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(共44張PPT)
第1節(jié) 重組DNA技術(shù)的基本工具
【本節(jié)聚焦】
1.重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具是你什么？他們的作用分別是什么？
2.基因工程載體需要具備什么條件？
第三章 基因工程
復(fù)習(xí)提問
DNA分子的中文名，組成元素，基本單位，分子結(jié)構(gòu)？
DNA平面結(jié)構(gòu)
我國是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國，棉花在種植過程中常常會受到棉鈴蟲的侵襲，這會使棉花大量減產(chǎn)。大量施用農(nóng)藥不僅提高了生產(chǎn)成本，還可能造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的污染。普通棉花不抗蟲，蘇云金桿菌有一種“抗蟲基因”，能表達(dá)出抗蟲蛋白來殺死棉鈴蟲。
棉鈴
棉鈴蟲
雜交育種？誘變育種等技術(shù)能否實(shí)現(xiàn)？為什么？
培育出自身能抵抗蟲害的棉花新品種？
雜交育種：同種生物之間進(jìn)行；
誘變育種：在原有基因基礎(chǔ)上發(fā)生基因突變，結(jié)果產(chǎn)生新的等位基因（不定向）
普通棉花
轉(zhuǎn)基因抗蟲棉
蘇云金桿菌
Bt蛋白基因
Bt蛋白
殺死害蟲
01 基因工程的理論基礎(chǔ)（1）棉花和蘇云金桿菌的遺傳物質(zhì)都是_________。（2）不同生物的DNA分子能夠拼接在一起，是因?yàn)開__________________________________________________________。（3）同一種基因在不同生物體內(nèi)表達(dá)出來的蛋白質(zhì)相同，因?yàn)開________________________________________________________。（4）遺傳信息的傳遞都遵循________法則。DNADNA的組成單位、空間結(jié)構(gòu)和堿基互補(bǔ)配對方式相同所有生物共用一套遺傳密碼中心P67
◎ 基因工程
按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在 DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的，因此又叫做重組 DNA 技術(shù)。
①操作對象：
②操作水平：
③原理：
④結(jié)果：
⑤優(yōu)點(diǎn)：
基因（DNA），體外
DNA 分子水平
基因重組
創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品
定向改造生物遺傳特性；克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙
水母的綠色熒光蛋白基因
“分子手術(shù)刀”
“分子縫合針”
“分子運(yùn)輸車”
抗蟲基因與運(yùn)載體DNA“縫合”
抗蟲基因(目的基因)提取出來
抗蟲基因進(jìn)入棉花（受體細(xì)胞）
模擬從DNA分子中剪取所需的目的基因
思考1：1.剪刀代表哪種“分子工具”
2.剪刀破壞的是DNA的什么結(jié)構(gòu)？
3.使用DNA水解酶可以嗎？
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
磷酸二酯鍵
基因工程的分子工具 （一）
限制性內(nèi)切核酸酶 ——“分子手術(shù)刀”
1、別稱：
2、來源：
（一）限制性內(nèi)切核酸酶 ——“分子手術(shù)刀”
主要來自原核生物
限制酶
3、種類：
4、化學(xué)本質(zhì) :
5、作用 :
6、識別序列：
P71
數(shù)千種
限制酶不是一種酶，而是一類酶
7、結(jié)果：
原核生物容易受到自然界外源 DNA 的入侵，所以它在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制。限制酶是細(xì)胞的一種防御性工具。當(dāng)原核細(xì)胞遭到外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效。
P71
【思考】為什么限制酶不切割自身的DNA分子？ P74課后題
①其DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列，
②通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。
簡記為：原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已被修飾
簡記為：切割外源DNA、使之失效，以保證自身安全
例、EcoRI 酶切示意圖
限制酶的識別序列具有180°旋轉(zhuǎn)對稱的回文結(jié)構(gòu)
G
C
T
T
A
A
G
5‘
3‘
3‘
5‘
A
A
T
T
C
識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列特征：兩條鏈從5`→3`的堿基順序相同。
回文詩《萬柳堤即景》
春城一色柳垂新，色柳垂新自愛人。
人愛自新垂柳色，新垂柳色一城春。
回文結(jié)構(gòu)
識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列特征：兩條鏈從5`→3`的堿基順序相同。
例、EcoRI 酶切示意圖
中軸線
假想的對稱軸（對稱面）
例、SmaⅠ酶切示意圖
情況1：當(dāng)限制酶在它識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是黏性末端；
情況2：當(dāng)限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，產(chǎn)生的則是平末端。
例1、據(jù)下圖分別寫出Bgl Ⅱ與BamHⅠ酶切后形成的黏性末端為 、 。
給分細(xì)節(jié)：
1、正確寫出單鏈突出部分 + 雙鏈部分
2、可以標(biāo)注方向
例2、判斷兩個黏性末端是否為同一種限制酶切割產(chǎn)生
① —A
—TGATC
④ CTAGA—
T—
② CTAGT—
A—
③ —T
—AGATC
①②
③④
方法：辨別兩個黏性末端是否為同一種限制酶切割的關(guān)鍵是看識別序列是否完全一致，
即：①一看裸露堿基是否相互配對；②二看切割位點(diǎn)是否相同。
也可將其中1個黏性末端旋轉(zhuǎn)180°，能完全重合的就是由同一種限制酶切割得到的
例3、下圖所示四種限制酶切割得到的粘性末端是否相同？
相同
方法：辨別兩個黏性末端是否相同僅看裸露堿基是否相互配對即可，不需要看切割位點(diǎn)。
拓展：不同限制酶識別不同序列，但切割后產(chǎn)生相同的黏性末端，這樣的酶被稱為：同尾酶。
1、別稱：
2、來源：
【筆記整理】限制性內(nèi)切核酸酶 ——“分子手術(shù)刀”
主要來自原核生物
限制酶
3、種類：
數(shù)千種
4、化學(xué)本質(zhì) :
蛋白質(zhì)
限制酶不是一種酶，而是一類酶
5、作用 :
（1）識別：能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列；
（2）切割：使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
酶的專一性
是回文結(jié)構(gòu)/兩條鏈從5`→3`的堿基順序相同
（1）大多數(shù)限制酶識別序列由6個核苷酸組成，例如EcoRⅠ、SmaⅠ，
（2）少數(shù)由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。
6、識別序列：
7、結(jié)果：
（1）不同酶可能會產(chǎn)生相同的黏性末端。
（1）當(dāng)限制酶在它識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時，
產(chǎn)生的是黏性末端；
（2）當(dāng)限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，產(chǎn)生的則是平末端。
8、特點(diǎn)：
（2）同種限制酶切割的黏性末端一定相同。
如：同尾酶
p75
答案（1）Xbal 。因?yàn)?Xbal與 Spel切割產(chǎn)生了相同的黏性末端。
答案（2）不同的限制酶切割能產(chǎn)生相同粘性末端的積極意義是：使切割位點(diǎn)的選擇范圍擴(kuò)大，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的靈活性。
例如，我們選擇了用某種限制酶切割載體，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有該限制梅的識別序列，那么用該限制酶切割含有目的基因的 DNA 片段時，目的基因就很可能被切斷；這時可以考慮用合適的同尾酶來獲取目的基因（目的基因的核苷放序列中不能有它的識別序列）。
基因工程的分子工具 （二）
DNA連接酶 ——“分子縫合針”
（二）DNA連接酶 ——“分子縫合針”
1、作用：
2、種類：
（二）DNA連接酶 ——“分子縫合針”
P72·原文勾畫
（E.coli DNA連接酶）
（ T4 DNA連接酶）
注：
二者均可連接互補(bǔ)黏性末端與平末端。
E.coli DNA連接酶連接平末端的效率遠(yuǎn)低于T4 DNA連接酶
分析1：黏性末端和平末端的連接效率有差異原因是什么？
筆記：
1、黏性末端因堿基互補(bǔ)配對提高了連接效率；
2、平末端無堿基互補(bǔ)，依賴酶與DNA的隨機(jī)碰撞，連接概率相對更低；
分析2：如何有效提高平末端的連接效率？
可通過增加DNA濃度、連接酶用量、ATP量，延長反應(yīng)時間改善這個問題。
p72
【回顧】
2、DNA聚合酶的作用
【比較】DNA聚合酶與DNA連接酶
分析1：DNA復(fù)制時，新鏈的合成需要什么酶？
分析2：而把DNA片段‘粘’在一起又需要什么酶？
分析3：DNA聚合酶和連接酶都能形成磷酸二酯鍵，但它們作用的化學(xué)鍵位置相同嗎？
分析4： 二者在“工作時”都需要模板和引物嗎？
DNA聚合酶
DNA連接酶
不同， DNA聚合酶在“延伸新鏈”， DNA連接酶在“縫合缺口”。
DNA聚合酶需要模板的指導(dǎo)、引物的3‘-OH末端提供“工作”起點(diǎn)， DNA連接酶主要起修復(fù)作用，不需要模版與引物
【筆記】DNA聚合酶與DNA連接酶
特性 DNA聚合酶 DNA連接酶
主要功能 合成新DNA鏈 連接DNA缺口
模板依賴 需要模板 不需要模板
引物需求 需要引物 不需要引物
作用部位 （化學(xué)鍵） 形成磷酸二酯鍵 形成磷酸二酯鍵
作用結(jié)果 將單個脫氧核苷酸依次 連接到單鏈末端 將兩個DNA片段
連接為一個DNA分子
釋疑： DNA聚合酶不能從頭啟動DNA新鏈的合成，必須依賴已有的
3‘-OH末端作為起點(diǎn)添加核苷酸，
而引物的作用就是提供3‘-OH末端。
注：DNA連接酶沒有識別序列的特異性。
名稱 作用部位 作用結(jié)果
限制酶 磷酸二酯鍵 將DNA切成兩個片段
DNA連接酶 磷酸二酯鍵 將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯鍵 將單個脫氧核苷酸依次連接到
單鏈末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯鍵 將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
解旋酶 堿基對之間 的氫鍵 將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，
形成兩條長鏈
【小結(jié)】與DNA相關(guān)的五種酶
基因工程的分子工具 （三）
基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”
為什么需要載體？直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞可以嗎？
不可以
第一：外源基因不能自己進(jìn)入細(xì)胞，需要載體幫忙。
第二：即便能直接把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，外源基因在細(xì)胞內(nèi)不能進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定存在，需要載體幫忙。
第三：載體帶有標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因），可以幫助科學(xué)家找到成功接收外源基因的細(xì)胞。
（三）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”
1、作用：
（1）將外源基因送入受體細(xì)胞，
（2）在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。
（三）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”
在細(xì)胞中自主復(fù)制
整合至受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。
筆記：直接把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，外源基因在細(xì)胞內(nèi)不能進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定存在。
（1）常用載體：質(zhì)粒
2、類型：
（2）其他載體：噬菌體、動植物病毒等
它們來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大的差別。
（1）常用載體：質(zhì)粒
①來源：主要是原核生物
②結(jié)構(gòu)：裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的環(huán)狀雙鏈DNA分子。
質(zhì)粒
②結(jié)構(gòu)：裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的環(huán)狀雙鏈DNA分子。
用于篩選成功轉(zhuǎn)入的細(xì)胞
有1個至多個限制酶切位點(diǎn)，供插入外源基因
可通過人工改造，得到多克隆位點(diǎn)（MCS）
增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的靈活性
【注意】抗生素抗性基因≠抗生素基因
保證載體能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制
注：基因工程操作中被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。
質(zhì)粒
含目的基因的DNA片段
重組質(zhì)粒
受體細(xì)胞
導(dǎo)入
目的基因
【模擬】載體將外源基因送入受體細(xì)胞的過程
分析1：質(zhì)粒一定能成功導(dǎo)入受體細(xì)胞嗎？
答案：不一定能成功導(dǎo)入，因?yàn)檩d體攜帶目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的成功率不高。因此需要篩選出導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞。
分析2：如何篩選？
氨芐青霉素抗性基因
導(dǎo)入
未導(dǎo)入
未導(dǎo)入
含氨芐青霉素的培養(yǎng)基
存活并增殖
死亡
目的基因
載體攜帶目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的成功率不高，需要篩選出導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞。
【小結(jié)】載體需要具備的條件（以質(zhì)粒為例）
條件1：載體DNA必須是安全的，不會對受體細(xì)胞有害，
不會影響受體細(xì)胞正常的生命活動。
條件2： DNA分子上有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)，
供外源DNA片段（基因）插入其中。
條件3：攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后，能在細(xì)胞中進(jìn)行
自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。
條件4：人工改造的質(zhì)粒上常有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA分子
的篩選。
注意：標(biāo)記基因不都是抗生素的抗性基因，常見的標(biāo)記基因有
①抗生素的抗性基因，②熒光蛋白基因
深度思考：使用DNA連接酶后是否一定能將目的基因與載體成功連接？嘗試分析影響連接的因素。
反向拼接的重組質(zhì)粒
環(huán)化
的質(zhì)粒
環(huán)化
目的基因
筆記：連接失敗的原因：
①末端不匹配、②酶失活、③溫度不當(dāng)（通常需16°C）、
④載體環(huán)化、⑤質(zhì)粒環(huán)化、
⑥目的基因與質(zhì)粒反向連接，造成目的基因不能正確表達(dá)。
分析：如何有效避免環(huán)化現(xiàn)象？
雙酶切
用兩種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段
構(gòu)建基因表達(dá)載體
限制酶a切割
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
DNA連接酶連接
a
b
a
b
黏性末端a與b不同，可避免上述問題；
筆記：連接失敗的原因：
①末端不匹配、
②酶失活、
③溫度不當(dāng)（通常需16°C）、
④載體環(huán)化、
⑤質(zhì)粒環(huán)化、
⑥目的基因與質(zhì)粒反向連接，
造成目的基因不能正確表達(dá)。
筆記：雙酶切的優(yōu)點(diǎn)：
①質(zhì)粒不會環(huán)化/自連；
②目的基因不會環(huán)化/自連；
③目的基因與質(zhì)粒不會反向連接
解決辦法：雙酶切
指：用兩種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段
P73
根據(jù)圖中的相關(guān)信息找到兩條片段上EcoR I 的識別序列和切割位點(diǎn)。 然后，用剪刀進(jìn)行“切割”。待切割位點(diǎn)全部切開后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠條將切口粘連起來。
3' -TATCGTACGATAGGTACTTAA
5' -ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC- 3'
GCCGTATG- 5'
5' -TCCTAG
3' -AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC- 3'
GGTATG- 5'
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
討論2：你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對？如果不能，可能是
什么原因造成的？
討論1：剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。
可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)的選擇不對（也可能是其他原因）。比如在書寫將要重組的兩個DNA分子時，一般要求有同一種限制酶的識別和切割位點(diǎn)，這樣切割后才會露出相同的黏性末端，否則黏性末端不同，堿基就無法配對。
討論3：你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？
不能。真正的基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段，且含有幾百至幾千個不等的堿基對。
【小結(jié)】基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”
【總結(jié)】

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