資源簡介

(共29張PPT)
3.2.1 基因工程的基本操作程序
本節(jié)聚焦：
1.基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？
2.基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法
從社會中來
【資料1】我國是棉花的生產(chǎn)和消費大國。棉花在種植過程中，常常會受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見。
【資料2】蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)，破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲,用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害。
我們能否培育出自身就能抵抗蟲害的棉花新品種呢？
思考
00
從社會中來
【資料3】科學(xué)家通過實驗，將蘇云金桿菌的Bt抗蟲基因(殺蟲基因)轉(zhuǎn)到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟(jì)效益450億元。
請結(jié)合我們學(xué)習(xí)過的內(nèi)容思考，
培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？
思考
00
從社會中來
蘇云金桿菌
普通棉花
（無抗蟲特性）
棉花細(xì)胞
抗蟲棉
提取
表達(dá)Bt基因
導(dǎo)入
與載體拼接
Bt基因
重組DNA分子
④目的基因的檢測與鑒定
①目的基因的
篩選與獲取
②基因表達(dá)
載體的構(gòu)建
③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
00
基因工程的基本操作程序（4個步驟）
1
2
3
4
目的基因的篩選與獲取
基因表達(dá)載體的構(gòu)建
將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
目的基因的檢測與鑒定
目的基因的篩選與獲取
一、目的基因
（1）概念：
用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因；
與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。（Bt抗蟲蛋白基因：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉）。
主要是編碼特定蛋白質(zhì)的基因，也可以是具有調(diào)控作用的因子
（2）實例：
目的基因的篩選與獲取
二、篩選合適的目的基因
方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。
DNA測序儀
核苷酸序列比對
氨基酸序列比對
美國國家生物信息中心
越來越多基因的功能和結(jié)構(gòu)被分析。
目的基因的篩選與獲取
三、目的基因的獲取
方法：利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。
概念
獲取目的基因的三種方法：
①人工合成獲取
②從基因文庫獲取
③通過PCR技術(shù)獲取
體內(nèi)DNA復(fù)制參與的組分 在DNA復(fù)制中的作用 PCR中參與的組分
打開DNA雙鏈
提供DNA復(fù)制的模板
合成DNA子鏈的原料
催化合成DNA子鏈
使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸
解旋酶
DNA母鏈
4種脫氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（通常為小的單鏈RNA）
無需解旋酶，用高溫代替
DNA（目的基因）模板
4種脫氧核苷酸(dNTP)
耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）
引物（通常為小的單鏈DNA）
反應(yīng)還需要其它條件，如緩沖液（一般添加Mg2+）、和控溫設(shè)備
目的基因的篩選與獲取
目的基因的篩選與獲取
三、目的基因的獲取
過程
模板DNA
變性 復(fù)性 延伸
方法：利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
5’
5’
3’
3’
95℃
目的基因的篩選與獲取
過程
95℃
1.變性：加熱至90～95℃，雙鏈DNA間的氫鍵斷裂，解旋為單鏈。
變性 復(fù)性 延伸
三、目的基因的獲取
三、目的基因的獲取
—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
5’
3’
5’
3’
使用耐高溫的Taq酶保證高溫條件下仍具有活性。
目的基因的篩選與獲取
50℃
引物1
引物2
DNA引物
2.復(fù)性：冷卻至55～60℃，兩條引物與單鏈DNA結(jié)合
過程
三、目的基因的獲取
三、目的基因的獲取
—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
變性 復(fù)性 延伸
5’
3’
5’
3’
引物結(jié)合在模板DNA鏈的3’端，新合成的子鏈方向為5’到3’。
目的基因的篩選與獲取
過程
引物1
引物2
72℃
Taq酶
Taq酶
變性 復(fù)性 延伸
3.延伸：加熱至70～75℃，以目的基因為模板，合成互補(bǔ)的新DNA鏈。
三、目的基因的獲取
三、目的基因的獲取
—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
目的基因的篩選與獲取
第1輪結(jié)束
第2輪開始
第一輪結(jié)束：此時目的基因的量是原始的2倍。
三、目的基因的獲取
過程
變性 復(fù)性 延伸
三、目的基因的獲取
—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
目的基因的篩選與獲取
三、目的基因的獲取
過程
95℃
50℃
72℃
Taq
Taq
Taq
Taq
變性 復(fù)性 延伸
三、目的基因的獲取
—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
目的基因的篩選與獲取
三、目的基因的獲取
過程
95℃
50℃
72℃
Taq
Taq
Taq
Taq
變性 復(fù)性 延伸
三、目的基因的獲取
—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
目的基因的篩選與獲取
第2輪結(jié)束
第二輪結(jié)束：此時目的基因的量是原始的22倍。
三、目的基因的獲取
過程
變性 復(fù)性 延伸
三、目的基因的獲取
—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
目的基因的篩選與獲取
三、目的基因的獲取
擴(kuò)增方式：
—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
以指數(shù)方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）
2n
（1）若開始只有一個DNA提供模板，則循環(huán)n次后獲得的子代DNA數(shù)目為 個。
（2）若開始有N個DNA提供模板，則循環(huán)n次后獲得的子代DNA數(shù)目為 個。
2n
N 2n
瓊脂糖凝膠電泳
DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就叫電泳。
思考：2、如何對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？
目的基因的篩選與獲取
思考： PCR技術(shù)獲取目的基因時至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？
5’
3’
5’
5’
第一次循環(huán)
第二次循環(huán)
3’
5’
第三次循環(huán)
3’
3’
PCR擴(kuò)增“目的基因”的注意事項
1. PCR的原理？
2. PCR的基本條件？
3. PCR的擴(kuò)增過程？
4. PCR的結(jié)果？產(chǎn)物？
5. PCR擴(kuò)增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列嗎？
6. PCR過程中設(shè)計引物的目的是？引物的堿基能否互補(bǔ)？
7. 引物是單鏈還是雙鏈？是短DNA鏈還是短RNA鏈？引物結(jié)合到DNA模板鏈的3'端還是5'端？子鏈結(jié)合到引物的3'端還是5'端？
DNA半保留復(fù)制
高溫、DNA模板、2種不同的引物、4種脫氧核苷酸、Taq酶
變性、復(fù)性、延伸
每循環(huán)一次，目的基因的量可增加一倍，即呈指數(shù)型增長
兩個引物之間的DNA片段
不需要，只要知道目的基因的兩端部分核苷酸序列即可，以便根據(jù)這部分序列合成引物
DNA復(fù)制不能從頭開始復(fù)制，DNA聚合酶只能從引物的3'端開始延伸
不能，引物需要與模板鏈互補(bǔ)。如果引物的堿基序列互補(bǔ)，會影響引物與模板鏈的結(jié)合
3'
3'
5'
5'
目的基因
3'
5'
3'
5'
A
B
得到雙鏈等長的目的基因
片段____個
0
PCR擴(kuò)增“目的基因”的計算規(guī)律
模板DNA：
長鏈-長鏈 DNA
本輪需要引物____個
2
第1次擴(kuò)增
Taq
Taq
5'
3'
5'
3'
(高溫)變性→(低溫)復(fù)性→(中溫)延伸
需要引物__________種
2
引物的本質(zhì)：能與DNA母鏈的一段堿基序列
互補(bǔ)配對的一小段單鏈核苷酸
最終目的：獲取和擴(kuò)增一對引物之間的DNA片段
注意引物與模板的結(jié)合端和引物的延伸方向
3'
5'
3'
5'
A
B
3'
5'
3'
5'
B
B
A
B
A
本次需要引物________個
4
第2次擴(kuò)增
前兩輪共需引物____________個
6
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
A
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
得到雙鏈等長的目的基因
片段____個
0
本次需要引物數(shù)= 數(shù)
前后共需引物數(shù)= 數(shù)
模板單鏈
一共合成的單鏈總
3'
5'
3'
5'
A
B
B
A
B
A
3'
5'
A
第3次擴(kuò)增
本次需要引物________個
8
前三輪共需引物____________個
14
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
A
B
A
B
A
B
A
B
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
得到雙鏈等長的目的基因
片段____個
2
3'
5'
A
第4次擴(kuò)增
B
A
B
A
B
A
B
A
B
3'
5'
A
B
A
B
本次需要引物____個
16
前四輪共需引物_____個
30
得到雙鏈等長的目的基因片段____個
8
小結(jié)：一個含目的基因的DNA,復(fù)制n次：
①需要引物______種
②n次復(fù)制過程中共需引物___________個
③第n次復(fù)制需要引物_____個
④子代DNA中等長鏈DNA分子數(shù)__________個
2
2n＋1-2
2n
2n-2n
PCR擴(kuò)增在PCR儀中自動完成，完成后用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物
目的基因的篩選與獲取·
01
1．下列有關(guān)獲取目的基因的敘述，錯誤的是(　　)
A．目的基因就是編碼蛋白質(zhì)的基因
B．獲取目的基因是基因工程的第一步
C．來自蘇云金桿菌的Bt抗蟲蛋白基因可作為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因
D．序列比對工具的應(yīng)用為科學(xué)家找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會
A
也可以是一些具有調(diào)控作用的因子，×；
目的基因的篩選與獲取·
01
2．如圖表示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的部分過程，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似。
下列有關(guān)敘述錯誤的是(　　)
D
A．耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端
B．在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段
C．引物之間或引物自身發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，則不能有效擴(kuò)增目的基因
D．從理論上推測，第三輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段占3/4
第三輪循環(huán)共產(chǎn)生8個DNA，其中含有引物A的DNA是7個，即占7/8，×；

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