資源簡介

(共24張PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
Bt基因
Bt抗蟲蛋白
表達
與表面受體結合
細胞膜穿孔
破壞細胞滲透平衡
最終導致昆蟲停止取食而死亡
昆蟲腸上皮細胞
傳統的雜交育種方法可以培養出抗蟲棉嗎？
×
導入
棉花細胞
培育
抗蟲棉
基因工程
培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟
蘇云金桿菌
與載體拼接
普通棉花
（無抗蟲特性）
棉花細胞
抗蟲棉
提取
表達Bt基因
導入
Bt基因
重組DNA分子
培育轉基因抗蟲棉的簡要過程
1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達載體的構建
3.將目的基因導入受體細胞
4.目的基因的 檢測與鑒定
定義：
在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀的或獲得預期表達產物的基因。
目的基因
受體細胞
目的基因主要是指編碼蛋白質的基因
抗逆性基因
生產藥物基因
毒物降解基因
工業用酶基因
一、目的基因的篩選與獲取
（一）目的基因
篩選方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選
（二）目的基因的篩選
①序列數據庫，如美國國家生物信息中心GenBank
②序列對比工具（如BLAST)
（三）目的基因的獲取
2.人工合成目的基因
3.利用PCR獲取和擴增目的基因
1.從基因文庫中獲取
2.利用PCR獲取和擴增目的基因
PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。它是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。
（1）PCR的概念：
中文全稱
聚合酶鏈式反應
DNA半保留復制
體外（PCR擴增儀/PCR儀）
對目的基因的核苷酸序列進行大量復制
原理
操作環境
目的
PCR擴增儀
體內DNA復制條件 在DNA復制中的作用 PCR反應條件
提供DNA復制的模板
合成DNA子鏈的原料
打開DNA雙鏈
催化合成DNA子鏈
使DNA聚合酶能夠從引物3′端連接脫氧核苷酸
兩條DNA母鏈
4種脫氧核苷酸
解旋酶
DNA聚合酶
小段單鏈RNA分子（引物）
兩條DNA母鏈
4種脫氧核苷酸
高溫條件（90℃以上）
耐高溫的DNA聚合酶
人工合成的小段單鏈DNA分子（引物）
穩定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
（2）PCR反應條件：
（2）PCR反應過程：
1）變性：
當溫度上升到_______以上時， 斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條 。
氫鍵
單鏈DNA
待擴增的DNA片段
第一步：變性
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
變性
90℃
思考：變性的溫度為何是90℃以上的一個溫度范圍，而不是95℃？
因為變性的溫度與氫鍵的數量有關。當氫鍵數量越多時，所需溫度就越高；反之，當氫鍵數量越少時，所需溫度也就越低。
2）復性：
當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通 過 與兩條單鏈DNA結合。
第二步：復性
引物1
引物2
DNA引物
3’
5’
3’
5’
堿基互補配對
5’
5’
思考：什么是引物？為什么需要引物？引物結合在模板鏈的什么位置？
①引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。
②因為Taq酶不能從0開始添加核苷酸。
③引物結合在DNA模板鏈 3'端位置，引導子鏈從 5'端→3'端方向復制。
3’
3’
活動1. 根據查詢的Bt基因編碼鏈序列，嘗試設計引物。小組內合作討論完成
要求：1.寫出互補鏈的堿基序列，并注明方向。
2.從①－④中選擇2個合適的位置設計引物，寫出引物的部分序列，并注明方向。
5’ATG …… ATC GAG ACC GGT …… TAA 3’
3’TAC …… TAG CTC TGG CCA …… ATT 5’
①
②

③
④
3’… ATT 5’
5’ATG… 3’
【例1】下圖是某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)，都不合理，請分別說明理由。
第1組： ；
第2組： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ會因局部發生堿基互補配對而失效
引物Ⅰ′自身折疊后會因出現局部堿基互補配對而失效
思考：引物設計的原則有哪些？
Ⅰ.引物長度要適宜：
一般在20-30堿基之間。過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq 酶進行反應；過短特異性差。
Ⅱ.G-C含量要適宜：
一般在40%~60%之間，G-C含量過高或過低都不利于引發反應。
堿基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續4個堿基的互補，否則引物自身會折疊成發夾結構或引物之間配對結合，從而影響引物與模板的復性結合。
Ⅲ.引物自身及引物之間不應存在互補序列：
思考：要保證目的基因能與載體相連接，還要對引物進行什么操作？
要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識別序列。
思考：引物設計的原則有哪些？
Ⅰ.引物長度要適宜：
一般在20-30堿基之間。過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq 酶進行反應；過短特異性差。
Ⅱ.G-C含量要適宜：
一般在40%~60%之間，G-C含量過高或過低都不利于引發反應。
堿基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續4個堿基的互補，否則引物自身會折疊成發夾結構或引物之間配對結合，從而影響引物與模板的復性結合。
Ⅲ.引物自身及引物之間不應存在互補序列：
Ⅳ.引物5'端可以修飾，3'端不可修飾：
3）延伸：
當溫度上升到______左右時，溶液中的4種____________在耐高溫的____________的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
第三步：延伸
引物1
引物2
Taq酶
Taq酶
3’
5’
3’
5’
脫氧核苷酸
5’
5’
DNA聚合酶
72℃
3’
3’
3’
3’
思考1：為什么溫度要上升至72℃？
思考2：Taq酶結合在引物的3’還是5’端？
72℃是Taq酶的最適溫度
Taq酶結合在引物的3’端
PCR相關計算
長鏈-中長鏈DNA____個
含有引物A的DNA____個
含有引物B的DNA____個
2
1
1
引物A
引物B
擴增一次
中長鏈-短鏈DNA____個
2
長鏈-中長鏈DNA____個
含有引物A的DNA____個
含有引物B的DNA____個
2
3
3
擴增兩次
PCR相關計算
中長鏈-短鏈DNA____個
4
長鏈-中長鏈DNA____個
含有引物A的DNA____個
含有引物B的DNA____個
2
7
7
短鏈-短鏈DNA______個
2
出現完整的目的基因
擴增三次
PCR相關計算
中長鏈-短鏈DNA____個
長鏈-中長鏈DNA____個
含有引物A的DNA____個
含有引物B的DNA____個
短鏈-短鏈DNA______個
擴增四次
2
8
15
15
6
PCR相關計算
擴增次數 1次 2次 3次 4次 n次
DNA總數 21 22 23 24 2n
長鏈-中長鏈DNA
中長鏈-短鏈DNA
短鏈-短鏈DNA
含引物A(或B) 的DNA
2
0
0
2
2
2
4
0
2
2
6
8
2
2n-2
2n-2n
1
3
7
15
2n-1
PCR相關計算
長鏈條數：始終是最初DNA分子的兩條鏈。
中鏈條數：始終是最初DNA分子的兩條長鏈為模板形成的，并且每復制一次，新形成的中鏈增加兩條。
短鏈條數：所有的DNA分子中，除長鏈和中鏈外，余下的即為短鏈。
復制過程中共需引物_______對
2n-1
一個DNA，一對引物（A與B），通過PCR擴增n次：
①子代DNA分子中等長鏈DNA分子數為：______個
②子代DNA分子中不等長鏈DNA分子數為：_______個
③子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數為：_______個
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子數為：______個
⑤復制過程中共需引物________個
⑥第n次復制需要引物_________個
2n-2n
2n
2
2n-1
2n＋1 - 2
2n
PCR擴增DNA規律
深入思考：用PCR可以擴增mRNA嗎？
mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉錄成cDNA在進行擴增。
由mRNA逆轉錄形成cDNA的過程是：
第一步，逆轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；
第二步，核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；
第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。
(1)PCR反應中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應 （　 　）
(2)PCR擴增技術中，需用解旋酶使雙鏈DNA解聚 （　 　）
(3)PCR過程使用的DNA聚合酶的特點是耐高溫 （　 　）
(4)PCR技術中，DNA模板鏈上堿基G和C的比例越高，DNA變性的溫度就越高 （　 ）
(5)PCR擴增過程中，需要添加ATP為新鏈合成提供能量（ ）
(6)PCR擴增過程中，通過溫度變化的控制為變性、復性和延伸等過程提供能量（ ）
1.判斷常考語句，澄清易混易錯
溫度不能為變性、復性和延伸等過程提供能量
PCR技術擴增時需要能量，所需要的能量可由dNTP提供
【現學現用】

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