資源簡介

(共32張PPT)
3.2基因工程的基本操作程序
第2課時 將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定
基因工程的基本操作程序（4個步驟）
目的基因的篩選與獲取
基因表達載體的構建
將目的基因導入受體細胞
目的基因的檢測與鑒定
舊知回顧
目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程，稱為轉化。
實質：將目的基因整合到受體細胞基因組中。
將目的基因導入受體細胞的方法：
導入植物細胞
導入動物細胞
導入微生物細胞
農桿菌轉化法
花粉管通道法
顯微注射法
Ca2+轉化法
（我國科學家獨創）
（常用）
轉化的概念：
將目的基因導入受體細胞
方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中
含目的基因的DNA 溶液
花粉管通道法（我國科學家獨創）
將目的基因導入受體細胞—植物細胞
方法二：在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。
花粉管通道法
將目的基因導入受體細胞—植物細胞
農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。
農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞時，Ti質粒的 T-DNA可轉移至被侵染的細胞，并整合到該細胞的染色體DNA上。
（可轉移的DNA）
1.農桿菌的特點：
農桿菌轉化法
任務：分析將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定
1.在用農桿菌轉化法將目的基因導入植物細胞的過程中，一定要將目的基因插入到Ti質粒的T－DNA(可轉移的DNA)上，原因是農桿菌中的Ti質粒上的T－DNA_________________________________________________
__________。
可轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上
[思考]構建基因表達載體時，目的基因該插到Ti質粒哪里？
探究—學習筆記P64
將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農桿菌共培養，然后篩選轉化細胞，并再生成植株
將花序直接浸沒在含有農桿菌的溶液中一段時間，然后培養植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等
導入體細胞
導入受精卵
2.操作方法：
農桿菌轉化法
隨著轉化方法的突破，用農桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。
第一次拼接
第二次拼接
第一次導入
第二次導入
(2)兩次導入：
1.農桿菌轉化法中兩次拼接、兩次導入的辨析
(1)兩次拼接：
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上。
第一次導入是將含目的基因的重組Ti質粒導入農桿菌；第二次導入(非人工操作)是將含目的基因的T－DNA導入受體細胞。
核心歸納—學習筆記P65
目的基因的表達載體提純
取卵
（受精卵）
顯微注射
早期胚胎培養
獲得具有新性狀的動物
①個體大，易操作。
②受精卵全能性高，易培養成完整個體。
顯微注射法
1.操作方法：
2.過程：
將目的基因導入受體細胞—動物細胞
胚胎移植
注射器
固定吸管
【補充】病毒侵染法
科學家用病毒DNA與目的基因一起構建的載體，去感染受體動物細胞，也能使目的基因導入動物細胞內，如腺病毒載體等。
感受態細胞
Ca2+處理細胞
重組基因表達載體與感受態細胞混合
感受態細胞吸收重組DNA分子
42℃,1min
冰上3min
Ca2＋處理
1.操作方法：
2.過程：
將目的基因導入受體細胞—微生物細胞
常用原核生物作為受體細胞，其中以大腸桿菌應用最為廣泛，一般先用Ca2＋處理大腸桿菌細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，然后再將重組的基因表達載體導入其中。
【注意】原核生物作為受體細胞產生的真核生物的蛋白質通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。
（因為沒有內質網、高爾基體對蛋白質進一步加工。）
2.受體細胞的選擇
(1)對于植物來說，受體細胞可以是受精卵或體細胞，因為植物細胞具有全能性。
(2)對于動物來說，受體細胞一般是受精卵，因為受精卵的全能性高，而高度分化的動物體細胞的全能性受到抑制。
(3)大腸桿菌和酵母菌在基因工程中都可以作為受體細胞，但又有所不同。大腸桿菌為原核細胞，而酵母菌為真核細胞(具有多種細胞器)，所以在生產需要加工和分泌的蛋白質時，酵母菌比大腸桿菌有優勢。
核心歸納
生物種類 植物細胞 動物細胞 微生物細胞
常用方法
受體細胞
轉化過程
農桿菌轉化法
顯微注射技術
Ca+處理法
體細胞或受精卵
受精卵
原核細胞
將目的基因插入Ti質粒的T-DNA→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的DNA上→表達
將含有目的基因的表達載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物
Ca+處理細胞→微生物細胞膜的通透性增加形成感受態細胞→重組質粒與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子
將目的基因導入不同細胞的方法
將目的基因導入受體細胞
2.基因表達載體中具備標記基因(如抗生素抗性基因)，已經對受體細胞進行了篩選，基因工程的第四步還要對目的基因進行檢測和鑒定，原因是：在含抗生素的選擇培養基上能生長的可能是_________________________
，因此第四步需要對目的基因是否導入進行進一步的檢測。此外，即便在選擇培養基上能生長的細胞中導入的是基因表達載體，但是仍然不知道目的基因插入的 等是否正確，能否正確 ，因此也需要在 水平上進行檢測和鑒定。
導入了基因表達載體或未插
入目的基因的空載體
位置、方向
表達
轉錄和翻譯以及個體
探究
Bt基因
mRNA
Bt抗蟲蛋白
抗蟲棉
目的 ：檢測目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性
目的基因的檢測與鑒定
類型 檢測內容
分子水平的檢測 檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因
檢測目的基因是否轉錄出了mRNA
檢測目的基因是否翻譯成蛋白質
個體生物學水平的鑒定 個體是否具有相應性狀
如：檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測Bt基因
—通過PCR等技術檢測
轉基因生物
提取DNA
PCR操作
是否擴增出目的基因
M：marker；1-陽性質粒；
2：原始品系；3-9轉Bt品系；
PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果
電泳操作
目的基因的檢測與鑒定—分子水平的檢測
① 檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因
將受體細胞的所有DNA分子提取出來進行電泳實驗，與marker對比判斷是否含目的基因。
拓展 基因探針是一段帶有檢測標記（熒光或同位素標記），且順序已知的，與目的基因能互補的核酸序列（DNA或RNA）。
檢測 將待測DNA與目的基因探針混合，如果發生了核酸雜交，則說明有目的基因
① 檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因
—DNA分子雜交技術
目的基因的檢測與鑒定—分子水平的檢測
原理：堿基互補配對
1.復制水平的檢測(DNA分子雜交技術)
拓展延伸
(1)原理：堿基互補配對原則。
(2)基因探針：用放射性同位素或熒光物質標記的目的基因。
(3)檢測受體細胞是否含目的基因的具體過程：
拓展延伸
如：檢測Bt基因是否翻譯出mRNA
提取棉花細胞mRNA
逆轉錄
產生DNA
對擴增產物進行檢測
用與Bt基因相關的
引物進行PCR擴增
Bt
M3
C0
T-9
T-2
T-51
T-5
T-23
T-11
T-20
T-21
T-34
T-10
10個PCR陽性棉花植株中，有四株Bt基因發生轉錄
目的基因的檢測與鑒定—分子水平的檢測
② 檢測目的基因是否轉錄出了mRNA
—通過PCR等技術檢測
RNA分子雜交(Northern Blot)流程圖
轉基因生物
標記的基因探針
—分子雜交技術
② 檢測目的基因是否轉錄出了mRNA
2.表達水平的檢測
進行轉錄水平的檢測原理與復制水平的檢測原理相似，只是被檢測的物質不再是轉基因生物的基因組DNA，而是轉基因生物細胞內的 mRNA；進行翻譯水平的檢測則是利用抗原與抗體特異性結合的原理。
拓展延伸—學習筆記P65
③檢測目的基因是否翻譯出相應蛋白質
如：檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白
過程：提取轉基因植物的蛋白質+相應抗體 → 是否出現雜交帶
如：檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白
蘇云金芽孢桿菌
提取
Bt抗蟲蛋白
注射小鼠體內
抗體
標記抗體
提取蛋白
電泳分離
抗原
抗體
雜交
轉基因生物
放射性檢測
（雜交帶）
抗原與抗體的特異性結合
原理：
目的基因的檢測與鑒定—分子水平的檢測
抗原—抗體雜交
目的基因是否表現出相應的性狀
采摘抗蟲棉葉片
飼喂
棉鈴蟲
觀察棉鈴蟲存活情況
目的基因的檢測與鑒定—個體生物學水平鑒定
—檢測是否具有抗性以及抗性強度等
方法：抗蟲、抗病接種實驗
獲取質粒、
噬菌體等載體
篩選和獲取目的基因
檢測和鑒定目的基因是否穩定維持和表達其遺傳特性
將含有目的基因的表達載體導入受體細胞
用限制酶切割載體和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA連接酶連接，構建基因表達載體
基因工程的基本操作流程圖
基因工程的基本操作步驟
1.人工合成目的基因
2.常用PCR特異性地快速擴增目的基因
獲取目的基因的方法
目的基因的篩選與獲取
3.從基因文庫中獲取
基因文庫
基因組文庫
cDNA文庫
2.從基因文庫中獲取
基因文庫
cDNA文庫
將某種生物體內的DNA全部提取出來，選用適當的限制酶，將DNA切成一定范圍大小的DNA片段，然后，將這些DNA片段分別與載體連接起來，導入受體菌的群體中儲存，每個受體菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是說，這個群體包含了這種生物的所有基因，叫做這種生物的基因組文庫。
基因組文庫
適當的不同限制酶切割
與質粒連接
每個受體菌都含有了一段不同的DNA片段。這個群體包含了這種生物的所有基因，叫做這種生物的基因組文庫。
該受體菌群為基因組文庫
基因組文庫
某種生物體內的全部DNA
受體菌
如果用某種生物發育的某個時期的mRNA 反轉錄產生的多種互補DNA(也叫cDNA)片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，那么，這個受體菌群體就叫做這種生物的cDNA文庫。
某種生物體內的全部DNA
某個時期
基因選擇性表達
轉錄
轉錄
轉錄
轉錄
mRNA
翻譯
翻譯
翻譯
翻譯
蛋白質
cDNA文庫
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非編碼區
非編碼區
編碼區
(編碼mRNA)
啟動子
終止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
轉錄
mRNA
某原核細胞基因
反轉錄
GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC
CA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG ……
GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC ……
cDNA
復制
雙鏈DNA
受體菌
無啟動子、終止子等非編碼區
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非編碼區
非編碼區
編碼區
(編碼mRNA)
啟動子
終止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
轉錄
某真核細胞基因
外顯子
內含子
外顯子
內含子
外顯子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
初始mRNA
成熟mRNA
反轉錄
GT …… ATCCTAGGTCTAC
GT …… ATCCTAGGTCTAC
CA …… TAGGATCCAGATG
復制
受體菌
無啟動子、終止子等非編碼區及無內含子
文庫類型 cDNA文庫 基因組文庫
文庫大小
基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）
基因中內含子（位于編碼蛋白質序列內的非編碼DNA片段）
基因多少
小
大
無
有
無
有
某種生物的部分基因
某種生物的全部基因
cDNA文庫與基因組文庫的比較
網絡構建

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