資源簡介

命題點專訓(十四)
1．(1)PCR　②　(2)固體　含重組質粒(抗潮霉素)的菌株　目的基因成功導入煙草細胞　(3)用一系列濃度的鎘處理CK植株、6號植株和7號植株，檢測并比較各種處理下3株植物的NtNRAMP表達量
2．(1)3′　提高　(2)Ⅰ、Ⅱ的長度之和與Ⅲ基本相等　(3)使融合基因能夠在受體細胞中穩定存在，并遺傳給下一代，且使融合基因表達和發揮作用　空白濾紙片、含雜合抗菌肽NK-LPd的濾紙片
3．(1)磷酸二酯　①⑤　(2)RNA聚合酶識別和結合的部位(啟動轉錄過程)　相反　(3)BclⅠ和SmaⅠ　防止酶切后的質粒、目的基因自身環化；保證OsMYB56基因和酶切后的質粒定向連接　T4 DNA連接酶　(4)提取細胞的mRNA，逆轉錄得到cDNA后進行PCR擴增；根據OsMYB56基因設計探針進行核酸分子雜交檢測OsMYB56基因是否成功插入水稻染色體DNA中或者其是否轉錄出mRNA；通過抗原—抗體雜交技術檢測OsMYB56基因是否表達出蛋白質(答出1點即可)命題點專訓(十四)　生物技術與工程(非選擇題)
1．(2024·廣東汕頭一模)鎘(Cd)是重金屬污染物，具有極強毒性。煙草作為重要的經濟作物，在生長過程中容易富集Cd，Cd通過煙氣進入人體，長期積累可能會引發疾病。NtNRAMP3是定位于液泡膜參與Cd轉運的蛋白，研究人員以普通煙草為材料，通過轉基因技術研究NtNRAMP基因的功能，為研究煙草在Cd脅迫中的適應機制提供理論基礎。回答下列問題：
(1)從數據庫獲得NtNRAMP基因的序列，設計引物F和R后利用____________技術擴增得到NtNRAMP基因的cDNA片段，測序鑒定。使用AscⅠ、SpeⅠ和DNA連接酶等酶將NtNRAMP基因連接到pCambia300-221質粒的T-DNA區域中(圖1為該T-DNA的左邊界至右邊界)，得到重組質粒pCambia300-NtNRAMP。圖示使用AscⅠ、SpeⅠ的過程是________(填圖中的數字)。
(2)將pCambia300-NtNRAMP轉入農桿菌，培養基中添加了瓊脂與潮霉素，兩者的作用分別是形成________培養基以便得到單菌落、篩選_______________。含pCambia300-NtNRAMP的農桿菌與煙草愈傷組織共培養，培養后得到12株煙草植株。提取煙草細胞的核DNA用引物F和R進行擴增，對轉基因煙草進行鑒定。若擴增到特異性DNA片段，則說明____________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)上述煙草植株經PCR檢測和電泳后，結果如圖2所示：
注：CK為陰性對照；1～12為待檢測植株；A為空白對照；B為pCambia300-NtNRAMP。
圖2
為進一步研究轉基因煙草在不同鎘濃度脅迫下的NtNRAMP表達量變化，請從上述植株選取適宜的材料，簡要寫出實驗探究思路：______________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
_________________________________________(要求寫出所選3株植株的編號)。
2．(2024·山東德州二模)抗菌肽是一類廣泛存在于自然界中的多肽，對細菌、真菌、寄生蟲和病毒具有廣泛的抑制作用。科研人員將抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因進行融合形成雜合肽NK-LPd基因(部分過程如圖1所示)，從而獲得具有更高抗菌活性的雜合抗菌肽。
(1)DNA聚合酶能夠從引物的____________(填“3′”或“5′”)端開始連接脫氧核苷酸。若設計的引物較長，為提高PCR的準確度需要適當________(填“提高”或“降低”)復性溫度。
(2)圖2為PCR1擴增產物(Ⅰ、Ⅱ)和PCR2擴增產物(Ⅲ)的凝膠電泳實驗結果，根據結果可說明基因融合成功，判斷依據是_______________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)在轉化前，需要先構建含NK-LPd基因的表達載體，其目的是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________；
在成功轉化的酵母菌中提純得到雜合抗菌肽NK-LPd，為驗證NK-LPd對大腸桿菌的抑菌效果，先將大腸桿菌涂布在圖3的平板上，再放置濾紙片。根據圖示實驗結果推測，在A、D區域放置的濾紙片分別為__________________________。
3．(2024·湖南教學聯盟聯考)土壤鹽漬化影響水稻生長發育，將水稻耐鹽堿基因OsMYB56導入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中，培育耐鹽堿水稻新品種，其操作流程及可能用到的限制酶如圖，其中bar為抗除草劑基因，Tetr為四環素抗性基因，Ampr為氨芐青霉素抗性基因，①～⑦表示操作過程。請據圖回答問題。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sac3AⅠ
識別位點及切割位點
(1)過程①利用PCR擴增OsMYB56基因時加入的酶催化________鍵的形成，還需要添加引物，應選用下列引物組合________。
①5′-CTTGGATGAT-3′
②5′-TAAGTTGTCT-3′
③5′-TAGTAGGTTC-3′
④5′-ATTCAACAGA-3′
⑤5′-TCTGTTGAAT-3′
⑥5′-ATCATCCAAG-3′
(2)根據基因表達載體的結構組成分析，Ti質粒中的CaMV35S的功能是_______________。基因表達載體中，OsMYB56基因和bar基因編碼鏈的方向________(填“相同”或“相反”)。
(3)過程③應選用限制酶______________切割質粒，利用所選限制酶進行操作的優勢是______________________________________________________________
_____________________________________________________(答兩點)，
切割后需要用________________(寫具體名稱)進行連接才能獲得重組質粒。
(4)若要鑒定OsMYB56基因是否表達，從分子水平上檢測的方法有____________________________________________________________________
________________________________________________(答出一種即可)。
21世紀教育網(www.21cnjy.com)(共33張PPT)
命題點專訓(十四)　
生物技術與工程(非選擇題)
1．(2024·廣東汕頭一模)鎘(Cd)是重金屬污染物，具有極強毒性。煙草作為重要的經濟作物，在生長過程中容易富集Cd，Cd通過煙氣進入人體，長期積累可能會引發疾病。NtNRAMP3是定位于液泡膜參與Cd轉運的蛋白，研究人員以普通煙草為材料，通過轉基因技術研究NtNRAMP基因的功能，為研究煙草在Cd脅迫中的適應機制提供理論基礎。回答下列問題：
(1)從數據庫獲得NtNRAMP基因的序列，設計引物F和R后利用_______技術擴增得到NtNRAMP基因的cDNA片段，測序鑒定。使用AscⅠ、SpeⅠ和DNA連接酶等酶將NtNRAMP基因連接到pCambia300-221質粒的T-DNA區域中(圖1為該T-DNA的左邊界至右邊界)，得到重組質粒pCambia300-NtNRAMP。圖示使用AscⅠ、SpeⅠ的過程是________(填圖中的數字)。
PCR
②
(2)將pCambia300-NtNRAMP轉入農桿菌，培養基中添加了瓊脂與潮霉素，兩者的作用分別是形成________培養基以便得到單菌落、篩選____________________________。含pCambia300-NtNRAMP的農桿菌與煙草愈傷組織共培養，培養后得到12株煙草植株。提取煙草細胞的核DNA用引物F和R進行擴增，對轉基因煙草進行鑒定。若擴增到特異性DNA片段，則說明_________________________。
固體
含重組質粒(抗潮霉素)的菌株
目的基因成功導入煙草細胞
(3)上述煙草植株經PCR檢測和電泳后，結果如圖2所示：
注：CK為陰性對照；1～12為待檢測植株；A為空白對照；B為pCambia300-NtNRAMP。
圖2
為進一步研究轉基因煙草在不同鎘濃度脅迫下的NtNRAMP表達量變化，請從上述植株選取適宜的材料，簡要寫出實驗探究思路：___________________________________________________________
_____________________________________(要求寫出所選3株植株的編號)。
用一系列濃度的鎘處理CK植株、6號植株和7號植株，檢測并比較各種處理下3株植物的NtNRAMP表達量
[解析]　(1)擴增DNA片段的方法是PCR技術；基因工程的工具酶有限制酶和DNA連接酶，因此推測AscⅠ、SpeⅠ是限制酶，圖中②過程是構建重組質粒的過程，因此②過程用到了AscⅠ、SpeⅠ對目的基因和質粒進行切割。
(2)瓊脂的作用是配制固體培養基，便于得到單菌落，根據題意可知，含重組質粒的農桿菌中有潮霉素抗性基因，可在含潮霉素的培養基上生長，因此培養基中加潮霉素的作用是篩選含重組質粒(抗潮霉素)的菌株。提取煙草細胞的核DNA用引物F和R進行擴增，對轉基因煙草進行鑒定，可通過對DNA擴增后進行鑒定，若擴增到特異性DNA片段則說明目的基因成功導入煙草細胞。
(3)要研究轉基因煙草在不同鎘濃度脅迫下的NtNRAMP表達量，需配制一系列濃度的鎘溶液，選取圖2中的陰性對照植株(CK)作為對照，還需選取具有重組質粒的植株，也就是圖中與B條帶寬度接近的植株，即6號和7號植株，探究思路為用一系列濃度的鎘處理CK植株、6號植株和7號植株，檢測并比較各種處理下3株植物的NtNRAMP表達量。
2．(2024·山東德州二模)抗菌肽是一類廣泛存在于自然界中的多肽，對細菌、真菌、寄生蟲和病毒具有廣泛的抑制作用。科研人員將抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因進行融合形成雜合肽NK-LPd基因(部分過程如圖1所示)，從而獲得具有更高抗菌活性的雜合抗菌肽。
(1)DNA聚合酶能夠從引物的________(填“3′”或“5′”)端開始連接脫氧核苷酸。若設計的引物較長，為提高PCR的準確度需要適當________(填“提高”或“降低”)復性溫度。
3′
提高
(2)圖2為PCR1擴增產物(Ⅰ、Ⅱ)和PCR2擴增產物(Ⅲ)的凝膠電泳實驗結果，根據結果可說明基因融合成功，判斷依據是__________________________________。
Ⅰ、Ⅱ的長度之和與Ⅲ基本相等
(3)在轉化前，需要先構建含NK-LPd基因的表達載體，其目的是___________________________________________________________
______________________；在成功轉化的酵母菌中提純得到雜合抗菌肽NK-LPd，為驗證NK-LPd對大腸桿菌的抑菌效果，先將大腸桿菌涂布在圖3的平板上，再放置濾紙片。根據圖示實驗結果推測，在A、D區域放置的濾紙片分別為
_________________________
_____________________。
使融合基因能夠在受體細胞中穩定存在，并遺傳給下一代，且使融
合基因表達和發揮作用
空白濾紙片、含雜合抗菌肽
NK-LPd的濾紙片
[解析]　(1)DNA聚合酶在DNA復制過程中，從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，因為DNA聚合酶只能催化脫氧核苷酸連接到已有的核苷酸片段的3′端上。如果設計的引物較長，那么引物與模板之間的結合會更加穩定，因此需要適當提高復性溫度，以確保引物與模板之間的特異性結合。
(2)圖2為PCR1擴增產物(Ⅰ、Ⅱ)和PCR2擴增產物(Ⅲ)的凝膠電泳實驗結果，根據結果可說明基因融合成功，判斷依據是Ⅰ、Ⅱ的長度之和與Ⅲ基本相等。
(3)在轉化前，需要先構建含NK-LPd基因的表達載體，其目的是使融合基因能夠在受體細胞中穩定存在，并遺傳給下一代，且使融合基因表達和發揮作用；在成功轉化的酵母菌中提純得到雜合抗菌肽NK-LPd，為驗證NK-LPd對大腸桿菌的抑菌效果，先將大腸桿菌涂布在圖3的平板上，再放置濾紙片，根據抑菌圈直徑可以判斷抑菌效果的強弱，在圖3中A區域未出現抑菌圈，推測放置的濾紙片為空白濾紙片，D區域抑菌圈最大，根據題干信息可知，將抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因進行融合形成雜合肽NK-LPd基因，從而獲得具有更高抗菌活性的雜合抗菌肽，所以推測D區域放置的濾紙片為含雜合抗菌肽NK-LPd的濾紙片。
3．(2024·湖南教學聯盟聯考)土壤鹽漬化影響水稻生長發育，將水稻耐鹽堿基因OsMYB56導入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中，培育耐鹽堿水稻新品種，其操作流程及可能用到的限制酶如圖，其中bar為抗除草劑基因，Tetr為四環素抗性基因，
Ampr為氨芐青霉素抗性基因，①～⑦
表示操作過程。請據圖回答問題。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sac3AⅠ
識別位點及切割位點
(1)過程①利用PCR擴增OsMYB56基因時加入的酶催化________鍵的形成，還需要添加引物，應選用下列引物組合________。
①5′-CTTGGATGAT-3′
②5′-TAAGTTGTCT-3′
③5′-TAGTAGGTTC-3′
磷酸二酯
①⑤
④5′-ATTCAACAGA-3′
⑤5′-TCTGTTGAAT-3′
⑥5′-ATCATCCAAG-3′
(2)根據基因表達載體的結構組成分析，Ti質粒中的CaMV35S的功能是___________________________________________。基因表達載體中，OsMYB56基因和bar基因編碼鏈的方向________(填“相同”或“相反”)。
RNA聚合酶識別和結合的部位(啟動轉錄過程)
相反
(3)過程③應選用限制酶______________切割質粒，利用所選限制酶進行操作的優勢是__________________________________________
______________________________________(答兩點)，切割后需要用________________(寫具體名稱)進行連接才能獲得重組質粒。
BclⅠ和SmaⅠ
防止酶切后的質粒、目的基因自身環化；保證
OsMYB56基因和酶切后的質粒定向連接
T4 DNA連接酶
(4)若要鑒定OsMYB56基因是否表達，從分子水平上檢測的方法有___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
(答出一種即可)。
提取細胞的mRNA，逆轉錄得到cDNA后進行PCR擴增；根據OsMYB56基因設計探針進行核酸分子雜交檢測OsMYB56基因是否成功插入水稻染色體DNA中或者其是否轉錄出mRNA；通過抗原—抗體雜交技術檢測OsMYB56基因是否表達出蛋白質(答出1點即可)
[解析]　(1)過程①PCR擴增OsMYB56基因時加入的酶是耐高溫的DNA聚合酶，該酶能催化磷酸二酯鍵的形成。在進行PCR操作時，引物應分別與基因兩條鏈的3′端根據堿基互補配對原則結合，根據圖中兩端序列，通常選擇5′-CTTGGATGAT-3′(上面鏈的引物)和5′-TCTGTTGAAT-3′(下面鏈的引物)作為引物對，①⑤正確。
(2)基因表達載體的結構應該包括啟動子、終止子、復制原點、限制酶切割位點、標記基因等，由圖可知CaMV35S是啟動子，功能是RNA聚合酶識別和結合的位點。RNA聚合酶的移動方向是從啟動子移向終止子，故兩個基因編碼鏈方向相反。
(3)據圖可知，質粒中的兩個標記基因Tetr和Ampr中都含有限制酶BamHⅠ的識別序列，如果用限制酶BamHⅠ，會破壞質粒中的兩個標記基因，為防止質粒自身環化，保證OsMYB56基因和酶切后的質粒定向連接，需要用雙酶切，因此過程③可以選擇限制酶BclⅠ和SmaⅠ。酶切后的質粒和目的基因片段，通過T4 DNA連接酶作用后獲得重組質粒。
(4)分子水平檢測OsMYB56基因是否表達，可以檢測基因是否轉錄形成RNA或翻譯成蛋白質，因此方法如下：可以提取細胞的mRNA，逆轉錄得到cDNA后進行PCR擴增；根據OsMYB56基因設計探針進行核酸分子雜交檢測OsMYB56基因是否成功插入水稻染色體DNA中或者其轉錄出mRNA；通過抗原—抗體雜交技術檢測OsMYB56基因是否表達出蛋白質。
(教師用書獨具)
1．(2024·江蘇南通調研)1965年中國科學家人工合成了具有生物活性的結晶牛胰島素，摘取了人工合成蛋白質的桂冠，下圖是利用基因工程生產人胰島素過程中使用的質粒及目的基因的部分結構。請回答下列問題：
(1)質粒上ori序列的堿基特點是________比值較高，圖示胰島素基因的轉錄以________鏈作為模板。
(2)在設計PCR引物時最好在引物的________端添加限制酶______________的識別序列，PCR反應體系中引物的延伸需要Taq DNA聚合酶，此酶需要________(離子)的激活。
A和T
B
5′
XhoⅠ和MunⅠ
Mg2+
(3)科學家運用大引物PCR定點突變技術對胰島素第28位氨基酸實現了替換，獲得了速效胰島素類似物產品。相關原理如圖所示。
①第一次PCR至少需要________個循環才能獲得相應的大引物模板，第二次PCR應選用大引物兩條鏈中的________(填“A”或“B”)，若第二次PCR計劃循環n次，至少需要大引物________個。
②β-半乳糖苷酶可以分解無色的X-gal產生藍色物質使菌落呈現藍色，否則菌落為白色。將轉化后的大腸桿菌接種到添加了__________________的培養基上，若觀察到菌落呈現白色，則表明______________________________________。
2
B
2n－1
氨芐青霉素和X-gal
該菌落即為含有重組質粒的大腸桿菌菌落
[解析]　(1)復制原點ori處的A和T特別多，相對氫鍵少，不穩定，DNA容易解旋，因此就容易和引物結合，成為復制的起點。 在轉錄過程中，DNA模板被轉錄方向是從3′端向5′端，3′端是—OH端，因此圖示胰島素基因的轉錄以B鏈作為模板。
(2)由圖可知，對于目的基因，SalⅠ和NheⅠ的作用位點在目的基因的中間，會破壞目的基因，則在引物設計時不能選用這兩種限制酶，那么只能在XhoⅠ、MunⅠ和EcoRⅠ中選擇；同時質粒上EcoRⅠ的其中一個作用位點是在標記基因上，所以只能選擇XhoⅠ和MunⅠ兩種限制酶，則需要在設計PCR引物時可添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的識別序列，因為DNA合成時，新鏈的延伸方向是5′→3′，因此，設計PCR引物時需要在5′端加上酶切位點。PCR反應體系中引物的延伸需要Taq DNA聚合酶，此酶需要Mg2+的激活。
(3)①據圖可知，第一次PCR時以突變上游引物進行PCR，循環一次，可得到一個 ，再循環一次，即可得到 ，即第一次PCR至少需要2個循環才能獲得相應的大引物模板。DNA聚合酶只能從引物3′端開始延伸DNA鏈，因此第二次PCR應選用大引物兩條鏈中的B鏈。若第二次PCR計劃循環n次，可得到2n個DNA分子，需要引物2n×2－2個，由于第二次PCR時，需要大引物和常規上游引物，各占一半，因此至少需要大引物(2n×2－2)/2＝2n－1個。
②結合圖示可知，目的基因插入的位置是在lacZ基因中，會破壞lacZ基因的結構，不能產生β-半乳糖苷酶，根據題干信息“β-半乳糖苷酶可以分解無色的X-gal產生藍色物質”可知，目的基因插入破壞了lacZ基因的結構，使其不能正常表達產生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不會被分解，所以篩選導入重組質粒的大腸桿菌時，在添加了氨芐青霉素和X-gal的培養基上應選擇白色的菌落。
2．(2024·河北邢臺模擬)研究低溫條件下番茄細胞WHYI基因對光合作用的影響，對于溫度敏感型蔬菜作物的栽培具有重要的實踐意義。回答下列問題：
(1)研究人員利用重組DNA 技術，將克隆的WHYI基因與外源高效啟動子連接，導入番茄基因組中構建WHYI基因的過表達植株(W＋)，如圖1所示。啟動子是識別、結合______________酶的部位。若限制酶切割WHYI 基因和番茄基因組后形成相同的黏性末端(即圖中Ⅰ、Ⅱ處)，則會出現_________________________________
_____________________(答出2點)等情
況，從而導致構建過表達植株的成功
率下降。
RNA聚合
WHYI基因自身環化、WHYI基因與番茄基因組反向連接
(2)PCR 的產物一般通過電泳來鑒定，結果如圖2所示。1號泳道為標準，2號泳道為陽性對照(提純的相關蛋白基因片段)，3號泳道為實驗組。1 號泳道的條帶實質為__________________________，若3號泳道有雜帶(非目的 DNA 片段)出現，則原因可能是____________
_______________________________
_____________________(答出2 點)。
不同已知長度的DNA片段
作為模板的
DNA受到污染；引物的特異性不強，
使模板與多個引物結合
(3)小干擾RNA(siRNA)能誘導特定基因轉錄出的 mRNA降解，導致基因沉默。研究人員據此構建了WHYI基因的沉默植株(W－)，siRNA 因阻斷了________過程而關閉了WHYI基因。進一步研究發現，番茄細胞WHYI基因影響光反應階段 D1 蛋白(可捕捉光能)的含量，且與溫度有關。研究人員用特定抗體檢測D1蛋白在葉綠體內的含量，結果如表所示。該實驗中的自變量為____________________________，對比三種番茄的D1蛋白含量可得到的結論是_____________________________________________
_______________________________________________________________
_____________________________________。
翻譯
溫度、WHYI基因的表達程度
在25 ℃條件下，WHYI基因對D1蛋白的合成無
影響；在4 ℃條件下，WHYI基因能促進D1蛋白的合成，且D1蛋白
的含量與WHYI基因的表達程度有關
[解析]　(1)啟動子是識別、結合RNA聚合酶的部位。若限制酶切割WHYI基因和番茄基因組后形成相同的黏性末端，則會出現WHYI基因自身環化、WHYI基因與番茄基因組反向連接等情況，從而導致構建過表達植株的成功率下降。
(2)電泳鑒定DNA片段的實質是根據不同DNA分子的遷移速率、DNA分子的大小和構象不同而將DNA片段分離開來，因此1號泳道作為電泳道的標準，其本質就是不同已知長度的DNA片段。PCR過程中，作為模板的DNA受到污染，或引物的特異性不強，使模板與多個引物結合，均會擴增出多條不同長度或構象的DNA片段，從而在電泳過程中出現多條電泳帶。
(3)由題可知，在25 ℃條件下，W＋、W、W－的D1蛋白含量相同，說明在 25 ℃條件下，WHYI基因對D1蛋白合成無影響。在4 ℃條件下，W＋、W、W－的D1蛋白含量從大到小為W＋>W>W－，說明在4 ℃條件下，WHYI基因能促進D1蛋白的合成，且WHYI基因的表達程度越高，D1蛋白的含量越多。命題點專訓(十四)　生物技術與工程(非選擇題)
1．(2024·廣東汕頭一模)鎘(Cd)是重金屬污染物，具有極強毒性。煙草作為重要的經濟作物，在生長過程中容易富集Cd，Cd通過煙氣進入人體，長期積累可能會引發疾病。NtNRAMP3是定位于液泡膜參與Cd轉運的蛋白，研究人員以普通煙草為材料，通過轉基因技術研究NtNRAMP基因的功能，為研究煙草在Cd脅迫中的適應機制提供理論基礎。回答下列問題：
(1)從數據庫獲得NtNRAMP基因的序列，設計引物F和R后利用________________技術擴增得到NtNRAMP基因的cDNA片段，測序鑒定。使用AscⅠ、SpeⅠ和DNA連接酶等酶將NtNRAMP基因連接到pCambia300-221質粒的T-DNA區域中(圖1為該T-DNA的左邊界至右邊界)，得到重組質粒pCambia300-NtNRAMP。圖示使用AscⅠ、SpeⅠ的過程是________(填圖中的數字)。
(2)將pCambia300-NtNRAMP轉入農桿菌，培養基中添加了瓊脂與潮霉素，兩者的作用分別是形成________培養基以便得到單菌落、篩選____________________________。含pCambia300-NtNRAMP的農桿菌與煙草愈傷組織共培養，培養后得到12株煙草植株。提取煙草細胞的核DNA用引物F和R進行擴增，對轉基因煙草進行鑒定。若擴增到特異性DNA片段，則說明____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)上述煙草植株經PCR檢測和電泳后，結果如圖2所示：
注：CK為陰性對照；1～12為待檢測植株；A為空白對照；B為pCambia300-NtNRAMP。
圖2
為進一步研究轉基因煙草在不同鎘濃度脅迫下的NtNRAMP表達量變化，請從上述植株選取適宜的材料，簡要寫出實驗探究思路：____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
______________________________________(要求寫出所選3株植株的編號)。
[解析]　(1)擴增DNA片段的方法是PCR技術；基因工程的工具酶有限制酶和DNA連接酶，因此推測AscⅠ、SpeⅠ是限制酶，圖中②過程是構建重組質粒的過程，因此②過程用到了AscⅠ、SpeⅠ對目的基因和質粒進行切割。(2)瓊脂的作用是配制固體培養基，便于得到單菌落，根據題意可知，含重組質粒的農桿菌中有潮霉素抗性基因，可在含潮霉素的培養基上生長，因此培養基中加潮霉素的作用是篩選含重組質粒(抗潮霉素)的菌株。提取煙草細胞的核DNA用引物F和R進行擴增，對轉基因煙草進行鑒定，可通過對DNA擴增后進行鑒定，若擴增到特異性DNA片段則說明目的基因成功導入煙草細胞。(3)要研究轉基因煙草在不同鎘濃度脅迫下的NtNRAMP表達量，需配制一系列濃度的鎘溶液，選取圖2中的陰性對照植株(CK)作為對照，還需選取具有重組質粒的植株，也就是圖中與B條帶寬度接近的植株，即6號和7號植株，探究思路為用一系列濃度的鎘處理CK植株、6號植株和7號植株，檢測并比較各種處理下3株植物的NtNRAMP表達量。
[答案]　(1)PCR　②　(2)固體　含重組質粒(抗潮霉素)的菌株　目的基因成功導入煙草細胞
(3)用一系列濃度的鎘處理CK植株、6號植株和7號植株，檢測并比較各種處理下3株植物的NtNRAMP表達量
2．(2024·山東德州二模)抗菌肽是一類廣泛存在于自然界中的多肽，對細菌、真菌、寄生蟲和病毒具有廣泛的抑制作用。科研人員將抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因進行融合形成雜合肽NK-LPd基因(部分過程如圖1所示)，從而獲得具有更高抗菌活性的雜合抗菌肽。
(1)DNA聚合酶能夠從引物的________(填“3′”或“5′”)端開始連接脫氧核苷酸。若設計的引物較長，為提高PCR的準確度需要適當________(填“提高”或“降低”)復性溫度。
(2)圖2為PCR1擴增產物(Ⅰ、Ⅱ)和PCR2擴增產物(Ⅲ)的凝膠電泳實驗結果，根據結果可說明基因融合成功，判斷依據是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)在轉化前，需要先構建含NK-LPd基因的表達載體，其目的是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________；
在成功轉化的酵母菌中提純得到雜合抗菌肽NK-LPd，為驗證NK-LPd對大腸桿菌的抑菌效果，先將大腸桿菌涂布在圖3的平板上，再放置濾紙片。根據圖示實驗結果推測，在A、D區域放置的濾紙片分別為____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析]　(1)DNA聚合酶在DNA復制過程中，從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，因為DNA聚合酶只能催化脫氧核苷酸連接到已有的核苷酸片段的3′端上。如果設計的引物較長，那么引物與模板之間的結合會更加穩定，因此需要適當提高復性溫度，以確保引物與模板之間的特異性結合。(2)圖2為PCR1擴增產物(Ⅰ、Ⅱ)和PCR2擴增產物(Ⅲ)的凝膠電泳實驗結果，根據結果可說明基因融合成功，判斷依據是Ⅰ、Ⅱ的長度之和與Ⅲ基本相等。(3)在轉化前，需要先構建含NK-LPd基因的表達載體，其目的是使融合基因能夠在受體細胞中穩定存在，并遺傳給下一代，且使融合基因表達和發揮作用；在成功轉化的酵母菌中提純得到雜合抗菌肽NK-LPd，為驗證NK-LPd對大腸桿菌的抑菌效果，先將大腸桿菌涂布在圖3的平板上，再放置濾紙片，根據抑菌圈直徑可以判斷抑菌效果的強弱，在圖3中A區域未出現抑菌圈，推測放置的濾紙片為空白濾紙片，D區域抑菌圈最大，根據題干信息可知，將抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因進行融合形成雜合肽NK-LPd基因，從而獲得具有更高抗菌活性的雜合抗菌肽，所以推測D區域放置的濾紙片為含雜合抗菌肽NK-LPd的濾紙片。
[答案]　(1)3′　提高　(2)Ⅰ、Ⅱ的長度之和與Ⅲ基本相等　(3)使融合基因能夠在受體細胞中穩定存在，并遺傳給下一代，且使融合基因表達和發揮作用　空白濾紙片、含雜合抗菌肽NK-LPd的濾紙片
3．(2024·湖南教學聯盟聯考)土壤鹽漬化影響水稻生長發育，將水稻耐鹽堿基因OsMYB56導入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中，培育耐鹽堿水稻新品種，其操作流程及可能用到的限制酶如圖，其中bar為抗除草劑基因，Tetr為四環素抗性基因，Ampr為氨芐青霉素抗性基因，①～⑦表示操作過程。請據圖回答問題。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sac3AⅠ
識別位點及切割位點
(1)過程①利用PCR擴增OsMYB56基因時加入的酶催化________鍵的形成，還需要添加引物，應選用下列引物組合________。
①5′-CTTGGATGAT-3′
②5′-TAAGTTGTCT-3′
③5′-TAGTAGGTTC-3′
④5′-ATTCAACAGA-3′
⑤5′-TCTGTTGAAT-3′
⑥5′-ATCATCCAAG-3′
(2)根據基因表達載體的結構組成分析，Ti質粒中的CaMV35S的功能是_____________________。基因表達載體中，OsMYB56基因和bar基因編碼鏈的方向________(填“相同”或“相反”)。
(3)過程③應選用限制酶______________切割質粒，利用所選限制酶進行操作的優勢是______________________________________________________________
____________________________________________________________________
__________________________________________________________(答兩點)，切割后需要用________________(寫具體名稱)進行連接才能獲得重組質粒。
(4)若要鑒定OsMYB56基因是否表達，從分子水平上檢測的方法有____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
__________________________________________________(答出一種即可)。
[解析]　(1)過程①PCR擴增OsMYB56基因時加入的酶是耐高溫的DNA聚合酶，該酶能催化磷酸二酯鍵的形成。在進行PCR操作時，引物應分別與基因兩條鏈的3′端根據堿基互補配對原則結合，根據圖中兩端序列，通常選擇5′-CTTGGATGAT-3′(上面鏈的引物)和5′-TCTGTTGAAT-3′(下面鏈的引物)作為引物對，①⑤正確。(2)基因表達載體的結構應該包括啟動子、終止子、復制原點、限制酶切割位點、標記基因等，由圖可知CaMV35S是啟動子，功能是RNA聚合酶識別和結合的位點。RNA聚合酶的移動方向是從啟動子移向終止子，故兩個基因編碼鏈方向相反。(3)據圖可知，質粒中的兩個標記基因Tetr和Ampr中都含有限制酶BamHⅠ的識別序列，如果用限制酶BamHⅠ，會破壞質粒中的兩個標記基因，為防止質粒自身環化，保證OsMYB56基因和酶切后的質粒定向連接，需要用雙酶切，因此過程③可以選擇限制酶BclⅠ和SmaⅠ。酶切后的質粒和目的基因片段，通過T4 DNA連接酶作用后獲得重組質粒。(4)分子水平檢測OsMYB56基因是否表達，可以檢測基因是否轉錄形成RNA或翻譯成蛋白質，因此方法如下：可以提取細胞的mRNA，逆轉錄得到cDNA后進行PCR擴增；根據OsMYB56基因設計探針進行核酸分子雜交檢測OsMYB56基因是否成功插入水稻染色體DNA中或者其轉錄出mRNA；通過抗原—抗體雜交技術檢測OsMYB56基因是否表達出蛋白質。
[答案]　(1)磷酸二酯　①⑤　(2)RNA聚合酶識別和結合的部位(啟動轉錄過程)　相反
(3)BclⅠ和SmaⅠ　防止酶切后的質粒、目的基因自身環化；保證OsMYB56基因和酶切后的質粒定向連接　T4 DNA連接酶　(4)提取細胞的mRNA，逆轉錄得到cDNA后進行PCR擴增；根據OsMYB56基因設計探針進行核酸分子雜交檢測OsMYB56基因是否成功插入水稻染色體DNA中或者其是否轉錄出mRNA；通過抗原—抗體雜交技術檢測OsMYB56基因是否表達出蛋白質(答出1點即可)
(教師用書獨具)
1．(2024·江蘇南通調研)1965年中國科學家人工合成了具有生物活性的結晶牛胰島素，摘取了人工合成蛋白質的桂冠，下圖是利用基因工程生產人胰島素過程中使用的質粒及目的基因的部分結構。請回答下列問題：
(1)質粒上ori序列的堿基特點是________比值較高，圖示胰島素基因的轉錄以________鏈作為模板。
(2)在設計PCR引物時最好在引物的________端添加限制酶______________的識別序列，PCR反應體系中引物的延伸需要Taq DNA聚合酶，此酶需要________(離子)的激活。
(3)科學家運用大引物PCR定點突變技術對胰島素第28位氨基酸實現了替換，獲得了速效胰島素類似物產品。相關原理如圖所示。
①第一次PCR至少需要________個循環才能獲得相應的大引物模板，第二次PCR應選用大引物兩條鏈中的________(填“A”或“B”)，若第二次PCR計劃循環n次，至少需要大引物________個。
②β-半乳糖苷酶可以分解無色的X-gal產生藍色物質使菌落呈現藍色，否則菌落為白色。將轉化后的大腸桿菌接種到添加了__________________的培養基上，若觀察到菌落呈現白色，則表明____________________________。
[解析]　(1)復制原點ori處的A和T特別多，相對氫鍵少，不穩定，DNA容易解旋，因此就容易和引物結合，成為復制的起點。 在轉錄過程中，DNA模板被轉錄方向是從3′端向5′端，3′端是—OH端，因此圖示胰島素基因的轉錄以B鏈作為模板。(2)由圖可知，對于目的基因，SalⅠ和NheⅠ的作用位點在目的基因的中間，會破壞目的基因，則在引物設計時不能選用這兩種限制酶，那么只能在XhoⅠ、MunⅠ和EcoRⅠ中選擇；同時質粒上EcoRⅠ的其中一個作用位點是在標記基因上，所以只能選擇XhoⅠ和MunⅠ兩種限制酶，則需要在設計PCR引物時可添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的識別序列，因為DNA合成時，新鏈的延伸方向是5′→3′，因此，設計PCR引物時需要在5′端加上酶切位點。PCR反應體系中引物的延伸需要Taq DNA聚合酶，此酶需要Mg2+的激活。(3)①據圖可知，第一次PCR時以突變上游引物進行PCR，循環一次，可得到一個，再循環一次，即可得到，即第一次PCR至少需要2個循環才能獲得相應的大引物模板。DNA聚合酶只能從引物3′端開始延伸DNA鏈，因此第二次PCR應選用大引物兩條鏈中的B鏈。若第二次PCR計劃循環n次，可得到2n個DNA分子，需要引物2n×2－2個，由于第二次PCR時，需要大引物和常規上游引物，各占一半，因此至少需要大引物(2n×2－2)/2＝2n－1個。②結合圖示可知，目的基因插入的位置是在lacZ基因中，會破壞lacZ基因的結構，不能產生β-半乳糖苷酶，根據題干信息“β-半乳糖苷酶可以分解無色的X-gal產生藍色物質”可知，目的基因插入破壞了lacZ基因的結構，使其不能正常表達產生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不會被分解，所以篩選導入重組質粒的大腸桿菌時，在添加了氨芐青霉素和X-gal的培養基上應選擇白色的菌落。
[答案]　(1)A和T　B　(2)5′　XhoⅠ和MunⅠ　Mg2+　(3)①2　B　2n－1　②氨芐青霉素和X-gal　該菌落即為含有重組質粒的大腸桿菌菌落
2．(2024·河北邢臺模擬)研究低溫條件下番茄細胞WHYI基因對光合作用的影響，對于溫度敏感型蔬菜作物的栽培具有重要的實踐意義。回答下列問題：
(1)研究人員利用重組DNA 技術，將克隆的WHYI基因與外源高效啟動子連接，導入番茄基因組中構建WHYI基因的過表達植株(W＋)，如圖1所示。啟動子是識別、結合___________________酶的部位。若限制酶切割WHYI 基因和番茄基因組后形成相同的黏性末端(即圖中Ⅰ、Ⅱ處)，則會出現____________________________________________________________________
___________________________________________________________(答出2點)
等情況，從而導致構建過表達植株的成功率下降。
(2)PCR 的產物一般通過電泳來鑒定，結果如圖2所示。1號泳道為標準，2號泳道為陽性對照(提純的相關蛋白基因片段)，3號泳道為實驗組。1 號泳道的條帶實質為__________________________，若3號泳道有雜帶(非目的 DNA 片段)出現，則原因可能是_________________________________________________
________________________________________________________(答出2 點)。
(3)小干擾RNA(siRNA)能誘導特定基因轉錄出的 mRNA降解，導致基因沉默。研究人員據此構建了WHYI基因的沉默植株(W－)，siRNA 因阻斷了________過程而關閉了WHYI基因。進一步研究發現，番茄細胞WHYI基因影響光反應階段 D1 蛋白(可捕捉光能)的含量，且與溫度有關。研究人員用特定抗體檢測D1蛋白在葉綠體內的含量，結果如表所示。該實驗中的自變量為____________________________，對比三種番茄的D1蛋白含量可得到的結論是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析]　(1)啟動子是識別、結合RNA聚合酶的部位。若限制酶切割WHYI基因和番茄基因組后形成相同的黏性末端，則會出現WHYI基因自身環化、WHYI基因與番茄基因組反向連接等情況，從而導致構建過表達植株的成功率下降。(2)電泳鑒定DNA片段的實質是根據不同DNA分子的遷移速率、DNA分子的大小和構象不同而將DNA片段分離開來，因此1號泳道作為電泳道的標準，其本質就是不同已知長度的DNA片段。PCR過程中，作為模板的DNA受到污染，或引物的特異性不強，使模板與多個引物結合，均會擴增出多條不同長度或構象的DNA片段，從而在電泳過程中出現多條電泳帶。(3)由題可知，在25 ℃條件下，W＋、W、W－的D1蛋白含量相同，說明在 25 ℃條件下，WHYI基因對D1蛋白合成無影響。在4 ℃條件下，W＋、W、W－的D1蛋白含量從大到小為W＋>W>W－，說明在4 ℃條件下，WHYI基因能促進D1蛋白的合成，且WHYI基因的表達程度越高，D1蛋白的含量越多。
[答案]　(1)RNA聚合　WHYI基因自身環化、WHYI基因與番茄基因組反向連接　(2)不同已知長度的DNA片段　作為模板的DNA受到污染；引物的特異性不強，使模板與多個引物結合　(3)翻譯　溫度、WHYI基因的表達程度　在25 ℃條件下，WHYI基因對D1蛋白的合成無影響；在4 ℃條件下，WHYI基因能促進D1蛋白的合成，且D1蛋白的含量與WHYI基因的表達程度有關
21世紀教育網(www.21cnjy.com)

展開更多......

收起↑