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第三章 基因工程
3.1 重組DNA技術的基本工具
基因的結構和功能
1.基因與DNA的關系？
2.基因的基本單位是什么？
3.基因的功能？
基因是有遺傳效應的DNA片段
CH2
H
OH
H
H
H
H
堿基
磷酸
5’
4’
3’
2’
1’
脫氧核苷酸
挖掘記憶
儲存、傳遞、表達遺傳信息
復制
轉錄
翻譯
DNA
RNA
逆轉錄
復制
蛋白質
　　指按照 ,進行嚴格的設計并通過 DNA重組和 等技術，賦予生物以新的遺傳特性,創造出更符合人們需要的 。由于基因工程是在 上進行設計和施工的，因此又叫作 。
人們的愿望
體外
轉基因
新的生物類型和生物產品
DNA分子水平
DNA重組技術
基因工程 P67
練.下列關于基因工程的敘述，不正確的是（ ）
A．基因工程的原理主要是基因重組
B．運用基因工程技術，可使生物發生定向變異
C．一種生物的基因轉接到另一種生物的DNA分子上，
屬于基因工程的內容
D．是非同源染色體上非等位基因的自由組合
D
創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品
操作對象：
操作環境：
操作水平：
原理：
特點：
基本過程：
基因(DNA)
DNA 分子水平
基因重組
生物體外
剪切→拼接→導入→表達
定向改造生物性狀，徹底打破生殖隔離
水母的綠色熒光蛋白基因
表達的基礎
重組DNA
RNA
蛋白質
性狀
復制
轉錄
翻譯
翻譯
拼接的基礎
1. DNA的基本組成單位 。
2. 都遵循 原則
3. DNA分子的空間結構都是規則的 結構
相同（四種脫氧核苷酸）
堿基互補配對
雙螺旋
1. 基因是控制生物 的結構與功能單位
2. 遺傳信息的傳遞都遵循 法則
3. 生物界共用 。（相同的遺傳信息在不同的生物體內表達出相同的蛋白質）。
中心
一套遺傳密碼
性狀
到社會中去
番木瓜容易受番木瓜環斑病毒的侵襲，當番木瓜被這種病毒感染后，產量會大大下降。科學家通過精心設計，用“分子工具”培育出了轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環斑病毒。
DNA雙螺旋的直徑只有2nm，對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學家究竟用到了哪些“分子工具”？這些 “分子工具”各具有什么特征呢？
環斑病毒的
非轉基因木瓜
轉基因木瓜
“分子手術刀”
準確切割DNA分子
“分子縫合針”
“分子運輸車”
將DNA片段連接起來
將體外重組好的DNA分子導入受體細胞
一、基因工程的理論基礎
①
②
二、限制性內切核酸酶（限制酶）
1. 定義：
2. 來源：
（限制酶不是一種酶，而是一類酶）
3. 種類：
識別雙鏈 DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
數千種
4. 作用：
切割DNA分子的工具是限制性內切核酸酶，又稱限制酶。
主要是原核生物，可人工合成
（蛋白質）
根據你所掌握的知識你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么？
？旁欄思考
主要起到切割外源DNA使之失效，從而達到保護自身的目的
為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？
提示：原核細胞內DNA分子不具備這種限制酶的識別序列，或者甲基化酶將甲基轉移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。
二、限制性內切核酸酶（限制酶）
5. 限制酶的識別序列
思考：四種限制酶識別的特定序列有何特點？
大多數限制酶的識別序列由 組成，也有少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。
6個核苷酸
特點1：都可以找到一條中心軸線；
特點2：中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向、對稱、重復排列的，稱為回文序列。
總結：能被限制酶所識別的序列一般都有回文序列
拓展——限制酶的命名：
閱讀72頁資料卡“限制酶的命名”，說說EcoRⅠ各個字母的代表含義。
EcoRⅠ
屬名Escherichia首字母
種名coli前兩個字母
R型菌株
從中分離的第一個限制酶
二、限制性內切核酸酶（限制酶）
（1）實例1——EcoRⅠ限制酶切割
*EcoRⅠ識別序列為GAATTC
*EcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵
黏性末端
黏性末端
（2）實例2——SmaⅠ限制酶切割
*SmaⅠ識別序列為CCCGGG
*SmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵
平末端
6.切割結果 :
二、限制性內切核酸酶（限制酶）
DNA兩條單鏈的切口處，伸出幾個核苷酸，剛好能互補配對，這樣的切口叫黏性末端。
切口處是平整的，這樣的切口叫平末端。
【練習1】：寫出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ________ BglⅡ________
GATC
AATT
AGCT
GATC
思考：同種限制酶切割的黏性末端一定相同嗎？不同種限制酶切出的黏性末端一定不同嗎？
二、限制性內切核酸酶（限制酶）
①不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同。
【解析：酶具有專一性，識別的序列相同】
②不同的限制酶切割可能產生相同的黏性末端。（比如BamHⅠ、BglⅡ）
【練習2】下面哪項不具有限制酶識別序列的特征（ ）
A．GAATTC
CTTAAG
B．GGGGCCCC
CCCCGGGG
C．CTGCAG
GACGTC
D．CTAAATC
GATTTAG
D
【練習3】右側黏性末端是由______種限制酶作用產生的。
3
二、限制性內切核酸酶（限制酶）
不能，限制酶只能識別并切開雙鏈DNA分子。
（2）限制酶切一次可斷開 個磷酸二酯鍵，產生 個游離的磷酸基團，產生 個黏性末端。要想獲得某個特定性狀的目的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性(平)末端？
2
2
2
（1）限制酶能切開RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？
【練習4】請結合限制酶的作用特點，回答以下問題：
二、限制性內切核酸酶（限制酶）
要切2個切口，產生4個黏性(平)末端。
【練習5】把兩種來源不同的DNA分子進行拼接，應該怎樣處理呢？
用同種限制酶切割(EcoRⅠ)
T G A A T T C G
A C T T A A G C
A G A A T T C T
T C T T A A G A
缺口怎么辦
只能用同種酶切割嗎？
二、限制性內切核酸酶（限制酶）
完全互補的黏性末端能通過氫鍵暫時連接在一起，但并不穩定。
DNA連接酶 — “分子縫合針”
恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵
二
DNA連接酶 ——“分子縫合針”
2. 作用：
將兩個DNA片段連接起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
5′
3′
T
A
C
G
T
A
C
T
G
A
A
T
5′
3′
5′
3′
C
G
C
G
C
G
5′
3′
C
G
C
G
C
G
切口
切口
切口
C
T
5′
3′
5′
3′
T
A
G
C
A
G
A
T
T
A
5′
3′
5′
3′
C
G
C
G
C
G
C
G
C
G
C
G
三、DNA連接酶
將兩個雙鏈DNA片段“連接”起來的酶
1. 概念：
注意：
1、DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的兩條單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA!
2、DNA連接酶作用沒有特異性。
5′
5′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
5′
5′
5′
5′
T4 DNA
連接酶
T4 DNA連接酶和E.coli DNA連接酶
E.coli DNA連接酶
3. 種類：
思考：E.coli DNA連接酶只能連接互補黏性末端的DNA片段？
兩種連接酶都可連接互補黏性末端與平末端，
但E.coli DNA連接酶連接平末端效率遠低于T4 DNA連接酶
三、DNA連接酶
【新舊銜接】DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？
思考：T4 DNA連接酶只能連接平末端的DNA片段？
T4 DNA
連接酶
E.coli DNA連接酶
DNA連接酶 DNA聚合酶
相同點 作用實質 化學本質 不 同 點 模板
作用對象
作用結果
用途
都能催化形成磷酸二酯鍵
都是蛋白質
不需要
需要DNA的一條鏈作模板
形成完整的重組DNA分子
形成DNA的一條鏈
基因工程
DNA復制
在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵
只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵
三、DNA連接酶
【新舊銜接】DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？
三、DNA連接酶
拓展：幾種相關酶的比較
名稱 作用部位 作用結果
限制酶
DNA連接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯鍵
堿基對之間
的氫鍵
將DNA切成兩個片段
磷酸二酯鍵
將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
磷酸二酯鍵
將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端
磷酸二酯鍵
將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈
1.(2022·天津耀華中學高二期中)以下是幾種不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列敘述正確的是（ ）
考點突破
A.以上DNA片段是由4種限制酶切割后產生的
B.②片段是在識別序列為 的限制酶作用下形成的
C.①和④兩個片段在DNA聚合酶的作用下可形成重組DNA分子
D.限制酶和DNA連接酶作用的部位都是磷酸二酯鍵
如何將外源基因運入細胞呢？
三、DNA連接酶
①④是由同一種限制酶切割而成的
C
G
DNA連接酶
D
質粒:
將外源基因送入受體細胞, 在受體細胞內對目的基因進行大量復制。
1.作用：
動植物病毒:
噬菌體:
2.種類：
將外源基因導入大腸桿菌等受體細胞
將外源基因導入植物細胞
將外源基因導入動物細胞
動物病毒
噬菌體
四、基因進入受體細胞的載體
是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我 能力的環狀雙鏈DNA分子。
復制
問題1：載體要與外源基因連接，需要具備什么條件？
問題2：要使攜帶的外源基因在受體細胞中穩定存在，載體需要具備什么條件？
問題3：我們用肉眼看不到載體是否進入受體細胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？
條件①：具有一個或多個限制酶切割位點；
條件②：能在受體細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制；
條件③：具有標記基因，便于重組DNA分子的篩選。
條件④：載體DNA必須是安全的，不會對受體細胞有害。
【探究】分析歸納載體需要具備的條件
四、基因進入受體細胞的載體
有標記基因的存在，可用含青霉素的培養基鑒別。
不能被酶切破壞
便于重組DNA篩選與鑒定
DNA復制的起始位點，并帶著插入的目的基因一起復制
有切割位點（酶切位點）
4、最常用的載體——質粒：
真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過 改造的。
人工
四、基因進入受體細胞的載體
終止子: 轉錄的終點，在轉錄過程中起調控作用。
終止子: 轉錄的終點，在轉錄過程中起調控作用。
質粒DNA分子質量一般為擬核的0.5%~3%
請你根據圖3-3中的相關信息找到兩條片段上EcoRI 的識別序列和切割位點。 然后，用剪刀進行“切割”。待切割位點全部切開后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠條將切口粘連起來。
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
探究 活動二、P73思考討論 重組DNA分子的模擬操作
四、基因進入受體細胞的載體
Hind III 和 BamH I
1.用圖中外源DNA和質粒構建重組質粒，不能使用Sma Ⅰ切割，
原因是 。
2.使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ兩種限制酶切割，而不用EcoR Ⅰ一種限制酶切割，是為了防止 。
Sma Ⅰ會破壞抗性基因和外源DNA中的目的基因
目的基因、質粒自身環化及反向連接
5、下列操作中選用哪種限制酶切割來構建重組質粒？
a、選目的基因兩端和運載體都有的酶切位點；
b、所選酶切位點不能破壞目的基因以及標記基因
選擇酶切位點的原則：
四、基因進入受體細胞的載體
圖1
圖2
6、標記基因的篩選原理：載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。（據圖請嘗試描述篩選的過程）關鍵點撥培養基中有幾種類型的大腸桿菌？什么樣的大腸桿菌能夠在該培養基上存活并繁殖？四、基因進入受體細胞的載體
抗蟲棉
Bt抗蟲蛋白
蘇云金桿菌
取出
轉移
思考：通過本節的學習，現在你能描述如何使用這三種工具來獲得抗蟲棉嗎？
四、基因進入受體細胞的載體
2.某實驗小組利用下圖所示質粒和目的基因來構建基因表達載體,將目的基因導入大腸桿菌細胞并表達。下列敘述正確的是( )
A. 圖中的質粒用酶A切割后,會產生8個游離的磷酸基團
B. 在構建重組質粒時,可用酶A和酶C切割質粒和目的基因
C. 成功導入目的基因的大腸桿菌可在含四環素的培養基中生長
D. 若用酶B和酶C切割,可以避免質粒的自身環化
D
趁熱打鐵
限制酶
DNA連接酶
載體
①能自我復制或能整合到宿主DNA上
②有一個至多個限制酶切割位點
③有特殊的標記基因
④對受體細胞無害
質粒、 噬菌體 、動植物病毒
基因工程的基本工具
作為載體的條件
種類:
磷酸二酯鍵
來源：
主要來源于原核生物
特點：
作用部位：
具有專一性
結果：
形成黏性末端或平末端
連接部位：磷酸二酯鍵
種類： E.coli DNA連接酶、T4 DNA連接酶
作用： 把兩條雙鏈DNA片段拼接起來
（能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列）
課堂小結
實驗：DNA的粗提取與鑒定
1、實驗原理
DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，
可以利用這些差異，選用適當的物理或化學方法對它們進行提取。
DNA不溶于酒精溶液
但某些蛋白質溶于酒精
DNA能溶于物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液
在一定溫度下（沸水浴），DNA被二苯胺試劑染成藍色
初步分離DNA和蛋白質
溶解DNA
鑒定DNA
DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菜花和豬肝等。
（注意：不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）
(1)選材：
(2)試劑：
①研磨液
②體積分數為95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺試劑
⑤蒸餾水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鑒定DNA，要現配現用
2、材料用具
實驗：DNA的粗提取與鑒定
實驗：DNA的粗提取與鑒定
稱取洋蔥，切碎，放入研缽，倒入研磨液，充分研磨。
破碎細胞
目的：裂解細胞，釋放DNA
過濾
在漏斗中墊上紗布過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取上清液；或將研磨液倒入塑料離心管中離心，取上清液。
問題1:過濾能否用濾紙代替紗布？
不可以。因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。
問題2:此步驟獲得的上清液中可能含有哪些細胞成分？
可能含有DNA、RNA以及蛋白質、脂質、糖類等。
3、實驗步驟
破碎細胞
過濾
DNA的析出
在上清液中加入體積相等的預冷的酒精溶液, 靜置2~3min，溶液中出現的白色絲狀物就是粗提取的DNA 。
問題3:此步驟的目的是？
使蛋白質等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
問題4：酒精預冷的作用？
①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；
②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出；
③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。
實驗：DNA的粗提取與鑒定
3、實驗步驟
破碎細胞
過濾
DNA的析出
用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物；或將溶液倒入塑料離心管中離心，取沉淀物晾干。
問題5：攪拌時應輕緩、并沿一個方向目的？
減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子
析出DNA
實驗：DNA的粗提取與鑒定
3、實驗步驟
實驗組
對照組
水浴加熱
破碎細胞
過濾
DNA的析出
DNA的鑒定
將絲狀物或沉淀物溶于 溶液中，加入
試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min
二苯胺
2mol/L的NaCl
空白對照：
在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，將試管置于同等沸水浴中加熱5min。
評價結果：
（1）DNA純度
看提取物顏色
（2）DNA的量
看與二苯胺反應顏色的深淺
現配現用！
實驗：DNA的粗提取與鑒定
3、實驗步驟
（1）你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結果如何？
觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多。二苯胺試劑鑒定呈現藍色說明實驗基本成功；如果不呈現藍色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實驗操作過程中出現了失誤等。
本實驗粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質。
（2）你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質嗎？
4、結果分析與評價
實驗：DNA的粗提取與鑒定
實驗組
水浴加熱5min，冷卻后
對照組
藍色
練習
1．下列有關限制酶和DNA連接酶的敘述正確的是(　　)
A．用限制酶剪切獲得一個目的基因時產生兩個切口，有四個磷酸二酯鍵被斷開
B．在使用限制酶的同時，必須用解旋酶解開DNA的雙螺旋結構
C．DNA連接酶可以連接兩個肽鏈片段
D．T4 DNA連接酶和E.coli DNA連接酶都能催化平末端和黏性末端的連接
　
A
練習
2．質粒是基因工程中最常用的載體，它的主要特點是(　　)
①能自主復制　②不能自主復制　③結構很小 ④成分為蛋白質　⑤環狀RNA　⑥環狀DNA ⑦能“友好”地“借居”
A．①③⑤⑦ B．②④⑥
C．①③⑥⑦ D．②③⑥⑦
C

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