資源簡介

第1節(jié)重組DNA技術(shù)
的基本工具
從社會中來
番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲，當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會大大下降。科學(xué)家通過精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒DNA雙螺旋的直徑只有2 nm，對如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門的“分子工具”。
轉(zhuǎn)基因木瓜
環(huán)斑病毒的
非轉(zhuǎn)基因木瓜
限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶，載體。
限制性內(nèi)切核酸酶：
DNA連接酶：
載體：
這些 “分子工具”各具有什么特征呢？
那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？
準(zhǔn)確切割DNA分子，得到所需要的目的基因。
能將目的基因連接到載體上。
能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中。
一、限制性內(nèi)切核酸酶--“分子手術(shù)刀”
1、來源：
主要從原核生物中分離純化出來
2、種類：
迄今分離的限制酶有數(shù)千種
3、作用特點(diǎn)：
具有專一性。具體表現(xiàn)如下
4、作用部位:
特定切點(diǎn)上的磷酸二酯鍵
5'
3'
5'
3'
T
A
G
G
T
A
T
C
C
A
磷酸二酯鍵
①能夠識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列。
②使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
5、兩種常用的限制酶：
限制酶的命名是根據(jù)細(xì)菌種類而定，以EcoRI為例:
E：Escherichia (屬)
co：coli (種)
R：RY13 (品系)
I：首先發(fā)現(xiàn) 在此類細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的順序
EcoRⅠ：大腸桿菌（Escherichia coli）R型菌株中分離出的第一個限制酶；
SmaⅠ：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分離出的第一個限制酶。
EcoRⅠ和SmaⅠ
黏性末端
黏性末端
（1）EcoRI限制酶的切割:
當(dāng)限制酶在它識別序列得中軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是黏性末端。
只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。
中軸線
中軸線
（2）SmaI限制酶的作用
只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。
當(dāng)限制酶在它識別序列中軸線處切開時，產(chǎn)生的是平末端。
在C和G之間切開
6、結(jié)果：
產(chǎn)生黏性末端或平末端
7、限制酶的識別序列的特點(diǎn)
(1)大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成。例如：EcoRⅠ、SmaⅠ
(2)少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成
(3)限制酶特異性識別和切割的部位具有回文序列
1.你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？
破壞外源DNA，保護(hù)自我
2.為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？
缺乏特定的核苷酸序列
思考·討論
3．請寫出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？
同種限制酶產(chǎn)生的黏性末端相同，
不同的限制酶可能會形成相同的黏性末端。
4．請結(jié)合下圖，推斷限制酶切一次可斷開幾個磷酸二酯鍵？產(chǎn)生多少游離的磷酸基團(tuán)？產(chǎn)生幾個黏性末端？消耗幾分子水？
斷開兩個磷酸二酯鍵；產(chǎn)生2個游離的磷酸基團(tuán)；
產(chǎn)生2個黏性末端；消耗兩分子水。
EcoRⅠ
黏性末端
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
……CTACGATG
……GATGCTACTTAA
AATTCCCTAA……
GGGATT……
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
黏性
末端
目的基因
練習(xí)：使用EcoRI剪切目的基因
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同種限制酶切割(EcoRⅠ)
把兩種來源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？
缺口怎么辦？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
二、DNA連接酶--“分子縫合針”
把切下來的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA連接酶來完成的。即將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的 。
DNA連接酶主要有兩類 ：
、 。
2.
E.coli DNA連接酶
T4 DNA連接酶
磷酸二酯鍵
1.DNA連接酶的作用
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來；
（1）E.coli DNA連接酶
兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來。
注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口，但不能將單個脫氧核苷酸連接到DNA鏈上！
（2）T4 DNA連接酶
還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
DNA連接酶--“分子縫合針”
2
類型
來源
功能
相同點(diǎn)
差別
E·coli DNA連接酶
T4DNA連接酶
大腸桿菌
T4噬菌體
恢復(fù)磷酸二酯鍵
只能連接黏性末端
能連接黏性末端和
平末端(效率較低)
DNA連接酶
DNA連接酶
A
T
A
G
T
C
C
G
A
A
T
T
連接兩個DNA片段
與DNA聚合酶區(qū)別：
C
A
A
T
T
DNA聚合酶
G
A
G
T
A
T
C
DNA聚合酶
連接單個脫氧核苷酸形成單鏈
DNA連接酶
DNA聚合酶
相同點(diǎn)
作用實(shí)質(zhì)
化學(xué)本質(zhì)
不
同
點(diǎn)
模板
作用對象
作用結(jié)果
用途
都能催化形成磷酸二酯鍵
都是蛋白質(zhì)
不需要
需要
形成完整的重組DNA分子
形成DNA的一條鏈
基因工程
DNA復(fù)制
3 DNA連接酶與DNA聚合酶的比較
只能將單個脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵
在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵
名稱
作用部位
作用結(jié)果
限制酶
磷酸二酯鍵
將DNA切成兩個片段
DNA連接酶
磷酸二酯鍵
將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯鍵
將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端
DNA(水解)酶
磷酸二酯鍵
將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
解旋酶
堿基對之間
的氫鍵
將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈
歸納總結(jié)
與DNA相關(guān)的五種酶的比較
根據(jù)所學(xué)知識，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA連接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切斷a處的酶為_______
B.連接a處的酶為_______
C.切斷b處的酶為_______
①
③④⑤
②
a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵
練習(xí)：
工具
分子手術(shù)刀
分子縫合針
分子運(yùn)輸車
限制性內(nèi)切核酸酶：
DNA連接酶：
載體：
準(zhǔn)確切割DNA分子
得到所需要的目的基因
將DNA片段連接起來
即能將目的基因連接到載體上
將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（即能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中）
質(zhì)粒（最常用）
作為載體，將外源基因送入受體細(xì)胞。
1.作用：
動植物病毒
噬菌體
2.種類：
三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車
質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。
3、載體需具備的條件
（1）有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA插入其中。
（2）能在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，
或整合到受體DNA上隨DNA同步復(fù)制
（3）有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA的篩選。
如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因。
（4）對受體細(xì)胞無毒害作用，避免受體細(xì)胞受到損傷
實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。
標(biāo)記基因的篩選原理
載體上的標(biāo)記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細(xì)胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導(dǎo)入了載體的受體細(xì)胞。如圖所示：
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
GCCGTATG…
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
實(shí)例：重組DNA分子的模擬操作
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
GCCGTATG…
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}
載體的作用
載體的
必要條件
載體的種類
①具一個或多個限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。
②能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制
或整合到受體DNA上隨受體DNA復(fù)制
③具有某些標(biāo)記基因，便于重組DNA的篩選。
①作為運(yùn)載工具，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中
②在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制
①質(zhì)粒
②病毒：噬菌體、動植物病毒等。
三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體--“分子運(yùn)輸車”
本節(jié)小結(jié)
基因工程
的工具
限制酶
主要存在于原核生物中
具有專一性(識別序列)
切開DNA分子的磷酸二酯鍵
產(chǎn)生黏性末端或平末端
DNA連接酶
連接磷酸二酯鍵
種類
E.coli DNA連接酶
T4 DNA連接酶
質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒
載體
具備的
條件
具一種至多種限制酶切點(diǎn)
具標(biāo)記基因
能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制
或整合到受體DNA上隨受體DNA復(fù)制
【典例】1.圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。
（1）上述操作中不宜選用Sma I，原因是Sma I會破壞__________和
__________________。
（2）在基因工程的操作中，不宜選用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后，_____________________________________________________。
抗病基因
抗生素抗性基因
目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中
2.用限制酶切割時需注意的事項(xiàng)
(1)獲取目的基因和切割載體時, 通常使用同種限制酶,目的是 。但是使用該法缺點(diǎn)是容易發(fā)生 ，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是 。
(2)獲取一個目的基因需限制酶切割 次,共產(chǎn)生 個游離的磷酸基團(tuán)。
(3)選擇限制酶切割位點(diǎn)的基本原則：
①切割目的基因時： 。
②切割質(zhì)粒時： 。
為了產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接
兩
4
分別使用兩種限制酶去切割目的基因和運(yùn)載體
目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接
能切下目的基因且不破壞目的基因
至少保留一個完整的標(biāo)記基因，便于篩選
練習(xí)與應(yīng)用
3.如圖是培育表達(dá)人乳鐵蛋白的乳腺生物反應(yīng)器的技術(shù)路線
用圖2中的人乳鐵蛋白目的基因和圖1所示的質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒時，選用的限制酶是
　 （從“EcoRⅠ”“BamHⅠ/HindⅢ”“SmaⅠ/HindⅢ”中選擇）．不能選擇其他限制酶的理由分別是：
。
BamHⅠ/HindⅢ
若選EcoRⅠ會破壞質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)；若選SmaⅠ/HindⅢ，則構(gòu)建的重組質(zhì)粒沒有標(biāo)記基因或復(fù)制原點(diǎn)
(1)限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列( )
(2)DNA連接酶能將兩堿基間通過氫鍵連接起來( )
(3)E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端( )
(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同( )
(5)質(zhì)粒是雙鏈環(huán)狀DNA分子，是基因工程常用的載體。( )
×
×
×
×
√
【基礎(chǔ)過關(guān)】
2.實(shí)驗(yàn)原理：
探究·實(shí)踐·DNA的粗提取與鑒定
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。
（2）DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
（3）在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色。
0
0.14
NaCI濃度（mol/L）
DNA溶解度
1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路：
四
DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法去除其他成分，對DNA進(jìn)行提取。
探究·實(shí)踐·DNA的粗提取與鑒定
四
DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。
不能選擇哺乳動物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯游锍墒斓募t細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA。
3.選材：
注意：
4.試劑：
①研磨液
②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精
③2mol/L的NaCl溶液
④二苯胺試劑
⑤蒸餾水
——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
——析出DNA
——溶解DNA
——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用
5.方法步驟
探究·實(shí)踐·DNA的粗提取與鑒定
四
析出DNA
DNA的鑒定
研磨
稱取約30g洋蔥切碎，放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
過濾取上清液
在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。
在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，靜置2～3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；
取兩支試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。然后，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。
方法步驟 （視頻）
探究·實(shí)踐·DNA的粗提取與鑒定
四
注意事項(xiàng)
1．以血液為實(shí)驗(yàn)材料時，每100 mL血液中需要加入3 g檸檬酸鈉，防止血液凝固。
2.利用動物細(xì)胞提取DNA破碎細(xì)胞的方法：動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，可直接吸水漲破。
3．加入研磨液后，必須充分研磨，否則細(xì)胞核不會充分破碎，釋放出的DNA量就會減少。
4．加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
5．預(yù)冷的酒精具有以下優(yōu)點(diǎn)：①可抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；②抑制分子運(yùn)動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。
探究·實(shí)踐·DNA的粗提取與鑒定
四
1.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎？
結(jié)果分析與評價(jià)
觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功；如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過程中出現(xiàn)了失誤等。
本實(shí)驗(yàn)粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。
探究·實(shí)踐·DNA的粗提取與鑒定
四
進(jìn)一步探究
實(shí)驗(yàn)室提取純度較高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的SDS溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開；隨后，加入氯仿—異丙醇混合液(體積比為24：1)，通過離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去，取上清液；可重復(fù)上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。此外由于苯酚可以迅速使蛋白質(zhì)變性，抑制核酸酶的活性，因此還可以先用苯酚處理，然后離心分層，這時DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)變性后存在于酚層中，用吸管、微量移液器等實(shí)驗(yàn)用具就可以將兩者分開。
探究·實(shí)踐·DNA的粗提取與鑒定
四
3.與其他同學(xué)提取的DNA進(jìn)行比較，看看實(shí)驗(yàn)結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。
刑偵破案
拓展：DNA提取的應(yīng)用
基因組測序
插入人胰島素基因的大腸桿菌
基因工程
親子鑒定
探究·實(shí)踐·DNA的粗提取與鑒定
四
練習(xí)與應(yīng)用
一、概念檢測
1.DNA連接酶是重組DNA技術(shù)常用的一種工具酶。下列相關(guān)敘述正確的是
A.能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵
B.能將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵
C.能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵
D.只能連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，不能連接雙鏈DNA片段的平末端
2.在重組DNA技術(shù)中，將外源基因送入受體細(xì)胞的載體可以是
A.大腸桿菌的質(zhì)粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D. 用來識別特定基因的DNA探針
C
A
二、拓展應(yīng)用
1.想一想，為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子?
提示：細(xì)菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因?yàn)楹心撤N限制酶的細(xì)胞的DNA分子不具備這種限制酶的識別序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶，也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA入侵。
2.有2個不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI進(jìn)行切割。各限制酶的識別序列和切割位點(diǎn)如下。
（1）哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA片段能與限制酶SpeI切割A(yù)片段產(chǎn)生的DNA片段相連接?為什么?
XbaⅠ。因?yàn)閄baI與SpeI切割產(chǎn)生了相同的黏性末端。
2.有2個不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI進(jìn)行切割。各限制酶的識別序列和切割位點(diǎn)如下。
（2）不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端，這在基因工程操作中有什么意義?
提示：識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。同尾酶使構(gòu)建載體時，切割位點(diǎn)的選擇范圍擴(kuò)大。例如，我們選擇了用某種限制酶切割載體，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有該限制酶的識別序列，那么用該限制酶切割含有目的基因的DNA片段時，目的基因就很可能被切斷；這時可以考慮用合適的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的識別序列）來獲取目的基因。

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