資源簡介

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基因工程發展歷程
1944年艾弗里等人通過肺炎鏈球菌的轉化實驗，不僅證明了遺傳物質是DNA，還證明了DNA可以在同種生物個體間轉移。
1961年尼倫伯格和馬太破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。截至19666年，64個密碼子均被破譯成功。
1970年科學家在細菌中發現了第一個限制性核酸內切酶（簡稱限制酶）
1972年，伯格首先在體外進行了DNA的改造，成功構建了第一個體外重組DNA分子。
1982年，第一個基因工程藥物-重組人胰島素被批準上市?；蚬こ趟幬锍蔀槭澜绺鲊芯亢屯顿Y開發的熱點。
1953年沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結構模型并提出了遺傳物質自我復制的假說。
1967年，科學家發現，在細菌擬核DNA之外的質粒有自我復制能力，并可以在細菌細胞間轉移。
20世紀70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉錄酶被相繼發現。這些發現為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創造了條件。
1973年，科學家證明了質?？梢宰鳛榛蚬こ痰妮d體，構建重組DNA，導入受體細胞，使外源基因在原核細胞中成功表達，并實現了物種間的基因交流。至此，基因工程正式問世。
1985年，穆里斯等人發明PCR,為獲取目的基因提供了有效手段。
我國是棉花的生產和消費大國，以新疆棉最為著名。在棉花種植過程中，常常會受到棉鈴蟲的侵襲，這會使棉花大量減產。
蘇云金桿菌
雜交育種？
同種生物之間進行
誘變育種？
不定向
思考：能否培育出自身就能抵抗蟲害的棉花呢
蘇云金桿菌有一種抗蟲基因（Bt毒蛋白基因），它能通過編碼產生抗蟲蛋白來殺死棉鈴蟲。
大量施用農藥不僅提高了生產成本，還可能造成農產品和環境的污染。
基因工程
第3章 基因工程
按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品，從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫做重組DNA技術。
基因（具有遺傳效應的DNA片段）
DNA分子水平
賦予生物新的遺傳特性，創造出人類需要的新的生物類型和生物產品
基因重組
定向改造生物遺傳特性；徹底打破種間界限
操作對象：
操作水平：
結果：
意義：
原理：
有性生殖中的基因重組是隨機的，并且只能在同一物種間進行重組！
我國是棉花的生產和消費大國，以新疆棉最為著名。在棉花種植過程中，常常會受到棉鈴蟲的侵襲，這會使棉花大量減產。大量施用農藥不僅提高了生產成本，還可能造成農產品和環境的污染。
蘇云金桿菌有一種抗蟲基因（Bt毒蛋白基因），它能通過編碼產生抗蟲蛋白來殺死棉鈴蟲。
DNA雙螺旋的直徑只有2nm。
科學家用到了哪些“分子工具”？
這些“分子工具”各具有什么特征呢？
準確切割DNA分子
將DNA片段連接起來
將體外重組好的DNA分子導入受體細胞
本節聚焦:
1、重組DNA技術所需的三種基本工具是什么？它們的作用分別是什么？
2、基因工程載體需要具備什么條件？
3.1 重組DNA技術的基本工具
DNA的基本單位：
脫氧核苷酸
A
腺嘌呤
G
鳥嘌呤
C
胞嘧啶
T
胸腺嘧啶
O
P
CH2
OH
O
OH
H
OH
H
H
H
H
堿基
磷酸
脫氧核糖
DNA的結構
C
T
T
G
A
C
A
G
5’
5’
3’
3’
（1）由 條單鏈按_________方式盤旋成_______結構
反向平行
雙螺旋
2
3',5'-磷酸二酯鍵
CH2
H
OH
H
H
H
H
堿基
磷酸
5’
4’
3’
2’
1’
DNA的結構
A
T
A
T
T
A
G
G
G
C
C
A
T
C
脫氧核糖和堿基交替連接，
構成基本骨架
(2) 外側：
堿基
內側:
(3)
兩條鏈上的堿基通過氫鍵連接形成堿基對，且A只和T配對、G只和C配對，堿基之間的一一對應的關系，就叫作堿基互補配對原則。
氫鍵
堿基對
DNA的結構
一、限制性內切核酸酶（限制酶）——“分子手術刀”
1、來源：
主要從原核生物中分離純化出來，也有少部分來自真核生物
2、種類：
數千種
（限制酶不是一種酶，而是一類酶）
生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌（ Escherichia coli）的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進一步表示成EcoR I。
粘質沙雷氏桿菌（Serratia marcesens）中分離的第一種限制酶即_______；
Sma Ⅰ
流感嗜血桿菌的d菌株（Haemophilus influenzaed）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:____________________________。
Hind Ⅰ、Hind Ⅱ、 Hind Ⅲ
一、限制性內切核酸酶（限制酶）——“分子手術刀”
※命名（P72資料卡）
　
一、限制性內切核酸酶（限制酶）——“分子手術刀”
實例1——EcoR I 限制酶
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
G
5'
5'
G
A
T
3'
C
A
T
C
3'
A
T
A
T
大腸桿菌( E.coli )的EcoRⅠ限制酶能特異性識別 _________序列，并切割___和___之間的____________。
切割后產生__________。
GAATTC
G
A
磷酸二酯鍵
黏性末端
限制酶
DNA兩條單鏈的切口處，伸出幾個核苷酸，剛好能互補配對，這樣的切口叫黏性末端。
實例2——Sma I 限制酶
一、限制性內切核酸酶（限制酶）——“分子手術刀”
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
G
3'
G
G
C
5'
C
C
C
C
5’
C
G
G
G
3'
Sma I 限制酶只能識別 序列，切割 和 之
間的 切開，切割后產生 。
CCCGGG
C
G
磷酸二酯鍵
平末端
Sma I
識別序列：
大多數由6個核苷酸組成；少數由4個、8個或其他數量組成。
1.都可以找到一條中（心）軸線；
特點：
2.識別序列中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的 。
一、限制性內切核酸酶（限制酶）——“分子手術刀”
一、限制性內切核酸酶（限制酶）——“分子手術刀”
1、來源：
主要從原核生物中分離純化出來，也有少部分來自真核生物
2、種類：
數千種
（限制酶不是一種酶，而是一類酶）
3、特點 :
能夠識別 的特定脫氧核苷酸序列，并使每一條鏈中特定
部位的 斷開。
雙鏈DNA分子
磷酸二酯鍵
4、結果
產生黏性末端或平末端
1.寫出下列限制酶切割形成的末端序列
BamHⅠ EcoRⅠ__________________________
Hind Ⅲ Bgl Ⅱ _________________________
-A
-TTCGA
-A
-TCTAG
AGCTT-
A-
GATCT-
A-
（1）同種限制酶切割產生的黏性末端是否相同？
（2）不同限制酶切割產生的黏性末端是否一定不同？
（3）哪種限制酶切割產生的DNA片段能與BamHⅠ切割產生的DNA片段相連接？為什么？
（4）上述片段連接完成后，該重組DNA分子的新連接處能否再被所用的限制酶識別？
相同。
可能相同
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
-G
-CCTAG
-G
-CTTAA
or
GATCC-
G-
or
AATTC-
G-
or
or
學習評價一
2. 請判斷：以下黏性末端是由 種限制酶作用產生的。
3
3、請結合圖示，推斷限制酶切割一次可斷開幾個磷酸二酯鍵？
產生多少個游離的磷酸基團？產生幾個黏性末端？消耗幾分子水？
T T A A
G
C
T T A A
C
G
A A T T
G
C
推斷限制酶切一次：
斷開 個磷酸二酯鍵，產生 個游離的磷酸基團，產生 個黏性/平末端，
消耗 分子水。
兩
2
2
兩
--ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA ……TCCCTAAGAATTC CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
Bt蛋白基因
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
Bt蛋白基因
5’
3’
3’
5’
EcoRⅠ識別 5'-GAATTC-3' 序列，并在G與A之間切割。
蘇云金芽孢桿菌DNA片段中的部分基因
4、要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？ 可產生幾個末端？
P71思考：你能根據所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制。限制酶就是它的一種防御性工具。當外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。
細菌
細菌
細菌
限制酶
思維拓展
P74拓展：為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA
1、通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。
2、通過長期的進化，細菌DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列
思維拓展
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同種限制酶切割(EcoR Ⅰ)
把兩種來源不同的DNA進行重組，應該怎樣處理？
缺口怎么辦？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
1. 作用：
將兩個 連接起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的 。
二、DNA連接酶——“分子縫合針”
注意：不是連接氫鍵?。滏I的形成不需要酶的催化）
DNA片段
磷酸二酯鍵
兩DNA片段要具有相同的(互補的)黏性末端才能拼起來
連接黏性末端
二、DNA連接酶——“分子縫合針”
連接平末端
二、DNA連接酶——“分子縫合針”
1. 作用：
將兩個 連接起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的 。
二、DNA連接酶——“分子縫合針”
注意：不是連接氫鍵?。滏I的形成不需要酶的催化）
E·coli DNA連接酶 T4 DNA連接酶
來源
連接的 末端類型
相同點 大腸桿菌
T4 噬菌體
黏性末端和平末端
（連接平末端效率遠低于T4 DNA連接酶）
黏性末端
和平末端
2. 種類：
恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵
DNA片段
磷酸二酯鍵
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA
聚合酶
DNA
聚合酶
DNA
聚合酶
DNA
聚合酶
DNA
聚合酶
DNA聚合酶將脫氧核苷酸（底物）連接到單鏈末端
DNA連接酶 DNA聚合酶
相同點 作用實質 化學本質 不 同 點 模板
作用對象
作用結果
都能催化形成磷酸二酯鍵
都是蛋白質
不需要
需要DNA的一條鏈作模板
形成完整的重組DNA分子
形成DNA的一條鏈
在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵
1、DNA連接酶與DNA聚合酶的比較
只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵
學習評價二
2、與DNA相關的五種酶的比較
名稱 作用部位 作用結果
限制酶
DNA連接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯鍵
將DNA切成兩個片段
磷酸二酯鍵
將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
磷酸二酯鍵
將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端
磷酸二酯鍵
將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
堿基對之間
的氫鍵
將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈
學習評價一
我們每天吃很多動植物食材，也攝入了它們的DNA，但是我們并沒有因此就被這些DNA操控。
這是因為外源DNA片段難以進入細胞內，即使進入也很難穩定存在并表達。如何將目的基因運送到特定細胞呢？
思考：
1.載體的種類？
2.載體應該具備哪些特點？
“分子運輸車”---載體
將外源基因送入受體細胞，在受體細胞內對目的基因進行大量復制。
1.作用：
三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
來源不同，在大小、結構、復制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別。
2.種類：
質粒（最常用）
動植物病毒
噬菌體
質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環狀雙鏈DNA分子。
3、運載體需具備的條件
條件②：能在細胞中進行自我復制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制
條件①：有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段（基因）插入
條件③ ：常有特殊的標記基因
三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
【問題1】載體要與外源基因連接，需要具備什么條件？
【問題2】要使攜帶的外源基因在受體細胞中穩定存在，載體需要具備什么條件？
【問題3】我們用肉眼看不到載體是否進入受體細胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？
標記基因對重組DNA的鑒定和選擇原理
載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。
在含有該抗生素(如氨芐青霉素)的培養基上，能夠生存的是
。
這是因為__________________________________________________
__________________________________________________________。
被導入了載體的受體細胞
含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，抗性基因在受體細胞內表達，受體細胞對該抗生素產生抗性存活。
思維拓展
根據標記基因的作用， 有同學認為在含有某種抗生素的培養基中篩選存活的受體細胞不一定是導入目的基因的受體細胞， 這種說法是否合理？ 并說明理由。
合理； 因為僅導入載體的和導入目的基因的受體細胞均能在該培養基中存活。
思維拓展
目的基因是要與運載體結合的，那如何處理質粒？
1、選目的基因兩端和運載體有相同的黏性末端；
選擇酶切位點的原則：
2、所選酶切位點不能破壞目的基因以及標記基因。
例： 圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因導入受體細胞的質粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關限制酶的作用部位如圖所示，現欲培養轉基因抗病植株，回答下列問題。
（1）上述操作中不宜選用Sma I，原因是________________________________________。
（2）在基因工程的操作中，不宜只選用EcoR I，原因是_____________________________________________________________________。
Sma I會破壞目的基因和抗性基因
用EcoR I切割，目的基因只有一側含有黏性末端，不能插入到質粒中
學習評價
例：選用下圖載體將目的基因導入細菌中并將含有目的基因的細菌篩選出來。
（1）在培養細菌的培養基中添加抗生素B，則應該選擇的限制酶___________切割質粒插入目的基因。
（2）在培養細菌的培養基中添加抗生素A，則應該選擇的限制酶為___________切割質粒插入目的基因。
①或②
①
三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
在基因工程操作中，天然的載體很難滿足上述全部要求，真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。
大腸桿菌及質粒結構模式圖
若用家蠶作為某基因表達載體的受體細胞， 在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中， 不選用噬菌體作為載體，其原因是什么？
噬菌體的宿主細胞是細菌，不能侵染家蠶細胞，無法將目的基因導入家蠶體細胞中并使其表達； 而昆蟲病毒可以特異性地侵染昆蟲細胞，能將目的基因導入家蠶細胞并實現基因表達。
思維拓展
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC …
GGTATG …
重組DNA分子的模擬操作
思考討論
重組DNA分子的模擬操作
思考討論
1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。
2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補配對 如果不能，可能是什么
原因造成的？
如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對，可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？
不能。
因為基因的長度一般在100個堿基對以上。
限制酶
DNA連接酶
載體
①能自我復制或能整合到宿主DNA上
②有一個至多個限制酶切割位點
③有特殊的標記基因
④對受體細胞無害
質粒、 噬菌體 、動植物病毒
基因工程的基本工具
作為載體的條件
種類:
磷酸二酯鍵
來源：
主要來源于原核生物
特點：
作用部位：
具有專一性
結果：
形成黏性末端或平末端
連接部位：磷酸二酯鍵
種類： E.coli DNA連接酶、T4 DNA連接酶
作用： 把兩條雙鏈DNA片段拼接起來
課堂小結
1.為什么不同生物的DNA分子能拼接起來？
2.為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞內表達？
①DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸；
②都遵循堿基互補配對原則；
③雙鏈DNA分子的空間結構都是規則的雙螺旋結構。
①基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位；
②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則；
③生物界共用一套遺傳密碼。
思考討論
基因工程誕生的理論基礎
探究.實踐---DNA的粗提取與鑒定
一、實驗原理
可以利用DNA、RNA、蛋白質和脂質在理化性質方面的差異，
對它們進行提取
DNA不溶于酒精，某些蛋白質溶于酒精
DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2mol/L的NaCl溶液
2. 在一定的溫度下（沸水?。?，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色，
因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑
【自主學習】閱讀課本74和75頁的探究實踐“DNA的粗提取與鑒定”，明確該實驗的實驗原理及步驟。
二、 材料用具
DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。
1.選材：
2.試劑：
①研磨液
②體積分數為95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺試劑
⑤蒸餾水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鑒定DNA，要現配現用
研磨液成分 作用
SDS 裂解細胞膜，使蛋白質變性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl緩沖液 穩定DNA
（注意：不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）
雞血？
1．30g洋蔥切碎＋10mL研磨液，充分研磨。
三、 實驗步驟
破碎細胞
過濾
目的：裂解細胞，釋放DNA
2．在漏斗中墊上紗布過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取上清液；或1500r/min離心5min，取上清液。
問題1:過濾能否用濾紙代替紗布？
不可以。因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。
問題2:此步驟獲得的上清液中可能含有哪些細胞成分？
可能含有DNA、RNA以及蛋白質、脂質、糖類等。
三、 實驗步驟
破碎細胞
過濾
DNA的析出
問題3:此步驟的目的是？
使蛋白質等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
問題4：酒精預冷的作用？
①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；
②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出；
③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。
3．在上清液中加入體積相等的預冷的95%酒精溶液, 靜置2~3min，溶液中出現的白色絲狀物就是粗提取的DNA 。
三、 實驗步驟
破碎細胞
過濾
DNA的析出
4．用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物；或將溶液倒入塑料離心管中離心，取沉淀物晾干。
問題5：攪拌時應輕緩、并沿一個方向目的？
減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子
析出DNA
5．將絲狀物或沉淀物溶于 溶液中，加入 試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min
三、 實驗步驟
實驗組
對照組
水浴加熱
破碎細胞
過濾
DNA的析出
DNA的鑒定
二苯胺
2mol/L的NaCl
（空白）對照：
在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，將試管置于同等沸水浴中加熱5min。
鑒定結果不明顯的可能原因：
①材料中的核物質沒有充分釋放出來，如研磨不充分或蒸餾水的量不夠。
②加入酒精后搖動或攪拌時過猛，DNA被破壞。
③二苯胺最好現用現配，否則二苯胺變色，影響鑒定效果。
評價結果：
（1）DNA純度： 看提取物顏色
（2）DNA的量： 看與二苯胺反應顏色的深淺

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