需將愈傷組織打散成單個細胞或較小的細胞團
D．茉莉酸甲酯改變了迷迭香次生代謝物的合成速率
判斷與填空
1．研究者通過體細胞雜交技術，探索利用條斑紫菜和擬線紫菜培育雜種紫菜。從食用紫菜的動物消化道內提取蛋白酶，用于去除細胞壁。(2023·江蘇卷T13) (　　)
2．利用植物細胞培養技術在離體條件下對單個細胞或細胞團進行培養使其增殖，可獲得植物細胞的某些次生代謝物。次生代謝物是植物所必需的，但含量少，應選擇產量高的細胞進行培養。(2023·山東卷T14) (　　)
3．人參皂苷是人參的主要活性成分。科研人員分別誘導人參根與胡蘿卜根產生愈傷組織并進行細胞融合，以提高人參皂苷的產率。高Ca2+—高pH溶液可促進細胞融合。(2023·廣東卷T12) (　　)
4．在藍莓組織培養過程中，宜選用藍莓成熟葉片為材料制備外植體。(2022·遼寧卷T14) (　　)
5．植物組織培養技術常用于商業化生產：其過程一般為：無菌培養物的建立→培養物增殖→生根培養→試管苗移栽及鑒定。提高培養基中生長素與細胞分裂素的比值，有利于誘導生根。(2021·江蘇卷T5) (　　)
6．植物細胞合成的賴氨酸達到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關鍵酶的活性，導致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調節方式屬于__________。根據這種調節方式，在培養基中添加______________________，用于篩選經人工誘變的植物懸浮細胞，可得到抗賴氨酸類似物的細胞突變體，通過培養獲得再生植株。(2023·浙江6月卷T23)
7．利用帶側芽的莖段獲得叢狀苗的過程與利用莖段誘導產生愈傷組織再獲得叢狀苗的過程相比，前者總培養時間________，且不經歷__________過程，因而其遺傳性狀穩定，是大多數植物快速繁殖的常用方法。(2020·浙江7月卷T29)
8．植物組織培養技術可與基因工程技術相結合獲得轉基因植株。將含有目的基因的細胞培養成一個完整植株的基本程序是____________________________
_____________________________________________________________________(用流程圖表示)。(2019·全國Ⅱ卷T38)
植物細胞工程的基本技術
1．(2024·廣東茂名三模)轉錄因子Gh1和GhE1能調控棉花愈傷組織細胞的生長發育，參與體細胞胚胎發生過程中細胞命運的重塑，其機制如圖所示。下列相關分析正確的是(　　)
A．將愈傷組織細胞在脫分化培養基上繼續培養可得到幼苗
B．Gh1基因發生甲基化可能會抑制愈傷組織細胞的增殖
C．促進GhE1基因的表達可促進愈傷組織分化成根等器官
D．Gh1與GhE1單獨作用均能調控GhPs基因的表達
2．(2024·湖南衡陽模擬)現有甲、乙兩個煙草品種(2n＝48)，其基因型分別為aaBB和AAbb，A/a、B/b這兩對基因位于非同源染色體上。在光強度大于800 lx時，甲、乙兩種煙草都不能生長，這是它們中各自存在的一對隱性純合基因(aa或bb)作用的結果。取甲、乙兩煙草品種的花粉分別培養成植株，將它們的葉肉細胞制成原生質體并混合，然后使之融合，誘導產生細胞團。隨后將誘導產生的細胞團放到光強度大于800 lx的光下培養，結果有的細胞團不能分化，有的能分化發育成植株。如果只考慮原生質體的兩兩融合，下列敘述正確的是(　　)
A．過程①是在無菌水中進行，需要纖維素酶和果膠酶
B．過程②是在固體培養基中進行，可用滅活的病毒誘導
C．過程③培養基中通常添加蔗糖作碳源和能源
D．能分化的細胞團發育成的植株自交，后代在光強度大于800 lx的光下，能生長的植株占7/16
植物體細胞工程的應用
3．(2024·湖南長沙二模)紅豆杉(2n＝24)能產生具有高抗癌活性的紫杉醇，柴胡(2n＝12)生長迅速。紅豆杉—柴胡是通過植物細胞工程培育的一種既能產生紫杉醇，又能迅速生長的雜交植株。部分培育過程如圖所示。下列有關敘述正確的是(　　)
A．獲得原生質體的過程需要用纖維素酶和胰蛋白酶去除細胞壁
B．過程①可用高Ca2+—高pH融合法誘導，利用了細胞膜的流動性
C．過程②的培養基中需添加適量的生長素類和赤霉素類植物生長調節劑
D．紅豆杉—柴胡雜種植株是二倍體，能夠產生可育配子
4．(2024·山東淄博二模)鐵皮石斛是名貴中藥，其有效成分生物堿為細胞的次生代謝物。研究人員將鐵皮石斛的營養芽采用組織培養技術培養成擬原球莖(PLBs，類似愈傷組織)，培養過程中PLBs重量、生物堿含量的變化如圖。下列說法錯誤的是(　　)
A．在培養前應對營養芽進行消毒，在火焰旁進行接種操作可減少污染
B．因新生營養芽的細胞分化程度低，作外植體培養時容易誘導形成PLBs
C．誘導營養芽形成PLBs的過程稱為細胞的脫分化，生物堿為該過程提供營養
D．與黑暗條件相比，PLBs在光照條件下的生長起始時間早、快速生長時間長
考點2　動物細胞工程和胚胎工程
1．動物細胞培養
(1)動物細胞培養中兩次使用胰蛋白酶的作用不同：
第一次：處理剪碎的組織，使其分散成單個細胞；
第二次：使貼壁生長的細胞從瓶壁上脫落下來。
(2)區分原代培養和傳代培養的關鍵是：是否分瓶培養。
2．克隆動物培育的流程
3．胚胎早期發育過程
4．胚胎移植的生理學基礎
5．“試管羊”“克隆羊”和“轉基因羊”的產生過程比較
1．(2024·黑、吉、遼卷)從小鼠胚胎中分離獲取胚胎成纖維細胞進行貼壁培養，在傳代后的不同時間點檢測細胞數目，結果如圖。下列敘述正確的是(　　)
A．傳代培養時，培養皿需密封防止污染
B．選取①的細胞進行傳代培養比②更合理
C．直接用離心法收集細胞進行傳代培養
D．細胞增長進入平臺期可能與細胞密度過大有關
2．(不定項)(2024·江西卷)某病毒顆粒表面有一特征性的大分子結構蛋白S(含有多個不同的抗原決定基，每一個抗原決定基能夠刺激機體產生一種抗體)。為了建立一種靈敏、高效檢測S蛋白的方法，研究人員采用雜交瘤技術制備了抗-S單克隆抗體(如圖)。下列說法正確的是(　　)
A．利用膠原蛋白酶處理，可分散貼壁生長的骨髓瘤細胞
B．制備的單克隆抗體A和單克隆抗體B是相同的單克隆抗體
C．用于生產單克隆抗體的雜交瘤細胞可傳代培養，但不能凍存
D．單克隆抗體A和單克隆抗體B都能夠特異性識別S蛋白
3．(2024·湖北卷)研究者探究不同濃度的雌激素甲對牛的卵母細胞和受精卵在體外發育的影響，實驗結果如下表所示。根據實驗數據，下列敘述錯誤的是(　　)
甲的濃度 (μg/mL) 卵母細 胞(個) 第一極體 排出(個) 成熟率 (%) 卵裂數 (個) 卵裂率 (%)
0 106 70 66.0 28 40.0
1 120 79 65.8 46 58.2
10 113 53 46.9 15 28.3
100 112 48 42.8 5 10.4
A．實驗結果說明甲抑制卵裂過程
B．甲濃度過高抑制第一極體的排出
C．添加1 μg/mL的甲可提高受精后胚胎發育能力
D．本實驗中，以第一極體的排出作為卵母細胞成熟的判斷標準
判斷與填空
1．營養供應充足時，傳代培養的胚胎干細胞不會發生接觸抑制。(2023·海南卷T7) (　　)
2．甲狀旁腺激素(PTH)水平是人類多種疾病的重要診斷指標。研究者制備單克隆抗體用于快速檢測PTH，需要制備用PTH免疫的小鼠。(2023·北京卷T12) (　　)
3．科學家采用體外受精技術獲得紫羚羊胚胎，并將其移植到長角羚羊體內，使后者成功妊娠并產仔，該工作有助于恢復瀕危紫羚羊的種群數量。此過程不涉及的操作有細胞核移植。(2023·廣東卷T3) (　　)
4．在家畜優良品種培育過程中常涉及胚胎工程的相關技術，其中胚胎分割技術提高了移植胚胎的成活率。(2023·浙江1月卷T12) (　　)
5．哺乳動物體外受精后的早期胚胎培養不需要額外提供營養物質。(2022·江蘇卷T4) (　　)
6．興趣小組開展小鼠原代神經元培養的研究，結果發現其培養的原代神經元生長緩慢，其原因不可能是實驗材料取自小鼠胚胎的腦組織。(2022·湖北卷T7) (　　)
7．將骨髓瘤細胞和B淋巴細胞混合，經誘導后融合的細胞即為雜交瘤細胞。(2021·江蘇卷T11) (　　)
8．在克隆哺乳動物過程中，通常作為核移植受體細胞的是去核的初級卵母細胞。(2020·天津卷T1) (　　)
9．經遺傳改造的小鼠胚胎干細胞注入囊胚，通過胚胎工程的相關技術可以獲得具有不同遺傳特性的實驗小鼠。胚胎移植前要檢查胚胎質量并在囊胚或原腸胚階段移植。(2020·山東卷T14) (　　)
10．與小鼠骨髓瘤細胞融合前，已免疫的脾細胞(含漿細胞)______________(填“需要”或“不需要”)通過原代培養擴大細胞數量；添加脂溶性物質PEG可促進細胞融合，該過程中PEG對細胞膜的作用是____________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。(2023·湖北卷T22)
11．與胚胎細胞核移植技術相比，體細胞核移植技術的成功率更低，原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。(2021·湖南卷T22)
動物細胞的培養及核移植
1．(2024·廣東佛山二模)卡鉑為廣譜抗腫瘤藥，通過抑制DNA復制而起效。卡鉑微溶于水，其水溶液在光下不穩定，溶液中的Cl－也會促進其分解。臨床上用5%葡萄糖溶液與卡鉑制成卡鉑試劑后注射治療，口服無效。相關實驗的設計思路如下圖，下列說法正確的是(　　)
A．本實驗的自變量是卡鉑試劑和DNA復制抑制劑的有無
B．本實驗可用生理鹽水代替5%葡萄糖溶液來配制卡鉑試劑
C．本實驗預期結果為①與④組數據接近，②與③組數據接近
D．宮頸癌細胞培養時的氣體環境是95%氧氣和5% CO2
2．(2024·吉林松原聯考)種間體細胞核移植(iSCNT)將供體動物體細胞與來自不同種、科、目或綱的家畜(馴養動物)的去核卵母細胞融合并激活，以獲得較多的重構胚，進而獲得動物個體，是體細胞核移植(SCNT)中極具潛力的研究方向之一。由于多種野生動物數量稀少且呈持續下降趨勢，因此采集精子或卵子開展常規輔助生殖較為困難，甚至無法完成，而從活體或死后不久的野生動物體內采集體細胞利用iSCNT技術獲得動物個體，可在一定程度上維持瀕危動物數量。下列敘述正確的是(　　)
A．iSCNT技術必須通過顯微操作技術將供體細胞的細胞核取出，然后注入去核的卵母細胞
B．若從野生動物體內采集到的體細胞數目較少，可先用添加動物血清的固體培養基進行培養
C．iSCNT技術的原理是動物細胞核具有全能性，操作過程中可用Ca2+激活重構胚
D．同一野生動物經iSCNT技術獲得的多個重構胚中，遺傳物質可能不完全相同
動物細胞融合及單克隆抗體
3．(2024·河北衡水二模)科研人員研發出單克隆抗體—肺癌藥物偶聯物，以減少肺癌藥物對正常細胞的傷害，基本流程如下。下列相關敘述正確的是(　　)
A．注射的特定抗原是正常肺細胞和肺癌細胞共有的大分子
B．抗體—肺癌藥物偶聯物中a代表肺癌藥物，b代表抗體
C．經②③最終得到的雜交瘤細胞只能產生針對肺癌細胞的抗體
D．抗體—肺癌藥物偶聯物只能定向運輸至肺癌細胞，將其殺傷
4．(不定項)(2024·湖南長郡中學模擬)一種抗體只能結合一種抗原。科研工作者設法獲得一種三特異性抗體，實現對小鼠多發性骨髓瘤細胞(MM)的選擇性殺傷，作用機理如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A．同時給小鼠注射3種抗原可刺激小鼠漿細胞分泌得到三特異性抗體
B．推測T淋巴細胞中也會大量表達CD38基因
C．三特異性抗體通過T細胞的活化并釋放細胞因子提高對MM的殺傷力
D．三特異性抗體與CD28和TCR結合可保持較高的T細胞數量和活性
胚胎工程技術及其應用
5．(2024·廣西南寧二模)目前發現的雙胞胎有同卵雙胞胎、異卵雙胞胎和“半同卵雙胞胎”。1對“半同卵小姐弟雙胞胎”形成過程如圖所示，圖中染色單體分離后分別移向細胞的三個不同方向，從而分裂成a、b、c三個細胞，染色體全部來自父系的“合子”致死。其中兩個細胞發育成姐弟二人。下列說法正確的是(　　)
A．受精卵發育為桑葚胚的過程是在透明帶內完成的，孵化后進入囊胚期階段
B．卵子在子宮內發育成熟并完成受精過程
C．若細胞a的染色體組成為MP1，則細胞b的染色體組成為MP2
D．這對雙胞胎來源于母親的染色體相同，來源于父親的染色體不一定不同
6．(2024·海南海口一模)近年來由于棲息地喪失和人為捕獵，亞洲黑熊數量驟減，科學家期望通過體內受精、胚胎移植等方法拯救亞洲黑熊，其過程如下圖。以下說法正確的是(　　)
A．胚胎工程一般采用促性腺激素釋放激素處理A使其超數排卵
B．E后代遺傳性狀與A和C一致，F后代遺傳性狀與B一致
C．D受體雌性必須和A、B同期發情處理
D．A排出的卵子必須培養成熟到MⅡ期才能與C的獲能精子受精
考點3　基因工程和蛋白質工程
1．基因工程的基本工具
2．基因工程的基本操作程序
提醒：辨析農桿菌轉化法中的“兩次拼接與兩次導入”
(1)兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA中；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受體細胞的染色體DNA上。
(2)兩次導入：第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌；第二次導入是指將含目的基因的T-DNA導入受體細胞。
3．PCR
(1)PCR的原理與條件等
(2)PCR反應過程
(3)PCR過程中引物的設計
①引物設計有3條基本原則
首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體等結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。
②引物設計的注意事項
a．引物的長度一般為20～30 bp，常用的是18～27 bp，但不應大于38 bp，因為過長會導致其延伸溫度大于74 ℃，不適于耐高溫的DNA聚合酶進行反應。
b．引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3′端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3′端出現3 個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發概率增加。
c．引物序列的GC含量一般為40～60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。
d．對引物的修飾一般是在5′端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR 產物的載體的相應序列而確定。值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR，因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況下只能退而求其次，盡量去滿足條件。
4．蛋白質工程
5．DNA的粗提取與鑒定
6．DNA片段的擴增及電泳鑒定
1．(2024·山東卷)研究發現基因L能夠通過脫落酸信號途徑調控大豆的逆境響應。利用基因工程技術編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaⅠ切點處插入大豆基因L的向導DNA序列，將載體導入大豆細胞后，其轉錄產物可引導核酸酶特異性結合基因組上的目標序列并發揮作用。載體信息、目標基因L部分序列及相關結果等如圖所示。
(1)用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目標基因L時，所用的引物越短，引物特異性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上可產生的黏性末端最多有________種。載體信息如圖甲所示，經BsaⅠ酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5′-________________-3′和5′-__________-3′。
(2)重組載體通過農桿菌導入大豆細胞，使用抗生素__________篩選到具有該抗生素抗性的植株①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點如圖乙所示，PCR產物完全酶切后的電泳結果如圖丙所示。據圖可判斷選用的限制酶是__________，其中純合的突變植株是____________(填序號)。
(3)實驗中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測發現其體細胞中只有1條染色體有T-DNA插入。用抗生素篩選這個植株的自交子代，其中突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例為____________，篩選出的敏感植株可用于后續的品種選育。
2．(2024·廣東卷)駒形桿菌可合成細菌纖維素(BC)并將其分泌到胞外組裝成膜。作為一種性能優異的生物材料，BC膜應用廣泛。研究者設計了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表達載體，將其轉入駒形桿菌后構建出一株能合成BC膜并可實現光控染色的工程菌株，為新型紡織原料的綠色制造及印染工藝升級提供了新思路(圖一)。
回答下列問題：
(1)研究者優化了培養基的____________(答兩點)等營養條件，并控制環境條件，大規模培養工程菌株后可在氣液界面處獲得BC菌膜(菌體和 BC膜的復合物)。
(2)研究者利用T7 噬菌體來源的RNA聚合酶(T7RNAP)及藍光光敏蛋白標簽，構建了一種可被藍光調控的基因表達載體(光控原理見圖二a，載體的部分結構見圖二b)。構建載體時，選用了通用型啟動子 PBAD(被工程菌 RNA 聚合酶識別)和特異型啟動子PT7(僅被T7RNAP識別)。為實現藍光控制染色，啟動子①②及③依次為________________，理由是___________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)光控表達載體攜帶大觀霉素(抗生素)抗性基因。長時間培養時在培養液中加入大觀霉素，其作用為__________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________(答兩點)。
(4)根據預設的圖案用藍光照射已長出的BC菌膜并繼續培養一段時間，隨后將其轉至染色池處理，發現只有經藍光照射的區域被染成黑色，其原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)有企業希望生產其他顏色圖案的BC膜。按照上述菌株的構建模式提出一個簡單思路：
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
判斷與填空
1．構建重組質粒需要使用DNA連接酶。屬于DNA連接酶底物。(2023·湖北卷T22) (　　)
2．關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，離心研磨液是為了加速DNA的沉淀。(2022·山東卷T13) (　　)
3．采用基因工程技術調控植物激素代謝，可實現作物改良。用特異啟動子誘導表達iaaM(生長素合成基因)可獲得無子果實。(2022·江蘇卷T6) (　　)
4．我國考古學家利用現代人的DNA序列設計并合成了一種類似磁鐵的“引子”，成功將極其微量的古人類DNA從提取自土壤沉積物中的多種生物的DNA中識別并分離出來，用于研究人類起源及進化。設計“引子”前不需要知道古人類的DNA序列。(2021·山東卷T4) (　　)
5．某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。增加模板DNA的量可減少反應中非特異條帶的產生。(2021·湖北卷T16) (　　)
6．熱啟動PCR可提高擴增效率，方法之一是：先將除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后，加熱到80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增，與常規PCR相比，熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物。(2021·江蘇卷T23) (　　)
7．用PCR反應擴增DA1基因，用限制性內切核酸酶對PCR產物和____________進行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DA1基因可以正常表達，其上下游序列需具備__________________________________。(2023·廣東卷T20)
8．農桿菌侵染植物細胞時，可將外源基因遞送到植物細胞中的原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。(2023·海南卷T20)
9．制備重組乙肝疫苗時，需要利用重組表達載體將乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)導入酵母細胞中表達。重組表達載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是____________。能識別載體中的啟動子并驅動目的基因轉錄的酶是____________________。(2023·全國甲卷T38)
10．為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是___________________________________________。為使PCR產物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的____________(填“3′端”或“5′端”)。(2022·山東卷T25)
11．某病人腎小管上皮細胞纖毛異常，為了分析纖毛相關基因X是否發生了變異，對基因X進行了PCR擴增與產物測序。從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至2.0 mo1/L的目的是____________。PCR擴增時，需在__________________催化下，在引物________端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。(2022·江蘇卷T24)
基因工程的原理及應用
1．(2024·湖北八市聯考)HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。雞卵清蛋白是由輸卵管上皮細胞中卵清蛋白基因特異性表達后分泌至輸卵管內，參與構成雞蛋清的蛋白質。下圖是利用基因工程技術制備HA蛋白雞輸卵管生物反應器的過程。幾種可供選擇的限制酶識別序列如下，下列說法錯誤的是(　　)
A．①為逆轉錄過程，該過程需要逆轉錄酶、4種游離的脫氧核苷酸等組分
B．目的基因與雞卵清蛋白基因啟動子拼接前應先在目的基因兩端分別引入HindⅢ和EcoRⅠ的識別序列
C．利用PCR技術擴增目的基因時，復性溫度偏低、引物特異性差均可導致產物中出現部分非目標序列
D．基因表達載體導入受精雞胚的胚盤可以使用顯微注射法
2．(2024·山東泰安二模)為獲得轉Gata3-RFP融合基因純合小鼠，科研人員將紅色熒光蛋白基因(RFP)插入含Gata3基因的載體中，然后導入小鼠受精卵，獲得能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌、雄小鼠各一只。利用熒光蛋白活體成像系統進行檢測，發現兩者均為陽性RFP轉基因小鼠。相關限制酶識別序列及限制酶識別位點如圖甲所示，A、B、C、F、R為不同引物。
(1)在PCR反應溶液中常添加________，其作用是__________________________。在利用PCR擴增RFP編碼區序列的過程中，需要設計引物F和R，在兩個引物的________(填“3′”或“5′”)端需分別插入___________的限制酶識別序列，以使RFP基因能正確插入載體中。用于擴增RFP編碼區序列的引物需滿足的條件是_________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)在RFP基因的擴增及重組載體的構建過程中，需要的工具酶有_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)將實驗獲得的兩只雌、雄雜合子小鼠(P)進行雜交獲得F1若干，選取1～5五只小鼠，從中提取含Gata3基因的相關DNA片段，設計了引物A和C用于PCR擴增，擴增產物電泳結果如圖乙所示，則________小鼠是Gata3-RFP基因純合子小鼠；若用引物A和B進行PCR擴增，________(填“能”或“不能”)區分RFP轉基因陽性小鼠中的雜合子和純合子，原因是_______________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)為制備大量單鏈DNA片段，研究人員常采用不對稱PCR技術。其基本原理是采用不等量的一對引物，經若干次循環后，低濃度的引物(限制性引物)被消耗盡，以后的循環只產生高濃度引物(非限制性引物)的延伸產物，結果獲得大量單鏈DNA(ss-DNA)。若反應體系中原有100個模板DNA，最初10個循環后限制性引物耗盡，再進行20個循環，理論上可制備ss-DNA________個(用科學計數法表示)，在這30個循環中ss-DNA的產生量主要受_______________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________的影響。
DNA片段的擴增及電泳鑒定
3．(2024·湖北武漢二模)油菜的綠葉對黃化葉為顯性。與綠葉基因相比，黃化葉基因有一個堿基對發生了改變，從而出現一個限制酶B的酶切位點。為鑒定某綠葉油菜的基因型，提取其DNA進行了PCR和電泳。下列敘述正確的是(　　)
A．需設計能與目的基因結合的雙鏈DNA作為PCR引物
B．應在PCR擴增體系中添加Mg2+，以激活DNA聚合酶
C．可適當降低復性的溫度，以減少PCR中非特異性條帶的產生
D．用酶B作用后進行電泳，若有2條電泳條帶可判斷為雜合子
4．(2024·廣東梅州二模)光敏色素基因在調節作物生長發育中具有重要作用。為探討玉米中光敏色素基因A(含大約256個堿基對)在棉花種質資源創制中的利用價值，研究人員將光敏色素基因A轉入棉花中，對棉花受體細胞進行檢測，并通過電泳技術分析結果。該過程所用質粒與含光敏色素基因的DNA上相關限制酶的酶切位點分別如圖甲、乙所示，電泳檢測結果如圖丙。下列相關敘述正確的是(　　)
A．為構建正確連接的表達載體，應選用BamHⅠ和HindⅢ這兩種限制酶
B．PCR擴增目的基因過程中每次循環都要經歷一次升溫和兩次降溫
C．表達載體導入受體細胞后，可用含四環素的選擇培養基進行初步篩選
D．由圖丙電泳結果可知，1、2、3、4號轉基因棉花均培育成功
DNA的粗提取及鑒定實驗
5．(2024·山東青島一模)“DNA的粗提取與鑒定”的實驗步驟：研磨→去雜質→析出→鑒定。某研究小組欲探究不同的去雜質方法對實驗結果的影響，實驗結果如下表所示。下列說法錯誤的是(　　)
去雜質方式 沉淀質量/g DNA濃度/(ng/μL) OD260/OD280 二苯胺鑒定
離心 0.068 81.5 1.53 藍色
4 ℃冰箱靜置 0.102 8 336.4 1.41
注：OD260與OD280的比值可檢查DNA純度。純DNA的OD260/OD280為1.8，當存在蛋白質污染時，這一比值會明顯降低。
A．豬肝和菜花均可作為提取DNA的材料
B．對研磨液進行離心是為了加速DNA的沉淀
C．離心法可以獲得更高純度的DNA
D．析出時的離心轉速明顯高于去雜質時的離心轉速
蛋白質工程及應用
6．(2024·天津和平區二模)人工接種純種毛霉生產的腐乳滋味平淡、香氣不佳，研究人員欲從自然發酵的傳統腐乳中篩選出新的毛霉菌株改良腐乳風味。他們想通過改造M4菌株形成新的單菌株毛霉發酵工藝，下圖為M4菌株改造的基本思路。關于圖中M4菌株改造的基本思路，下列說法錯誤的是(　　)
A．預期的A指活力更高的蛋白酶或脂肪酶
B．獲得A的基本策略是定點突變
C．獲取目的基因時可采用PCR技術
D．預期產品一定具備預期的蛋白質功能
21世紀教育網(www.21cnjy.com)(共176張PPT)
專題五　生物技術與工程
微專題13　細胞工程和基因工程
考點1　植物細胞工程
　　　　　　
1．植物組織培養技術——原理：植物細胞的全能性
再分化
(1)植物組織培養中添加蔗糖的目的是提供營養和調節滲透壓。
(2)脫分化階段不需要光，再分化階段需要光。
(3)生長素與細胞分裂素的比值高時，促進根的分化、抑制芽的形成；比值低時，促進芽的分化、抑制根的形成。
(4)體內細胞未表現全能性的原因：在特定的時間和空間條件下，細胞中的基因會____________。
選擇性地表達
2．植物體細胞雜交技術——原理：植物細胞的全能性、細胞膜的流動性
(1)圖中過程①用____________________處理去除細胞壁，得到的原生質體包括細胞膜、細胞質和細胞核三部分。
纖維素酶和果膠酶
(2)酶解去壁前用較高滲透壓溶液處理細胞：使細胞處于微弱的質壁分離狀態，有利于完整的原生質體的釋放，防止原生質體被破壞。
(3)圖中過程②的誘導方法有___________、離心法、_____________________、高Ca2+—高pH融合法等。
(4)原生質體融合成功的標志是___________________________。
電融合法
聚乙二醇(PEG)融合法
雜種細胞再生出細胞壁
3．植物體細胞雜交和有性雜交的比較
基因重組
1．(2024·湖北卷)植物甲抗旱、抗病性強，植物乙分蘗能力強、結實性好。科研人員通過植物體細胞雜交技術培育出兼有甲、乙優良性狀的植物丙，過程如下圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
A．過程①中酶處理的時間差異，原
因可能是兩種親本的細胞壁結構有差異
B．過程②中常采用滅活的仙臺病毒或PEG誘導原生質體融合
C．過程④和⑤的培養基中均需要添加生長素和細胞分裂素
D．可通過分析植物丙的染色體，來鑒定其是否為雜種植株
√
B　[酶解是為了去除植物細胞的細胞壁，過程①中酶處理的時間不同，原因可能是兩種親本的細胞壁結構有差異，A正確；過程②為原生質體的融合，常用PEG誘導原生質體融合，滅活的仙臺病毒可誘導動物細胞融合，不能用于植物細胞融合，B錯誤；過程④脫分化和⑤再分化的培養基中均需要添加生長素和細胞分裂素，但在兩個過程中比例不同，C正確；可通過分析植物丙的染色體，來鑒定其是否為雜種植株，D正確。]
2．(2024·黑、吉、遼卷)迷迭香酸具有多種藥理活性。進行工廠化生產時，先誘導外植體形成愈傷組織，再進行細胞懸浮培養獲得迷迭香酸，加入誘導劑茉莉酸甲酯可大幅提高產量。下列敘述錯誤的是(　　)
A．迷迭香頂端幼嫩的莖段適合用作外植體
B．誘導愈傷組織時需加入NAA和脫落酸
C．懸浮培養時需將愈傷組織打散成單個細胞或較小的細胞團
D．茉莉酸甲酯改變了迷迭香次生代謝物的合成速率
√
B　[迷迭香頂端幼嫩的莖段含有較高的生長素和細胞分裂素，適合用作外植體，A正確；誘導愈傷組織時需加入NAA和細胞分裂素，B錯誤；懸浮培養時需將愈傷組織打散成單個細胞或較小的細胞團，C正確；加入誘導劑茉莉酸甲酯可大幅提高產量，推測茉莉酸甲酯改變了迷迭香次生代謝物的合成速率，D正確。]
判斷與填空
1．研究者通過體細胞雜交技術，探索利用條斑紫菜和擬線紫菜培育雜種紫菜。從食用紫菜的動物消化道內提取蛋白酶，用于去除細胞壁。(2023·江蘇卷T13) (　　)
提示：紫菜細胞的細胞壁的主要成分是纖維素和果膠，用蛋白酶無法去除細胞壁。
×
2．利用植物細胞培養技術在離體條件下對單個細胞或細胞團進行培養使其增殖，可獲得植物細胞的某些次生代謝物。次生代謝物是植物所必需的，但含量少，應選擇產量高的細胞進行培養。(2023·山東卷T14) (　　)
提示：次生代謝物不是植物生長所必需的，其含量少，可以通過增加細胞的數量來增加次生代謝物的產量。
×
3．人參皂苷是人參的主要活性成分。科研人員分別誘導人參根與胡蘿卜根產生愈傷組織并進行細胞融合，以提高人參皂苷的產率。高Ca2+—高pH溶液可促進細胞融合。(2023·廣東卷T12) (　　)
4．在藍莓組織培養過程中，宜選用藍莓成熟葉片為材料制備外植體。(2022·遼寧卷T14) (　　)
提示：宜選用藍莓幼嫩葉片為材料制備外植體，因為幼嫩葉片細胞分裂旺盛、易培養。
√
×
5．植物組織培養技術常用于商業化生產：其過程一般為：無菌培養物的建立→培養物增殖→生根培養→試管苗移栽及鑒定。提高培養基中生長素與細胞分裂素的比值，有利于誘導生根。(2021·江蘇卷T5) (　　)
6．植物細胞合成的賴氨酸達到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關鍵酶的活性，導致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調節方式屬于__________。根據這種調節方式，在培養基中添加______________________，用于篩選經人工誘變的植物懸浮細胞，可得到抗賴氨酸類似物的細胞突變體，通過培養獲得再生植株。(2023·浙江6月卷T23)
√
提示：負反饋調節　過量賴氨酸類似物
7．利用帶側芽的莖段獲得叢狀苗的過程與利用莖段誘導產生愈傷組織再獲得叢狀苗的過程相比，前者總培養時間________，且不經歷__________過程，因而其遺傳性狀穩定，是大多數植物快速繁殖的常用方法。(2020·浙江7月卷T29)
提示：短　脫分化
8．植物組織培養技術可與基因工程技術相結合獲得轉基因植株。將含有目的基因的細胞培養成一個完整植株的基本程序是________(用流程圖表示)。(2019·全國Ⅱ卷T38)
題組1 植物細胞工程的基本技術
1．(2024·廣東茂名三模)轉錄因子Gh1和GhE1能調控棉花愈傷組織細胞的生長發育，參與體細胞胚胎發生過程中細胞命運的重塑，其機制如圖所示。下列相關分析正確的是(　　)
2
4
1
3
題號
A．將愈傷組織細胞在脫分化培養基上繼續培養可得到幼苗
B．Gh1基因發生甲基化可能會抑制愈傷組織細胞的增殖
C．促進GhE1基因的表達可促進愈傷組織分化成根等器官
D．Gh1與GhE1單獨作用均能調控GhPs基因的表達
√
2
4
1
3
題號
B　[將脫分化產生的愈傷組織，在再分化培養基上繼續培養可得到幼苗，A錯誤；Gh1基因發生甲基化，則會抑制Gh1基因的表達，不能與GhE1基因的表達產物形成復合物調控GhPs的表達，從而抑制愈傷組織細胞的增殖，B正確；促進GhE1基因的表達，可能會導致GhPs基因的表達產物增多，從而促進愈傷組織細胞的增殖，抑制愈傷組織分化成根等器官，C錯誤；Gh1基因與GhE1基因表達后形成的蛋白質相互結合可調控GhPs基因的表達，Gh1與GhE1單獨作用不能調控GhPs基因的表達，D錯誤。]
2
4
1
3
題號
2．(2024·湖南衡陽模擬)現有甲、乙兩個煙草品種(2n＝48)，其基因型分別為aaBB和AAbb，A/a、B/b這兩對基因位于非同源染色體上。在光強度大于800 lx時，甲、乙兩種煙草都不能生長，這是它們中各自存在的一對隱性純合基因(aa或bb)作用的結果。取甲、乙兩煙草品種的花粉分別培養成植株，將它們的葉肉細胞制成原生質體并混合，然后使之融合，誘導產生細胞團。隨后將誘導產生的細胞團放到光強度大于800 lx的光下培養，結果有的細胞團不能分化，有的能分化發育成植株。如果只考慮原生質體的兩兩融合，下列敘述正確的是(　　)
2
4
1
3
題號
A．過程①是在無菌水中進行，需要纖維素酶和果膠酶
B．過程②是在固體培養基中進行，可用滅活的病毒誘導
C．過程③培養基中通常添加蔗糖作碳源和能源
D．能分化的細胞團發育成的植株自交，后代在光強度大于800 lx的光下，能生長的植株占7/16
√
2
4
1
3
題號
C　[過程①是在等滲或較高滲溶液中進行，而不是在無菌水中進行，A錯誤；過程②是誘導融合，需要在液體培養基中進行，滅活的病毒可誘導動物細胞融合，B錯誤；過程③培養基中通常添加蔗糖作碳源和能源，C正確；據題分析可知，基因型為AaBb的細胞團能分化發育成植株，該植株自交產生的后代中，在光強度大于800 lx的光下能生長的植株的基因型為A_B_，所占比例為3/4×3/4＝9/16，D錯誤。]
2
4
1
3
題號
題組2 植物體細胞工程的應用
3．(2024·湖南長沙二模)紅豆杉(2n＝24)能產生具有高抗癌活性的紫杉醇，柴胡(2n＝12)生長迅速。紅豆杉—柴胡是通過植物細胞工程培育的一種既能產生紫杉醇，又能迅速生長的雜交植株。部分培育過程如圖所示。下列有關敘述正確的是(　　)
2
4
1
3
題號
A．獲得原生質體的過程需要用纖維素酶和胰蛋白酶去除細胞壁
B．過程①可用高Ca2+—高pH融合法誘導，利用了細胞膜的流動性
C．過程②的培養基中需添加適量的生長素類和赤霉素類植物生長調節劑
D．紅豆杉—柴胡雜種植株是二倍體，能夠產生可育配子
√
2
4
1
3
題號
B　[植物細胞壁的成分主要是纖維素和果膠，獲得原生質體的過程需要用纖維素酶和果膠酶去除植物細胞的細胞壁，A錯誤；過程①是誘導原生質體融合，可用高Ca2+—高pH融合法，利用了細胞膜的流動性，B正確；過程②為脫分化，該過程需要在培養基中添加適量的生長素類和細胞分裂素類植物生長調節劑，C錯誤；紅豆杉—柴胡雜種植株是異源四倍體而不是二倍體，能夠產生可育配子，D錯誤。]
2
4
1
3
題號
4．(2024·山東淄博二模)鐵皮石斛是名貴中藥，其有效成分生物堿為細胞的次生代謝物。研究人員將鐵皮石斛的營養芽采用組織培養技術培養成擬原球莖(PLBs，類似愈傷組織)，培養過程中PLBs重量、生物堿含量的變化如圖。下列說法錯誤的是(　　)
2
4
1
3
題號
A．在培養前應對營養芽進行消毒，在火焰旁進行接種操作可減少污染
B．因新生營養芽的細胞分化程度低，作外植體培養時容易誘導形成PLBs
C．誘導營養芽形成PLBs的過程稱為細胞的脫分化，生物堿為該過程提供營養
D．與黑暗條件相比，PLBs在光照條件下的生長起始時間早、快速生長時間長
√
2
4
1
3
題號
C　[在接種前對外植體進行消毒，并在火焰旁進行接種可減少污染，A正確；選用新生營養芽為外植體是因為其分化程度低、分裂能力旺盛且幾乎不攜帶病毒，作外植體培養時容易誘導形成PLBs，B正確；生物堿為細胞的次生代謝物，不能提供營養，C錯誤；由圖可知，與黑暗條件下相比，PLBs在光照條件下的生長起始時間早、快速生長時間長，D正確。]
2
4
1
3
題號
考點2　動物細胞工程和胚胎工程
1．動物細胞培養
懸浮生
長
細胞貼壁
生長
(1)動物細胞培養中兩次使用胰蛋白酶的作用不同：
第一次：處理剪碎的組織，使其分散成單個細胞；
第二次：使貼壁生長的細胞從瓶壁上脫落下來。
(2)區分原代培養和傳代培養的關鍵是：是否分瓶培養。
2．克隆動物培育的流程
基本相同
3．胚胎早期發育過程
內細胞團
滋養層
4．胚胎移植的生理學基礎
5．“試管羊”“克隆羊”和“轉基因羊”的產生過程比較
1．(2024·黑、吉、遼卷)從小鼠胚胎中分離獲取胚胎成纖維細胞進行貼壁培養，在傳代后的不同時間點檢測細胞數目，結果如圖。下列敘述正確的是(　　)
A．傳代培養時，培養皿需密封防止污染
B．選取①的細胞進行傳代培養比②更合理
C．直接用離心法收集細胞進行傳代培養
D．細胞增長進入平臺期可能與細胞密度過大有關
√
D　[傳代培養時需要營造無菌、無毒以及95%空氣＋5%CO2的氣體環境，而非密封，A錯誤；處于指數增長期的細胞形態和生理特性相對穩定，適合進行傳代培養，離體培養的細胞生命力比較脆弱，需要適應培養基的環境，傳代最好在細胞生長覆蓋瓶底80%～90%進行，選取②的細胞進行傳代培養比①更合理，B錯誤；對于貼壁生長的細胞進行傳代培養時，先需要用胰蛋白酶等處理，使之分散為單個細胞，然后再用離心法收集，C錯誤；細胞密度過大、營養物質減少、代謝廢物增多，都會導致細胞停止分裂而進入平臺期，D正確。]
2．(不定項)(2024·江西卷)某病毒顆粒表面有一特征性的大分子結構蛋白S(含有多個不同的抗原決定基，每一個抗原決定基能夠刺激機體產生一種抗體)。為了建立一種靈敏、高效檢測S蛋白的方法，研究人員采用雜交瘤技術制備了抗-S單克隆抗體(如圖)。下列說法正確的是(　　)
A．利用膠原蛋白酶處理，可分散貼壁生長的骨髓瘤細胞
B．制備的單克隆抗體A和單克隆抗體B是相同的單克隆抗體
C．用于生產單克隆抗體的雜交瘤細胞可傳代培養，但不能凍存
D．單克隆抗體A和單克隆抗體B都能夠特異性識別S蛋白
√
√
AD　[膠原蛋白酶可以催化分解細胞外的膠原蛋白，因此利用膠原蛋白酶處理，可分散貼壁生長的骨髓瘤細胞，A正確；由于S蛋白含有多個不同的抗原決定基，每一個抗原決定基能夠刺激機體產生一種抗體，單克隆抗體A和單克隆抗體B可能來自不同的雜交瘤細胞，因此制備的單克隆抗體A和單克隆抗體B不一定是相同的單克隆抗體，B錯誤；用于生產單克隆抗體的雜交瘤細胞可傳代培養，也可凍存，C錯誤；單克隆抗體A和單克隆抗體B都來自篩選出的雜交瘤細胞，因此都能夠特異性識別S蛋白上的抗原決定基，D正確。]
3．(2024·湖北卷)研究者探究不同濃度的雌激素甲對牛的卵母細胞和受精卵在體外發育的影響，實驗結果如下表所示。根據實驗數據，下列敘述錯誤的是(　　)
甲的濃度
(μg/mL) 卵母細
胞(個) 第一極體
排出(個) 成熟率
(%) 卵裂數
(個) 卵裂率
(%)
0 106 70 66.0 28 40.0
1 120 79 65.8 46 58.2
10 113 53 46.9 15 28.3
100 112 48 42.8 5 10.4
A．實驗結果說明甲抑制卵裂過程
B．甲濃度過高抑制第一極體的排出
C．添加1 μg/mL的甲可提高受精后胚胎發育能力
D．本實驗中，以第一極體的排出作為卵母細胞成熟的判斷標準
√
A　[由表可知，甲低濃度時促進卵裂，高濃度時抑制卵裂，A錯誤；對照組第一極體排出個數為70個，甲濃度過高(＞10 μg/mL，第一極體排出個數＜70)抑制第一極體的排出，B正確；添加1 μg/mL的甲，卵裂數和卵裂率均增大，即該條件可提高受精后胚胎發育能力，C正確；據題分析可知，作為卵母細胞成熟的判斷標準是第一極體的排出，D正確。]
判斷與填空
1．營養供應充足時，傳代培養的胚胎干細胞不會發生接觸抑制。(2023·海南卷T7) (　　)
提示：營養供應充足時，傳代培養的胚胎干細胞也會發生接觸抑制。
2．甲狀旁腺激素(PTH)水平是人類多種疾病的重要診斷指標。研究者制備單克隆抗體用于快速檢測PTH，需要制備用PTH免疫的小鼠。(2023·北京卷T12) (　　)
×
√
3．科學家采用體外受精技術獲得紫羚羊胚胎，并將其移植到長角羚羊體內，使后者成功妊娠并產仔，該工作有助于恢復瀕危紫羚羊的種群數量。此過程不涉及的操作有細胞核移植。(2023·廣東卷T3) (　　)
4．在家畜優良品種培育過程中常涉及胚胎工程的相關技術，其中胚胎分割技術提高了移植胚胎的成活率。(2023·浙江1月卷T12) (　　)
提示：胚胎分割可以獲得多個胚胎，分割次數越多，分割后胚胎成活率越小。
√
×
5．哺乳動物體外受精后的早期胚胎培養不需要額外提供營養物質。(2022·江蘇卷T4) (　　)
提示：哺乳動物體外受精后的早期胚胎培養所需營養物質與體內基本相同，例如需要有糖、氨基酸、無機鹽等。
6．興趣小組開展小鼠原代神經元培養的研究，結果發現其培養的原代神經元生長緩慢，其原因不可能是實驗材料取自小鼠胚胎的腦組織。(2022·湖北卷T7) (　　)
×
√
7．將骨髓瘤細胞和B淋巴細胞混合，經誘導后融合的細胞即為雜交瘤細胞。(2021·江蘇卷T11) (　　)
提示：將骨髓瘤細胞和B淋巴細胞混合，經誘導融合后的細胞不都是雜交瘤細胞，還有B淋巴細胞自身融合的細胞、骨髓瘤細胞自身融合的細胞等。
8．在克隆哺乳動物過程中，通常作為核移植受體細胞的是去核的初級卵母細胞。(2020·天津卷T1) (　　)
提示：在克隆哺乳動物過程中，通常選擇減數分裂Ⅱ中期的去核卵母細胞作為受體細胞，即次級卵母細胞。
×
×
9．經遺傳改造的小鼠胚胎干細胞注入囊胚，通過胚胎工程的相關技術可以獲得具有不同遺傳特性的實驗小鼠。胚胎移植前要檢查胚胎質量并在囊胚或原腸胚階段移植。(2020·山東卷T14) (　　)
提示：胚胎移植通常選擇囊胚期之前的階段，如桑葚胚或囊胚階段。
×
10．與小鼠骨髓瘤細胞融合前，已免疫的脾細胞(含漿細胞)______________(填“需要”或“不需要”)通過原代培養擴大細胞數量；添加脂溶性物質PEG可促進細胞融合，該過程中PEG對細胞膜的作用是_________。(2023·湖北卷T22)
提示：不需要　使細胞接觸處的磷脂分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合
11．與胚胎細胞核移植技術相比，體細胞核移植技術的成功率更低，原因是_____________________________。(2021·湖南卷T22)
提示：動物胚胎細胞分化程度低，恢復其全能性相對容易，而動物體細胞分化程度高，恢復其全能性十分困難
2
4
1
3
題號
5
6
題組1 動物細胞的培養及核移植
1．(2024·廣東佛山二模)卡鉑為廣譜抗腫瘤藥，通過抑制DNA復制而起效。卡鉑微溶于水，其水溶液在光下不穩定，溶液中的
Cl－也會促進其分解。臨床上用5%葡萄糖溶液與卡鉑制成卡鉑試劑后注射治療，口服無效。相關實驗的設計思路如下圖，下列說法正確的是(　　)
A．本實驗的自變量是卡鉑試劑和DNA復制抑制劑的有無
B．本實驗可用生理鹽水代替5%葡萄糖溶液來配制卡鉑試劑
C．本實驗預期結果為①與④組數據接近，②與③組數據接近
D．宮頸癌細胞培養時的氣體環境是95%氧氣和5% CO2
√
2
4
1
3
題號
5
6
A　[由題圖分析可知，本實驗的自變量是卡鉑試劑、DNA復制抑制劑的有無，A正確；生理鹽水中含Cl－，會促進卡鉑的分解，失去療效，因此不可用生理鹽水代替5%葡萄糖溶液來配制卡鉑試劑，B錯誤；①組不會抑制DNA的復制，④組會抑制DNA的復制，所以預期實驗結果不相近，C錯誤；宮頸癌細胞培養時的氣體環境是95%空氣和5% CO2，D錯誤。]
2
4
1
3
題號
5
6
2．(2024·吉林松原聯考)種間體細胞核移植(iSCNT)將供體動物體細胞與來自不同種、科、目或綱的家畜(馴養動物)的去核卵母細胞融合并激活，以獲得較多的重構胚，進而獲得動物個體，是體細胞核移植(SCNT)中極具潛力的研究方向之一。由于多種野生動物數量稀少且呈持續下降趨勢，因此采集精子或卵子開展常規輔助生殖較為困難，甚至無法完成，而從活體或死后不久的野生動物體內采集體細胞利用iSCNT技術獲得動物個體，可在一定程度上維持瀕危動物數量。下列敘述正確的是(　　)
2
4
1
3
題號
5
6
A．iSCNT技術必須通過顯微操作技術將供體細胞的細胞核取出，然后注入去核的卵母細胞
B．若從野生動物體內采集到的體細胞數目較少，可先用添加動物血清的固體培養基進行培養
C．iSCNT技術的原理是動物細胞核具有全能性，操作過程中可用Ca2+激活重構胚
D．同一野生動物經iSCNT技術獲得的多個重構胚中，遺傳物質可能不完全相同
√
2
4
1
3
題號
5
6
D　[據題分析可知，iSCNT技術可以通過顯微操作技術將供體細胞注入去核的卵母細胞，A錯誤；若從野生動物體內采集到的體細胞數目較少，可先用添加動物血清的液體培養基進行培養，以增加體細胞的數目，B錯誤；iSCNT技術的原理是動物細胞核具有全能性，操作過程中可用Ca2+載體激活重構胚，C錯誤；在種間體細胞核移植過程中，去核的卵母細胞來自不同種、科、目或綱的家畜(馴養動物)，獲得的重構胚的細胞質遺傳物質可能不同，因此同一野生動物經iSCNT技術獲得的多個重構胚中，遺傳物質可能不完全相同，D正確。]
2
4
1
3
題號
5
6
題組2 動物細胞融合及單克隆抗體
3．(2024·河北衡水二模)科研人員研發出單克隆抗體—肺癌藥物偶聯物，以減少肺癌藥物對正常細胞的傷害，基本流程如下。下列相關敘述正確的是(　　)
A．注射的特定抗原是正常肺細胞和肺
癌細胞共有的大分子
B．抗體—肺癌藥物偶聯物中a代表肺癌藥物，b代表抗體
C．經②③最終得到的雜交瘤細胞只能產生針對肺癌細胞的抗體
D．抗體—肺癌藥物偶聯物只能定向運輸至肺癌細胞，將其殺傷
√
2
4
1
3
題號
5
6
C　[根據題意可知，科研人員研發出單克隆抗體—肺癌藥物偶聯物，以減少肺癌藥物對正常細胞的傷害，據此可推測，該單抗制備過程中需要注射的特定抗原是肺癌細胞特有的大分子，A錯誤；抗體—肺癌藥物偶聯物中b代表肺癌藥物，a代表抗體，B錯誤；經②③兩次篩選最終得到的雜交瘤細胞只能產生針對肺癌細胞的抗體，而后對其進行大量體外或體內培養，獲得特定的抗體，C正確；抗體—肺癌藥物偶聯物能運輸到全身各處，但只能定向作用至肺癌細胞，將其殺傷，D錯誤。]
2
4
1
3
題號
5
6
4．(不定項)(2024·湖南長郡中學模擬)一種抗體只能結合一種抗原。科研工作者設法獲得一種三特異性抗體，實現對小鼠多發性骨髓瘤細胞(MM)的選擇性殺傷，作用機理如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
2
4
1
3
題號
5
6
A．同時給小鼠注射3種抗原可刺激小鼠漿細胞分泌得到三特異性抗體
B．推測T淋巴細胞中也會大量表達CD38基因
C．三特異性抗體通過T細胞的活化并釋放細胞因子提高對MM的殺傷力
D．三特異性抗體與CD28和TCR結合可保持較高的T細胞數量和活性
√
√
2
4
1
3
題號
5
6
CD　[一種漿細胞只能分泌一種抗體，A錯誤；據題意可知，三特異性抗體能實現對小鼠多發性骨髓瘤細胞(MM)的選擇性殺傷，原因是CD38基因在正常體細胞中不表達或者表達量很低，B錯誤；三特異性抗體能促進T細胞活化產生并釋放細胞因子，細胞因子會促進T淋巴細胞的活化，從而提高機體對MM的殺傷力，C正確；據圖可知，一方面三特異性抗體與T細胞膜上的CD28結合，抑制T細胞死亡，另一方面特異性抗體與T細胞膜上的TCR結合，促進T細胞活化，所以三特異性抗體與CD28和TCR結合可保持較高的T細胞數量和活性，D正確。]
2
4
1
3
題號
5
6
題組3 胚胎工程技術及其應用
5．(2024·廣西南寧二模)目前發現的雙胞胎有同卵雙胞胎、異卵雙胞胎和“半同卵雙胞胎”。1對“半同卵小姐弟雙胞胎”形成過程如圖所示，圖中染色單體分離后分別移向細胞的三個不同方向，從而分裂成a、b、c三個細胞，染色體全部來自父系的“合子”致死。其中兩個細胞發育成姐
弟二人。下列說法正確的是(　　)
2
4
1
3
題號
5
6
A．受精卵發育為桑葚胚的過程是在透明帶內完成的，孵化后進入囊胚期階段
B．卵子在子宮內發育成熟并完成受精過程
C．若細胞a的染色體組成為MP1，則細胞b的染色體組成為MP2
D．這對雙胞胎來源于母親的染色體相同，來源于父親的染色體不一定不同
√
2
4
1
3
題號
5
6
C　[囊胚期時，囊胚進一步擴大，會導致透明帶破裂，胚胎從其中伸展出來，這一過程叫作孵化，A錯誤；卵子在輸卵管內發育成熟并完成受精過程，B錯誤；來自母系的染色體為M，來自父系的染色體為P1、P2，經過復制后，染色體進行組合，若細胞a的染色體組成為MP1，細胞c的染色體均來自父親，其染色體組成為P1P2，細胞b的染色體組成為MP2，C正確；細胞a的染色體組成為MP1，細胞b的染色體組成為MP2，這對雙胞胎發育為姐弟，來源于父親的性染色體不同，D錯誤。]
2
4
1
3
題號
5
6
6．(2024·海南海口一模)近年來由于棲息地喪失和人為捕獵，亞洲黑熊數量驟減，科學家期望通過體內受精、胚胎移植等方法拯救亞洲黑熊，其過程如下圖。以下說法正確的是(　　)
A．胚胎工程一般采用促性腺激素釋放激
素處理A使其超數排卵
B．E后代遺傳性狀與A和C一致，F后代
遺傳性狀與B一致
C．D受體雌性必須和A、B同期發情處理
D．A排出的卵子必須培養成熟到MⅡ期才能與C的獲能精子受精
√
2
4
1
3
題號
5
6
D　[胚胎工程一般采用促性腺激素處理A使其超數排卵，A錯誤；E后代(由A的卵細胞和C的精子體內受精形成的受精卵發育形成)遺傳物質來源于A和C，E后代遺傳性狀與A和C一致，而F后代(A的卵細胞提供細胞質，B提供細胞核)遺傳物質來源于A和B，F后代遺傳性狀大部分與B一致，少部分與A相同，B錯誤；D受體雌性接受來自動物園亞洲黑熊♀A體內的胚胎，所以必須和動物園亞洲黑熊♀A同期發情處理，而野生亞洲黑熊♀B只需要提供體細胞，所以不需要同期發情處理，C錯誤；A超數排卵排出的細胞必須培養成熟到MⅡ期才具有受精能力，因此A排出的卵子必須培養成熟到MⅡ期才能與C的獲能精子受精，D正確。]
2
4
1
3
題號
5
6
考點3　基因工程和蛋白質工程
1．基因工程的基本工具
磷酸二酯鍵
T4 DNA連接酶
2．基因工程的基本操作程序
結構和功能
PCR
識別和結合
轉錄
顯微注射法
提醒：辨析農桿菌轉化法中的“兩次拼接與兩次導入”
(1)兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA中；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受體細胞的染色體DNA上。
(2)兩次導入：第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌；第二次導入是指將含目的基因的T-DNA導入受體細胞。
3．PCR
(1)PCR的原理與條件等
DNA的半保留復制
耐高
溫的DNA聚合酶
5′
3′
(2)PCR反應過程
(3)PCR過程中引物的設計
①引物設計有3條基本原則
首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體等結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。
②引物設計的注意事項
a．引物的長度一般為20～30 bp，常用的是18～27 bp，但不應大于38 bp，因為過長會導致其延伸溫度大于74 ℃，不適于耐高溫的DNA聚合酶進行反應。
b．引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3′端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3′端出現3 個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發概率增加。
c．引物序列的GC含量一般為40～60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。
d．對引物的修飾一般是在5′端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR 產物的載體的相應序列而確定。值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR，因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況下只能退而求其次，盡量去滿足條件。
4．蛋白質工程
預期的蛋白質結構
合成新的基因
5．DNA的粗提取與鑒定
藍色
6．DNA片段的擴增及電泳鑒定
凝膠
的濃度
300 nm
1．(2024·山東卷)研究發現基因L能夠通過脫落酸信號途徑調控大豆的逆境響應。利用基因工程技術編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaⅠ切點處插入大豆基因L的向導DNA序列，將載體導入大豆細胞后，其轉錄產物可引導核酸酶特異性結合基因組上的目標序列并發揮作用。載體信息、目標基因L部分序列及相關結果等如圖所示。
(1)用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目標基因L時，所用的引物越短，引物特異性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上可產生的黏性末端最多有________種。載體信息如圖甲所示，經BsaⅠ酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5′-________-3′和5′-________-3′。
低
44
GTTT
CAAT
(2)重組載體通過農桿菌導入大豆細胞，使用抗生素________篩選到具有該抗生素抗性的植株①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點如圖乙所示，PCR產物完全酶切后的電泳結果如圖丙所示。據圖可判斷選用的限制酶是________，其中純合的突變植株是________(填序號)。
卡那霉素
Sac Ⅰ
④
(3)實驗中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測發現其體細胞中只有1條染色體有T-DNA插入。用抗生素篩選這個植株的自交子代，其中突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例為________，篩選出的敏感植株可用于后續的品種選育。
1/4
[解析]　(1)在利用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目的基因時，所用的引物越短，則引物的特異性就越低。結合BsaⅠ識別序列可知，BsaⅠ酶切后產生的黏性末端含有4個堿基，故若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上可產生的黏性末端最多有4×4×4×4＝44種。根據圖甲所示的載體信息，經BsaⅠ酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5′-GTTT-3′和5′-CAAT-3′。
(2)根據圖示信息可知，重組載體通過農桿菌導入大豆細胞當中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通過使用卡那霉素篩選到具有該抗生素抗性的植株。根據圖甲可知，目標基因L的目標序列跟突變序列之間的差異只有在SacⅠ酶切位點上存在差異，BamHⅠ和EcoRⅠ這兩個酶切位點完全相同，根據圖丙及題意可知，以題述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，并對PCR產物完全酶切后進行電泳從而判斷植株含有的是目標序列還是突變序列，因此只能選用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突變序列存在酶切位點，但是目標序列沒有，因此經過該酶酶切后突變序列的電泳條帶會出現兩個條帶，目標序列是一個條帶，根據圖丙結果可知，只有④為純合的突變植株。
(3)根據題意可知，在實驗當中獲得了一株基因L成功突變的純合植株，已知該植株具有抗生素抗性，經過檢測卻發現其體細胞中只有一條染色體有T-DNA插入。根據圖示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素來篩選該植株進行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例為1/2，不含T-DNA(對抗生素敏感)的配子比例為1/2，因此突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例應該為1/2×1/2＝1/4，突變位點純合且具有抗生素抗性的植株所占比例應該為3/4，篩選出的敏感植株可用于后續的品種選育。
2．(2024·廣東卷)駒形桿菌可合成細菌纖維素(BC)并將其分泌到胞外組裝成膜。作為一種性能優異的生物材料，BC膜應用廣泛。研究者設計了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表達載體，將其轉入駒形桿菌后構建出一株能合成BC膜并可實現光控染色的工程菌株，為新型紡織原料的綠色制造及印染工藝升級提供了新思路(圖一)。
回答下列問題：
(1)研究者優化了培養基的____________(答兩點)等營養條件，并控制環境條件，大規模培養工程菌株后可在氣液界面處獲得BC菌膜(菌體和 BC膜的復合物)。
碳源、氮源
(2)研究者利用T7 噬菌體來源的RNA聚合酶(T7RNAP)及藍光光敏蛋白標簽，構建了一種可被藍光調控的基因表達載體(光控原理見圖二a，載體的部分結構見圖二b)。構建載體時，選用了通用型啟動子 PBAD(被工程菌 RNA 聚合酶識別)和特異型啟動子PT7(僅被T7RNAP識別)。為實現藍光控制染色，啟動子①②及③依次為____________
_____，理由是______________________________________________
_______________。
PT7、PBAD和
PBAD
基因2和3正常表達無活性產物，被藍光激活后再啟
動基因1表達
(3)光控表達載體攜帶大觀霉素(抗生素)抗性基因。長時間培養時在培養液中加入大觀霉素，其作用為____________________________
(答兩點)。
(4)根據預設的圖案用藍光照射已長出的BC菌膜并繼續培養一段時間，隨后將其轉至染色池處理，發現只有經藍光照射的區域被染成黑色，其原因是_____________________________________________
________。
抑制雜菌；去除丟失質粒的菌株
該處細胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表達并合成
黑色素
(5)有企業希望生產其他顏色圖案的BC膜。按照上述菌株的構建模式提出一個簡單思路：_____________________________________。
將酪氨酸酶替換成催化其他色素合成的酶
[解析]　(1)培養基的營養物質包括水、無機鹽、碳源、氮源等，研究者培養工程菌，需要優化培養基的碳源、氮源等營養條件，并控制環境條件。
(2)題圖二a分析可知，藍光照射下，T7RNAP N端-nMag與pMag-T7RNAP C端結合，導致無活性的T7RNAP變成有活性的T7RNAP，結合圖一，藍光處理后，RNA聚合酶(T7RNAP)識別啟動子①使基因1轉錄獲得相應的mRNA，再以其為模板通過翻譯過程獲得酪氨酸酶，酪氨酸酶從而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可見基因2和3正常表達無活性產物，被藍光激活后再啟動基因1表達，綜合分析可知，為實現藍光控制染色，啟動子①②及③依次為PT7、PBAD和PBAD。
(3)光控表達載體攜帶大觀霉素(抗生素)抗性基因。長時間培養時在培養液中加入大觀霉素，其作用為抑制雜菌和去除丟失質粒的菌株。(4)由(2)分析可知，細胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表達并合成黑色素，故用藍光照射已長出的BC菌膜并繼續培養一段時間，隨后將其轉至染色池處理，發現只有經藍光照射的區域被染成黑色。
(5)由(2)分析可知，題干信息的設計思路最終BC膜被染成黑色，希望生產其他顏色圖案的BC膜，則需要將酪氨酸酶替換成催化其他色素合成的酶。
判斷與填空
1．構建重組質粒需要使用DNA連接酶。 屬于DNA連接酶底物。(2023·湖北卷T22) (　　)
2．關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，離心研磨液是為了加速DNA的沉淀。(2022·山東卷T13) (　　)
提示：離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀。
√
×
3．采用基因工程技術調控植物激素代謝，可實現作物改良。用特異啟動子誘導表達iaaM(生長素合成基因)可獲得無子果實。(2022·江蘇卷T6) (　　)
4．我國考古學家利用現代人的DNA序列設計并合成了一種類似磁鐵的“引子”，成功將極其微量的古人類DNA從提取自土壤沉積物中的多種生物的DNA中識別并分離出來，用于研究人類起源及進化。設計“引子”前不需要知道古人類的DNA序列。(2021·山東卷T4) (　　)
√
√
5．某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。增加模板DNA的量可減少反應中非特異條帶的產生。(2021·湖北卷T16) (　　)
提示：增加模板DNA的量可以提高反應速度，但不能有效減少反應中非特異條帶。
×
6．熱啟動PCR可提高擴增效率，方法之一是：先將除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后，加熱到80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增，與常規PCR相比，熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物。(2021·江蘇卷T23) (　　)
7．用PCR反應擴增DA1基因，用限制性內切核酸酶對PCR產物和________進行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DA1基因可以正常表達，其上下游序列需具備__________________。(2023·廣東卷T20)
√
提示：運載體　啟動子和終止子
8．農桿菌侵染植物細胞時，可將外源基因遞送到植物細胞中的原因是____________________________________。(2023·海南卷T20)
提示：農桿菌細胞內含Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA轉移并整合到受體細胞染色體DNA上
9．制備重組乙肝疫苗時，需要利用重組表達載體將乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)導入酵母細胞中表達。重組表達載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是________。能識別載體中的啟動子并驅動目的基因轉錄的酶是_____________________。(2023·全國甲卷T38)
提示：篩選　RNA聚合酶
10．為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是_____________________。為使PCR產物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。(2022·山東卷T25)
提示：能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對、短單鏈核酸　5′端
11．某病人腎小管上皮細胞纖毛異常，為了分析纖毛相關基因X是否發生了變異，對基因X進行了PCR擴增與產物測序。從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至2.0 mo1/L的目的是____________。PCR擴增時，需在__________________________催化下，在引物________端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。(2022·江蘇卷T24)
提示：溶解DNA　耐高溫的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)　3′
2
4
1
3
題號
5
6
題組1 基因工程的原理及應用
1．(2024·湖北八市聯考)HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。雞卵清蛋白是由輸卵管上皮細胞中卵清蛋白基因特異性表達后分泌至輸卵管內，參與構成雞蛋清的蛋白質。下圖是利用基因工程技術制備HA蛋白雞輸卵管生物反應器的過程。
幾種可供選擇的限制酶識別序列如下，
下列說法錯誤的是(　　)
A．①為逆轉錄過程，該過程需要逆轉錄酶、4種游離的脫氧核苷酸等組分
B．目的基因與雞卵清蛋白基因啟動子拼接前應先在目的基因兩端分別引入HindⅢ和EcoRⅠ的識別序列
C．利用PCR技術擴增目的基因時，復性溫度偏低、引物特異性差均可導致產物中出現部分非目標序列
D．基因表達載體導入受精雞胚的胚盤可以使用顯微注射法
2
4
1
3
題號
5
6
√
B　[圖中①以禽流感病毒RNA形成目的基因DNA過程，為逆轉錄過程，需要的酶是逆轉錄酶，逆轉錄合成的是DNA，需要4種脫氧核苷酸作為原料，A正確；目的基因兩端引入BamHⅠ和EcoRⅠ的識別序列，進而使目的基因能夠與雞卵清蛋白基因啟動子、載體正確連接，構建基因表達載體，B錯誤；PCR技術擴增目的基因時，若復性溫度偏低，則可能導致引物與非目的基因序列部分配對，進而擴增出非目標序列，引物特異性差也會導致和非目的基因序列部分配對，導致產物中出現部分非目標序列，C正確；受體細胞為動物細胞時通常采用顯微注射法，因此基因表達載體導入受精雞胚的胚盤可以使用顯微注射法，D正確。]
2
4
1
3
題號
5
6
2．(2024·山東泰安二模)為獲得轉Gata3-RFP融合基因純合小鼠，科研人員將紅色熒光蛋白基因(RFP)插入含Gata3基因的載體中，然后導入小鼠受精卵，獲得能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌、雄小鼠各一只。利用熒光蛋白活體成像系統
進行檢測，發現兩者均為陽性RFP轉基因小
鼠。相關限制酶識別序列及限制酶識別位
點如圖甲所示，A、B、C、F、R為不同引
物。
2
4
1
3
題號
5
6
(1)在PCR反應溶液中常添加________，其作用是______________
_____________。在利用PCR擴增RFP編碼區序列的過程中，需要設計引物F和R，在兩個引物的_____(填“3′”或“5′”)端需分別插入________________的限制酶識別序列，以使RFP基因能正確插入載體中。用于擴增RFP編碼區序列的引物需滿足的條件是___
________________________________________________。
(2)在RFP基因的擴增及重組載體的構建過程中，需要的工具酶有______________________________________。
2
4
1
3
題號
5
6
Mg2+
激活DNA聚合
酶的活性
5′
SalⅠ、EcoRⅠ
分
別與兩條模板鏈(RFP編碼區序列)3′端的堿基序列互補
Taq DNA聚合酶、DNA連接酶、限制酶
(3)將實驗獲得的兩只雌、雄雜合子小鼠(P)進行雜交獲得F1若干，選取1～5五只小鼠，從中提取含Gata3基因的相關DNA片段，設計了引物A和C用于PCR擴增，擴增產物電泳結果如圖乙所示，則________小鼠是Gata3-RFP基因純合子小鼠；若用引物A和B進行PCR擴增，________(填“能”或“不能”)區分RFP轉基因陽性小鼠中的雜合子和純合子，原因是________________________
___________________________________________。
2
4
1
3
題號
5
6
1和5
不能
兩種陽性小鼠提取的相關
DNA片段擴增產物的電泳結果均只有一條條帶
(4)為制備大量單鏈DNA片段，研究人員常采用不對稱PCR技術。其基本原理是采用不等量的一對引物，經若干次循環后，低濃度的引物(限制性引物)被消耗盡，以后的循環只產生高濃度引物(非限制性引物)的延伸產物，結果獲得大量單鏈DNA(ss-DNA)。若反應體系中原有100個模板DNA，最初10個循環后限制性引物耗盡，再進行20個循環，理論上可制備ss-DNA__________個(用科學計數法表示)，在這30個循環中ss-DNA的產生量主要受______________________________的影響。
2
4
1
3
題號
5
6
2.048×106
限制性引物和非限制性引物比例
[解析]　(1)PCR的全稱是聚合酶鏈式反應，真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活，所以PCR反應溶液中一般要添加Mg2+，其作用是激活DNA聚合酶的活性。若要對RFP基因進行擴增，需在引物的5′端添加限制酶識別序列，因為引物對應區段也屬于調控序列，若在3′端添加限制酶識別序列，會導致限制酶的切割位點位于調控序列內部，進行相應酶切時，調控序列會被破壞。RFP基因的終止子在右側(即轉錄方向為從左到右)，故插入的調控序列應顛倒進行插入，即設計時：R引物末端插入對應下方載體的MunⅠ酶切位點，F引物末端插入對應下方載體的XhoⅠ
2
4
1
3
題號
5
6
酶切位點，又因為RFP基因中含有的XhoⅠ和MunⅠ酶切位點，因此不能用XhoⅠ和MunⅠ酶來切割，否則會破壞基因序列。結合題干中所給的5種限制酶的識別序列，XhoⅠ和SalⅠ互為同尾酶(即切割不同的DNA片段但產生相同的黏性末端的一類限制性內切酶)；MunⅠ和EcoRⅠ互為同尾酶。因此可通過使用同尾酶進行替代，即剪切擴增產物時，F末端添加的序列所對應的限制酶應選擇SalⅠ，這樣可以與下方載體中XhoⅠ的酶切位點結合；同理R末端應選用與MunⅠ同尾的EcoRⅠ剪切。這樣利用產生相同黏性末端的同尾酶對擴增產物和載體進行酶切，可以保證既能得到有
2
4
1
3
題號
5
6
效片段，又能使之正確轉錄。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，由于擴增目的基因時有兩條模板鏈，設計引物時，兩種引物要分別與兩條模板鏈3′端的堿基序列互補。(2)在RFP基因的擴增及重組載體的構建過程中，需要限制酶，且載體構建過程中用到DNA擴增技術，所以還需要Taq DNA聚合酶，載體構建完成還需要DNA連接酶將DNA片段連接起來。(3)Gata3-RFP基因為大片段，故結合圖乙可知1和5小鼠是Gata3-RFP基因純合子小鼠。由圖乙可知，RFP轉基因陽性小鼠中的雜合子和純合子兩種陽性小鼠提取的相關DNA片段擴增產物的電泳結果均只有一條條帶，故用引物A和B進行PCR擴增，不能區分RFP轉基因陽性小鼠中的雜合子和純合。(4)100個模板DNA，
2
4
1
3
題號
5
6
最初10個循環后限制性引物耗盡，再進行20個循環，理論上可制備ss-DNA：100×20×210＝2.048×106。根據題干“經若干次循環后，低濃度的引物(限制性引物)被消耗盡，以后的循環只產生高濃度引物(非限制性引物)的延伸產物”可知，該過程中ss-DNA的產生量主要受限制性引物和非限制性引物比例的影響。
2
4
1
3
題號
5
6
題組2 DNA片段的擴增及電泳鑒定
3．(2024·湖北武漢二模)油菜的綠葉對黃化葉為顯性。與綠葉基因相比，黃化葉基因有一個堿基對發生了改變，從而出現一個限制酶B的酶切位點。為鑒定某綠葉油菜的基因型，提取其DNA進行了PCR和電泳。下列敘述正確的是(　　)
A．需設計能與目的基因結合的雙鏈DNA作為PCR引物
B．應在PCR擴增體系中添加Mg2+，以激活DNA聚合酶
C．可適當降低復性的溫度，以減少PCR中非特異性條帶的產生
D．用酶B作用后進行電泳，若有2條電泳條帶可判斷為雜合子
2
4
1
3
題號
5
6
√
B　[PCR引物一般是單鏈DNA，A錯誤；PCR過程中用到了緩沖液，緩沖液中一般要添加Mg2+用于激活DNA聚合酶，B正確；復性溫度過低會增加PCR中非特異性條帶，C錯誤；用酶B作用后進行電泳，得到2條條帶，據此無法判斷是否為雜合子，D錯誤。]
2
4
1
3
題號
5
6
4．(2024·廣東梅州二模)光敏色素基因在調節作物生長發育中具有重要作用。為探討玉米中光敏色素基因A(含大約256個堿基對)在棉花種質資源創制中的利用價值，研究人員將光敏色素基因A轉入棉花中，對棉花受體細胞進行檢測，并通過電泳技術分析結果。該過程所用質粒與含光敏色素基因的DNA上相關限制酶的酶切位點分別如圖甲、乙所示，電泳檢測結果如圖丙。下列相關敘述正確的是(　　)
2
4
1
3
題號
5
6
A．為構建正確連接的表達載體，應選用
BamHⅠ和HindⅢ這兩種限制酶
B．PCR擴增目的基因過程中每次循環都要經
歷一次升溫和兩次降溫
C．表達載體導入受體細胞后，可用含四環素
的選擇培養基進行初步篩選
D．由圖丙電泳結果可知，1、2、3、4號轉基因棉花均培育成功
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4
1
3
題號
5
6
√
C　[由圖分析可知，構建基因表達載體時，應選用BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶，A錯誤；PCR反應過程中每次循環都要經歷目的各不相同的兩次升溫(第一次使目的基因變性，第二次使目的基因延伸)和一次降溫(使目的基因復性)，B錯誤；在構建基因表達載體的過程中，卡那霉素抗性基因被破壞，而四環素抗性基因在目的基因表達載體中存在，因此，在表達載體導入受體細胞后，可用含四環素的選擇培養基進行初步篩選，C正確；光敏色素基因A含大約256個堿基對，由圖丙電泳結果可知，1、2、3、4號均成功導入光敏色素基因A，但轉基因棉花是否培育成功還需要進行生物個體水平上的鑒定，D錯誤。]
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4
1
3
題號
5
6
題組3 DNA的粗提取及鑒定實驗
5．(2024·山東青島一模)“DNA的粗提取與鑒定”的實驗步驟：研磨→去雜質→析出→鑒定。某研究小組欲探究不同的去雜質方法對實驗結果的影響，實驗結果如下表所示。下列說法錯誤的是
(　　)
2
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1
3
題號
5
6
去雜質方式 沉淀質量/g DNA濃度/(ng/μL) OD260/OD280 二苯胺鑒定
離心 0.068 81.5 1.53 藍色
注：OD260與OD280的比值可檢查DNA純度。純DNA的OD260/OD280為1.8，當存在蛋白質污染時，這一比值會明顯降低。
2
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1
3
題號
5
6
去雜質方式 沉淀質量/g DNA濃度/(ng/μL) OD260/OD280 二苯胺鑒定
4 ℃冰箱靜置 0.102 8 336.4 1.41 藍色
A．豬肝和菜花均可作為提取DNA的材料
B．對研磨液進行離心是為了加速DNA的沉淀
C．離心法可以獲得更高純度的DNA
D．析出時的離心轉速明顯高于去雜質時的離心轉速
2
4
1
3
題號
5
6
√
B　[DNA的粗提取與鑒定實驗中，應選擇富含DNA的材料，豬肝和菜花均可作為提取DNA的材料，A正確；離心研磨液的目的是加速沉淀，離心能夠加速細胞膜、細胞器、一些較大雜質的沉淀，離心法可以獲得更高純度的DNA，B錯誤，C正確；析出時的離心轉速明顯高于去雜質時的離心轉速，D正確。]
2
4
1
3
題號
5
6
題組4 蛋白質工程及應用
6．(2024·天津和平區二模)人工接種純種毛霉生產的腐乳滋味平淡、香氣不佳，研究人員欲從自然發酵的傳統腐乳中篩選出新的毛霉菌株改良腐乳風味。他們想通過改造M4菌株形成新的單菌株毛霉發酵工藝，下圖為M4菌株改造的基本思路。關于圖中M4菌株改造的基本思路，
下列說法錯誤的是(　　)
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1
3
題號
5
6
A．預期的A指活力更高的蛋白酶或脂肪酶
B．獲得A的基本策略是定點突變
C．獲取目的基因時可采用PCR技術
D．預期產品一定具備預期的蛋白質功能
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4
1
3
題號
5
6
√
D　[腐乳制作的原理主要是利用毛霉等微生物產生的蛋白酶、脂肪酶的催化作用，蛋白質最終被水解為氨基酸，脂肪被水解為甘油和脂肪酸，故預期的A指活力更高的蛋白酶或脂肪酶，A正確；根據應有的氨基酸序列，推測基因的堿基序列，進而可通過定點突變獲取目的基因，B正確；獲取目的基因時可采用PCR技術，該技術是體外擴增目的基因的技術，可實現短時間獲得大量目的基因，C正確；理論上預期產品應該具備預期的蛋白質功能，但在實際操作過程中可能存在技術上或者其他方面的問題，可能導致獲得的蛋白質沒有相應的功能，D錯誤。]
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題號
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課后限時集訓(十三)　細胞工程和基因工程
題號
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6
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9
10
11
12
13
(建議用時：30分鐘)
一、選擇題
1．(2024·甘肅卷)蘭州百合栽培過程中易受病毒侵染，造成品質退化。某研究小組嘗試通過組織培養技術獲得脫毒苗，操作流程如下圖。下列敘述正確的是(　　)
14
A．①為脫分化過程，1號培養基中的愈傷組織是排列規則的薄壁組織團塊
B．②為再分化過程，愈傷組織細胞分化時可能會發生基因突變或基因重組
C．3號培養基用于誘導生根，其細胞分裂素濃度與生長素濃度的比值大于1
D．百合分生區附近的病毒極少，甚至無病毒，可以作為該研究中的外植體
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D　[在脫分化過程中，1號培養基中的愈傷組織是排列不規則的薄壁組織團塊，A錯誤；愈傷組織細胞分化時可能會發生基因突變，但基因重組發生在減數分裂過程中，而愈傷組織細胞的分化過程是有絲分裂，所以不會發生基因重組，B錯誤；3號培養基用于誘導生根，其細胞分裂素濃度與生長素濃度的比值應該小于1，C錯誤；百合分生區附近的病毒極少，甚至無病毒，因此可以作為該研究中的外植體，D正確。]
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2．(2024·湖北武漢模擬預測)青霉菌(屬真菌)發酵為高耗氧過程，透明顫菌(屬細菌)可通過在低氧條件下高表達血紅蛋白以促進氧氣供應和增強細胞呼吸。下圖為將透明顫菌的血紅蛋白引入青霉菌的方案。下列說法錯誤的是(　　)
13
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√
A．處理①、②中都可以用溶菌酶去除細胞壁
B．處理③可用電融合法或者聚乙二醇融合法
C．處理④需將融合細胞接種在缺乏甲硫氨酸和精氨酸的培養基上
D．為驗證方案是否成功可在低氧條件下培養雜種菌株并檢測其密度
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A　[透明顫菌屬于細菌，細胞壁的成分主要是肽聚糖，可用溶菌酶去除細胞壁，但青霉菌是真菌，細胞壁成分主要是幾丁質，不能用溶菌酶去除細胞壁，A錯誤；處理③可用物理法電融合法或化學法聚乙二醇等誘導融合，B正確；處理④在缺乏甲硫氨酸和精氨酸的培養基培養融合細胞，能夠生長的即為雜種菌株，C正確；青霉菌(屬真菌)發酵為高耗氧過程，透明顫菌(屬細菌)可通過在低氧條件下高表達血紅蛋白以促進氧氣供應和增強細胞呼吸，為驗證方案是否成功可在低氧條件下培養雜種菌株并檢測其密度，D正確。]
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3．(2024·福建福州模擬)植物體細胞通常被誘導為愈傷組織后才能表現全能性。研究發現，愈傷組織的中層細胞是根或芽再生的源頭干細胞，其在不同條件下，通過基因的特異性表達調控生長素、細胞分裂素的作用，表現出不同的效應(見下表)。已知生長素的生理作用大于細胞分裂素時有利于根的再生；反之，有利于芽的再生。下列推論合理的是(　　)
條件 基因表達產物和相互作用 效應
① WOX5 維持未分化狀態
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A．WOX5失活后，中層細胞會維持干細胞特性
B．WOX5＋PLT可能有利于愈傷組織中生長素的積累
C．ARR5促進細胞分裂素積累或提高細胞對細胞分裂素的敏感性
D．體細胞中生長素和細胞分裂素具有協同作用
條件 基因表達產物和相互作用 效應
② WOX5＋PLT 誘導出根
③ WOX5＋ARR2，抑制ARR5 誘導出芽
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B　[根據表格信息可知，WOX5能維持未分化狀態，使植物細胞保持分裂能力強、較高的全能性，若WOX5失活后，中層細胞會喪失干細胞分裂能力強、分化程度低的特性，A錯誤；由題干信息“生長素的生理作用大于細胞分裂素時有利于根的再生”，再結合表格信息，WOX5＋PLT可能誘導出根，可推測WOX5＋PLT可能有利于愈傷組織中生長素的積累，B正確；由題意可知，生長素的生理作用小于細胞分裂素時有利于芽的再生，而抑制ARR5能誘導出芽，可知ARR5被抑制時細胞分裂素較多，故可推測ARR5抑制細胞分裂素積累或降低細胞對細胞分裂素的敏感性，C錯誤；出芽或出根都是生長素與細胞分裂素含量不均衡時才會發生，故可推測體細胞中生長素和細胞分裂素的作用可能相互抑制，D錯誤。]
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4．(2024·山東聊城二模)灌流式培養是在細胞培養管內，一邊不斷注入新鮮培養基，一邊將培養液的上清液不斷移出。區別傳統的懸浮培養，灌流式培養可避免因細胞密度過大、有害代謝物積累等因素而使細胞分裂受阻的現象出現。下列敘述正確的是(　　)
A．灌流式培養的細胞會貼壁生長，但不會出現接觸抑制的現象
B．灌流是在細胞密度達到一定濃度或者營養物質低于一定濃度時進行的
C．灌流速率越高，營養物質利用越充分
D．向培養管注入的新鮮培養基中補充動物血清是為了防止雜菌污染
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√
B　[據題分析可知，灌流式培養的動物細胞可以避免出現貼壁生長的現象，A錯誤；灌流是在細胞密度達到一定濃度或者營養物質低于一定濃度時進行的，B正確；過高的灌流速率，會導致培養的細胞不能及時利用營養物質，而使營養物質不能得到充分利用，C錯誤；補充動物血清是為了提供動物細胞培養所需要的營養物質和某種生長因子，D錯誤。]
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5．(2024·湖北華中師大附中模擬)慢性乙型肝炎由乙肝病毒(HBV)感染引起，HBV在患者體內持續存在且含量較高。E肽是HBV的一種外殼蛋白，可作為抗原被宿主免疫系統識別并應答。為治療和預防慢性乙肝，科研人員設計了以下方案，合理的是(　　)
A．輸入乙肝康復者的血清可治療和長期預防乙肝
B．將E蛋白重組到腺病毒基因組中可制成乙肝疫苗
C．利用單克隆抗體技術獲得的抗E蛋白抗體，可用于檢測乙肝
D．將E蛋白對應的mRNA制成疫苗，可刺激機體在血漿中表達出E蛋白
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√
C　[乙肝康復者的血清中含有對抗乙肝病毒的抗體，因而可治療乙肝，但抗體不具有長久性，A錯誤；將E蛋白的相關基因重組到腺病毒基因組中可制成乙肝疫苗，B錯誤；利用單克隆抗體技術獲得的抗E蛋白抗體，可用于檢測乙肝病毒的存在，C正確；將E蛋白對應的mRNA制成疫苗，可進入細胞內編碼出相應的抗原蛋白，進而刺激機體產生特異性免疫反應，而E蛋白的合成過程不會發生在血漿中，D錯誤。]
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6．(2024·甘肅卷)甘加藏羊是甘肅高寒牧區的優良品種，是季節性發情動物，每年產羔一次，每胎一羔，繁殖率較低。為促進畜牧業發展，研究人員通過體外受精、胚胎移植等胚胎工程技術提高藏羊的繁殖率，流程如下圖。下列敘述錯誤的是(　　)
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14
A．藏羊甲需用促性腺激素處理使其卵巢卵泡發育和超數排卵
B．藏羊乙的獲能精子能與剛采集到的藏羊甲的卵母細胞受精
C．受體藏羊丙需和藏羊甲進行同期發情處理
D．后代丁的遺傳物質來源于藏羊甲和藏羊乙
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B　[促性腺激素能作用于卵巢，藏羊甲需用促性腺激素處理使其卵巢卵泡發育和超數排卵，A正確；從卵巢中剛采集的卵母細胞需培養成熟(減數分裂Ⅱ中期)后才可與獲能的精子進行體外受精，B錯誤；在胚胎移植前要對接受胚胎的受體和供體進行同期發情處理，使受體的生理狀況相同，因此受體藏羊丙需和藏羊甲進行同期發情處理，C正確；后代丁是由藏羊甲的卵細胞和藏羊乙的精子結合形成的受精卵發育而來，因此后代丁的遺傳物質來源于藏羊甲和藏羊乙，D正確。]
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7．(2024·湖南卷)某同學將質粒DNA進行限制酶酶切時，發現DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是(　　)
A．限制酶失活，更換新的限制酶
B．酶切條件不合適，調整反應條件如溫度和酶的用量等
C．質粒DNA突變導致酶識別位點缺失，更換正常質粒DNA
D．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶
13
14
B　[限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應更換新的限制酶，A正確；酶切條件不合適通常會使切割效果下降，調整反應條件如溫度和pH等，調整酶的用量沒有作用，B錯誤；質粒DNA突變會導致限制酶識別位點缺失，進而造成限制酶無法進行切割，此時應更換為正常質粒，C正確；質粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。]
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8．(2024·廣東汕頭二模)當水稻處于高Na＋環境時，細胞膜上的轉運蛋白SOS1可借助膜兩側的H＋濃度梯度將Na＋排到細胞外。某研究團隊擬構建SOS1基因和綠色熒光蛋白基因(GFP)的融合基因轉入水稻基因組，以期增強水稻的抗鹽能力。下列敘述錯誤的是(　　)
13
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A．水稻通過轉運蛋白SOS1以主動運輸的方式將Na＋運輸到細胞外
B．將SOS1基因插入表達載體中不可選用限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ
C．檢測GFP基因是否以正確方向連接到質粒可用引物F1和R2進行擴增
D．檢測F2和R2的擴增結果能確定水稻是否為SOS1-GFP基因的純合子
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D　[由題意可知，當水稻處于高Na＋環境時，細胞膜上的轉運蛋白SOS1可借助膜兩側的H＋濃度梯度以主動運輸的方式將Na＋排到細胞外，A正確；SOS1基因含有限制酶BamHⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ的酶切位點，所以將SOS1基因插入表達載體中不可選用限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ，B正確；檢測GFP基因是否以正確方向連接到質粒可用引物F1和R2進行擴增，C正確；F2和R2為綠色熒光蛋白基因(GFP)的引物，無法檢測到是否含有SOS1基因，D錯誤。]
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9．(2024·江西卷)γ-氨基丁酸在醫藥等領域有重要的應用價值。利用L-谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脫羧是高效生產γ-氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導入生產菌株E.coliA。構建了以L-谷氨酸鈉為底物高效生產γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。
下列敘述正確的是(　　)
13
14
A．上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB
B．E.coliB發酵生產γ-氨基丁酸時，L-谷氨酸鈉的作用是供能
C．E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質粒
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A　[題意顯示，研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導入生產菌株E.coliA，說明可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB，A正確；題意顯示，用L-谷氨酸脫羧酶(gadB)催化L-谷氨酸脫羧是高效生產γ-氨基丁酸的重要途徑之一，E.coliB中能表達L-谷氨酸脫羧酶(gadB)，因此可用E.coliB發酵生產γ-氨基丁酸，該過程中L-谷氨酸鈉是反應原料，而非起供能作用，B錯誤；將目的基因(gadB)導入菌株E.coliA構建高效生產γ-氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ-氨基丁酸，C錯誤；據題中信息無法推斷出是否有其他酶能夠替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質粒，D錯誤。]
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10．(2024·湖北武漢二模)水中E物質污染會導致魚類雌性化異常。將綠色熒光蛋白(GFP)基因、Ga14蛋白基因等轉入斑馬魚，可用于監測水體E物質，下圖中ERE和UAS是兩種誘導型啟動子，分別被E物質—受體復合物和Ga14蛋白特異性激活，啟動下游基因表達。下列敘述錯誤的是(　　)
13
14
A．斑馬魚的某些細胞存在E物質的受體
B．ERE直接驅動了GFP基因的表達
C．用于監測E物質污染的轉基因斑馬魚最好是不育的
D．基因表達載體最好以顯微注射法導入斑馬魚受精卵
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B　[將綠色熒光蛋白(GFP)基因、Ga14蛋白基因等轉入斑馬魚，可用于監測水體 E 物質，推測斑馬魚的某些細胞存在 E 物質的受體，A正確；結合題圖，ERE誘導Ga14基因轉錄，其翻譯產物Ga14蛋白與USA結合驅動了GFP基因的表達，這是一個間接驅動而非直接驅動的過程，B錯誤；用于監測 E 物質污染的轉基因斑馬魚最好是不育的，避免因有性生殖帶來的基因污染，C正確；基因表達載體最好以顯微注射法導入斑馬魚受精卵，受精卵全能性高，基因成功表達的概率大，D正確。]
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11．(不定項)(2024·湖南岳陽模擬)東南景天中的HMA3基因能編碼Cd(鎘)轉運蛋白，Cd轉運蛋白能將土壤中的Cd吸收進體內，現欲將東南景天中的HMA3基因轉入欒樹，以增強欒樹對Cd的富集能力，從而有效治理Cd污染，科研人員利用下圖結構構建重組DNA，圖1為HMA3基因所在DNA示意圖，圖2為質粒結構示意圖，下列敘述錯誤的是(　　)
13
14
A．欲獲取HMA3基因，可用引物1、引物2進行PCR循環至少2輪獲得
B．用凝膠電泳鑒定PCR產物，引物1、引物2擴增的產物可得3條條帶
C．構建含HMA3和GFP基因的重組質粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的識別序列
D．用含潮霉素的培養基篩選受體細胞，能生長的為含重組質粒的受體細胞
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ABD　[由于引物接在了目的基因的兩側，因此經過兩輪PCR后，可獲得與HMA3基因等長的DNA單鏈，故若要獲取HMA3基因，可用引物1、引物2進行PCR循環至少3輪獲得，A錯誤；用凝膠電泳鑒定PCR產物，引物1、引物2擴增的產物可能會得到引物帶、引物二聚體帶、目的擴增產物帶和非目的擴增產物帶等多條不同的條帶，B錯誤；構建含HMA3和GFP基因的重組質粒時，需要有啟動子和終止子序列，又不破壞GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的識別序列，C正確；質粒上含有潮霉素抗性基因，用含潮霉素的培養基篩選受體細胞，能生長的為含重組質粒或含普通質粒的受體細胞，D錯誤。]
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12．(不定項)(2024·山東濰坊三模)CRISPR/Cas9基因編輯技術根據靶基因序列設計向導sgRNA，精確引導核酸酶Cas9切割與sgRNA配對的DNA，相關酶在修復斷裂DNA的過程中會改變連接部位的堿基序列。科研人員通過刪除編碼PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白質的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如圖1所示。將體外轉錄獲得的Cas9mRNA和sgRNA導入小鼠的受精卵中，獲得了12只基因編輯小鼠。利用PCR鑒定小鼠的基因型，電泳結果如圖2所示。已知P1和P2是PCR的引物。下列相關分析錯誤的是(　　)
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A．敲除2、3、4片段引起的變異屬于染色體變異
B．敲除前，根據敲除的位置需要設計3個sgRNA
C．圖2中，4和12個體雜交的子代均為敲除純合子
D．圖2中，3、5、7個體的體內均能檢測到PD-1
題號
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ABD　[據圖分析，將野生型基因內部的部分堿基剪切，改變的是基因內部的堿基序列，屬于可遺傳變異中的基因突變，A錯誤；分析圖1可知，要將基因的2、3、4共3個片段切除，需要設計2個sgRNA，B錯誤；基因敲除后，其核苷酸數量減少，電泳時移動速度快，距離加樣孔的位置遠，4和12個體均為基因敲除純合子，因此4和12個體雜交的子代均為基因敲除純合子，C正確；3個體的基因未敲除，5個體為基因敲除雜合子，7個體為基因敲除純合子，因此3和5體內均能檢測到PD-1，7個體檢測不到PD-1，D錯誤。]
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二、非選擇題
13．(2024·廣東廣州二模)癌癥的免疫療法通過重新激活抗腫瘤的免疫細胞，克服腫瘤的免疫逃逸，科研人員在不斷研究中發現多種免疫治療方法的結合是提高治療效果的途徑之一。請回答下列問題：
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(1)免疫系統能夠識別和清除突變的細胞，這體現了免疫系統的________功能。
(2)由于基因突變，癌細胞表面物質發生改變，如某些種類癌細胞表面高表達膜蛋白PSMA和PD-L1。圖1中PD-L1能抑制T細胞的活化，使癌細胞發生免疫逃逸。臨床上可利用PD-1的單克隆抗體進行癌癥治療，據圖1推測，其原因是_____________________________
____________________________________________________。
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免疫監視
PD-1的單克隆抗體與PD-1結合，
阻斷了PD-1和PD-L1的結合，避免PD-L1抑制T細胞的活化
(3)CD28是T細胞表面受體，T細胞的有效激活依賴于CD28在癌細胞與T細胞結合部位的聚集。因此，科研人員嘗試構建既能結合PSMA，又能結合CD28的雙特異性抗體PSMA×CD28，誘導T細胞定向殺傷癌細胞，如圖2所示。
制備過程：先將________________分別注射到小鼠體內，分離出B淋巴細胞，誘導其與小鼠的骨髓瘤細胞融合，篩選得到________________，再誘導兩種細胞融合。成功融合的細胞會表達兩種L鏈和兩種H鏈，由于__________________會產生多種抗體，因此還需進行篩選，才能獲得所需的雙特異性抗體PSMA×CD28。
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PSMA、CD28
兩種雜交瘤細胞
L鏈和H鏈隨機組合
(4)科研人員將癌細胞和T細胞共同培養，加入不同抗體，比較不同抗體對T細胞活化的作用。實驗各組由活化T細胞產生的細胞因子IL-2含量如圖3所示，實驗結果說明____________________________
___________________________________________________________
____________________________________
____________________________________
_____。
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PSMA×CD28和PD-1單抗聯
合使用能夠顯著激活T細胞，且在一定范圍內激活作用隨抗體濃度
的增加而增強；單獨使用PSMA×CD28或
PD-1單抗都不能顯著激活T細胞(合理即
可)
[解析]　(1)免疫系統能夠識別和清除突變的細胞，這體現了免疫系統的免疫監視功能。
(2)圖1中癌細胞表面的PD-L1和T細胞表面的PD-1結合，抑制T細胞的活化。PD-1的單克隆抗體與PD-1特異性結合，阻斷了PD-L1和PD-1的結合，避免PD-L1抑制T細胞的活化。
(3)制備雙特異性抗體PSMA×CD28，則抗原是CD28和PSMA，將兩種物質分別注射到小鼠體內，分離出兩類B淋巴細胞，將這兩類B淋巴細胞分別和小鼠的骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞，再誘導雜交瘤細胞融合。成功融合的細胞會表達兩種L鏈和兩種H鏈，所需的雙特異性抗體PSMA×CD28是特定的L鏈和H鏈結合形成的，由于L鏈和H鏈隨機組合，因此還需要進行篩選，才能獲得所需的抗體。
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(4)自變量是抗體種類，分析圖3可知，PSMA×CD28和PD-1單抗聯合使用能夠顯著激活T細胞，且在一定范圍內激活作用隨抗體濃度的增加而增強；單獨使用PSMA×CD28或PD-1單抗都不能顯著激活T細胞。
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14．(2024·山東濰坊二模)A蛋白是某種激素合成的關鍵酶。為鑒定該激素合成的部位及生理作用，科研團隊利用無縫克隆技術將A蛋白結合蛋白基因(P基因)與葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合，構建A蛋白檢測探針，通過農桿菌轉化法導入擬南芥進行實驗。相關原理、過程及質粒的結構如下圖所示。
注：①bar為抗草甘膦(一種除草劑)基因，Tetr為四環素抗性基因，Ampr為氨芐青霉素抗性基因；②F1、F2、R1、R2為引物；③BamHⅠ、SmaⅠ、BclⅠ為限制酶。
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注：①bar為抗草甘膦(一種除草劑)基因，Tetr為四環素抗性基因，Ampr為氨芐青霉素抗性基因；②F1、F2、R1、R2為引物；③BamHⅠ、SmaⅠ、BclⅠ為限制酶。
(1)無縫克隆時所需的酶除T5核酸外切酶外還有____________________________。用無縫克隆技術構建GUS-P融合基因的關鍵是R2引物5′端序列與_______________________互補。
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DNA聚合酶和DNA連接酶
F1(或P基因左側)3′端序列
(2)利用雙酶切法將融合基因插入Ti質粒，選用的限制酶為________________。擴增融合基因所需的引物R1和F2應選用下列引物組合為________。
①5′-…CTTGGATGAT-3′
②5′-…TAAGTTGTCT-3′
③5′-…ATTCAACAGA-3′
④5′-…TCTGTTGAAT-3′
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BclⅠ和SmaⅠ
①④
(3)利用農桿菌轉化法將融合基因導入農桿菌、擬南芥細胞的過程中，需要篩選兩次，這兩次篩選分別是________________________
___________________________________________________________
________________________________________________。
(4)葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈藍色，將轉基因擬南芥置于不同培養液中培養一段時間，然后分離不同部位的組織分別加入X-Gluc進行鑒定，結果如下表所示：
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先篩選出能在含四環素培養
基上生長而不能在含氨芐青霉素培養基上生長的農桿菌，再用含草
甘膦的培養基篩選出導入融合基因的擬南芥細胞
分析表明，該激素最主要的合成部位是________，通過實驗結果分析該激素的生理作用是__________________________。
部位 根 莖 葉
完全培養液 藍色 淺藍 淺藍
缺磷培養液 深藍 藍色 淺藍
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根
促進植物對磷元素的吸收
[解析]　(1)由題圖信息可知，利用無縫克隆技術將A蛋白結合蛋白基因(P基因)與葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合，構建A蛋白檢測探針，所以無縫克隆時所需的酶除T5核酸外切酶外還有DNA聚合酶和DNA連接酶。DNA的兩條鏈是反向平行的，用無縫克隆技術構建GUS-P融合基因的關鍵是R2引物5′端序列與F1(或P基因左側)3′端序列互補。
(2)利用雙酶切法將融合基因插入Ti質粒選用的限制酶為BclⅠ和SmaⅠ。根據融合基因的放大圖可知，擴增時以DNA的兩條鏈分別作模板，擴增融合基因所需的引物R1和F2應選用下列引物組合為3′端序列可以與④5′-…TCTGTTGAAT-3′配對，5′端序列的互補鏈可以與①5′-…CTTGGATGAT-3′配對，因此選用的引物組合為①④。
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(3)利用農桿菌轉化法將融合基因導入農桿菌、擬南芥細胞的過程中，需要篩選兩次，這兩次篩選分別是先篩選出能在含四環素培養基上生長而不能在含氨芐青霉素培養基上生長的農桿菌，再用含草甘膦的培養基篩選出導入融合基因的擬南芥細胞。
(4)葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈藍色，根據表格可知，在完全培養液中，只有根呈現藍色，說明該激素最主要的合成部位是根，與完全培養液相比，在缺磷培養液中，根的顏色變為深藍，而在含磷的完全培養液中出現藍色，說明該激素的生理作用是促進植物對磷元素的吸收。
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(教師用書獨具)
(2024·湖南衡陽三模)Ⅰ.復椰子樹屬棕櫚復椰子屬，樹高15～30米，樹干通直，直徑約30厘米，葉呈大扇形，長7米，寬2米，雌雄異株。復椰子樹的雌花從受粉到果實成熟需要10～13年之久，種子發芽期也需3年，而且要求烈日照曬。由于復椰子樹種子形狀奇特，體積龐大(重達20千克，直徑30厘米)有些人將它用作容器，如今復椰子樹已瀕臨滅絕。復椰子果肉煮湯飲服，有治療久咳和止血的功效。有人想到了一個好的方法，制造“人工種子”，解決復椰子樹的種子形成時間漫長的問題。其操作流程如下：
(1)圖中的外植體是___________________________，先用_______沖洗，再消毒。常用的消毒劑是______________________(寫兩種)。
離體的植物器官、組織或細胞
流水
酒精和次氯酸鈉溶液
(2)人工種皮除了有保護作用以外，還要有________性，以滿足胚狀體代謝的需要。為了保證胚狀體在適宜條件下成功發芽發育成幼苗，而不會腐敗變質，人工胚乳除加入適量的養分(如水、無機鹽、有機碳源)外，還可以適當添加農藥、抗生素、有益菌等。為了促進胚狀體的生長發育，還可以向人工種皮中加入一些______________
(填“植物激素”“植物生長調節劑”或“生長素類似物”)。
透氣
植物生長調節劑
Ⅱ.科研人員構建了可表達WRK10-MYC融合蛋白的重組農桿菌 Ti質粒并成功轉化植物細胞得到轉基因植株，該質粒的部分結構如圖2所示，其中Kan為卡那霉素抗性基因，Hyg為潮霉素抗性基因，MYC標簽序列編碼標簽短肽 MYC，WRK10 蛋白為轉錄因子。
(3)位于 Ti 質粒不同位置的卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因的作用分別是_________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________。
圖中啟動子的方向與對應基因轉錄的方向一致，從編碼鏈的角度分析 P1 和 P2方向不同的原因是_________________________________
______________________________________________________。
卡那霉素抗性基因可用于篩選成功轉化的農桿菌(或用于
篩選重組農桿菌或成功導入了質粒的農桿菌)；潮霉素抗性基因可用
于篩選成功轉化的植物細胞(或篩選轉基因植物細胞或成功導入了目
的基因的植物細胞)
潮霉素抗性基因的編碼鏈是b鏈(或
Hyg基因所對應的編碼鏈是b鏈)，WRK10基因的編碼鏈是a鏈
(4)已知利用LP 和 RP擴增結果為大帶，BP 和 RP擴增結果為小帶。可用圖中三引物進行兩次PCR 的方法鑒定轉基因植物后代中的純合轉基因植株。T-DNA 插入植物染色體DNA分子后會抑制原插入位點兩側引物的擴增產物的出現，則純合轉基因植株 PCR 檢測結果為________(填“大帶”“大帶和小帶”或“小帶”)。
小帶
[解析]　(1)進行植物組織培養時，離體的植物器官、組織或細胞被稱為外植體。外植體消毒過程中，用酒精擦拭雙手和超凈工作臺臺面，將流水充分沖洗后的外植體用酒精消毒30 s，然后立即用無菌水清洗2～3次，再用次氯酸鈉溶液處理30 min后，立即用無菌水清洗2～3次。(2)胚狀體相當于種子中的胚，若氧氣不足，細胞無氧呼吸產生酒精，會導致人工種子壞死，故種皮除有保護作用外，還要有透氣性。人工胚乳要為胚狀體的發育提供營養物質，故要加入適量的養分(如水、無機鹽、有機碳源)；外界環境中許多微生物與胚狀體的細胞競爭營養物質，也可能寄生在胚狀體細胞中，故可以適當添加農藥、抗生素、有益菌等；植物生長調節劑是人類合成的，
對植物生長、發育有重要調節作用的化學物質，具有原料廣泛、容易合成、效果穩定等優點，為了促進胚狀體的生長發育，還可以向人工種皮中加入一些植物生長調節劑。(3)構建了可表達WRK10-MYC 融合蛋白的重組農桿菌Ti質粒并成功轉化植物細胞得到轉基因植株，先構建含有重組 Ti 質粒的農桿菌，然后在讓該農桿菌去侵染植物細胞，如圖，Hyg為潮霉素抗性基因，位于T-DNA 片段上，故卡那霉素抗性基因可用于篩選成功轉化的農桿菌(或用于篩選重組農桿菌或成功導入了質粒的農桿菌)；潮霉素抗性基因可用于篩選成功轉化的植物細胞(或篩選轉基因植物細胞或成功導入了目的基因的
植物細胞)。基因轉錄的方向是5′→3′，而啟動子的方向與對應基因轉錄的方向一致，故P1和P2方向不同的原因是潮霉素抗性基因的編碼鏈是 b 鏈(或Hyg基因所對應的編碼鏈是b鏈)，WRK10基因的編碼鏈是a鏈。(4)BP位點在T-DNA片段上，又T-DNA 插入植物染色體 DNA 分子后會抑制原插入位點兩側引物的擴增產物的出現，故純合轉基因植株 PCR 檢測結果為 BP 和 RP 擴增的小帶。

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