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第2節(jié) 基因工程的基本操作程序
本節(jié)聚焦:
基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？
基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些？
第三章 基因工程
二
某DNA片段
5’
3’
3’
你知道如何將Bt基因插入下面DNA片段中嗎？
質(zhì)粒和Bt基因正向連接
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
二
5’
3’
3’
質(zhì)粒和Bt基因反向連接
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
二
某DNA片段
5’
3’
3’
你知道如何將Bt基因插入下面DNA片段中嗎？
質(zhì)粒和Bt基因正向連接
5’
3’
5’
3’
5’
ATCG
5’
3’
5’
3’
GCTA
3.將目的基因?qū)胧荏w細胞
蘇云金桿菌
與載體拼接
普通棉花細胞
抗蟲棉
提取
表達Bt基因
導(dǎo)入
Bt基因
重組DNA分子
1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達載體的構(gòu)建
4.目的基因的 檢測與鑒定
基因工程的基本操作程序
一、目的基因
用于改變受體細胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等的基因就是目的基因。
主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因
如：Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因
Bt抗蟲蛋白
使棉花抗蟲
導(dǎo)入人胰島素基因的大腸桿菌
二、篩選合適的目的基因
序列數(shù)據(jù)庫
序列比對工具
從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選目的基因
問題：篩選出來的目的基因，該怎么獲得它呢？
細胞工程
植物細胞工程
動物細胞工程
植物組織培養(yǎng)
植物體細胞雜交
動物細胞培養(yǎng)
動物細胞融合
動物細胞核移植
應(yīng)用
原理
步驟
原理
步驟
原理
步驟
原理
步驟
原理
步驟
三、利用PCR獲取和擴增目的基因
提取
蘇云金桿菌
PCR
PCR中文名稱：聚合酶鏈式反應(yīng)
PCR原理：DNA半保留復(fù)制
含Bt基因的DNA
Bt基因
Bt基因
Bt基因
Bt基因
【回顧】DNA復(fù)制的過程
參與的組分 在DNA復(fù)制中的作用
打開DNA雙鏈
提供DNA復(fù)制的模板
合成DNA子鏈的原料
催化合成DNA子鏈
體內(nèi)DNA復(fù)制所需的基本條件
解旋酶
DNA母鏈
4種脫氧核苷酸
DNA聚合酶
【回顧】DNA復(fù)制的過程
參與的組分 在DNA復(fù)制中的作用
打開DNA雙鏈
提供DNA復(fù)制的模板
合成DNA子鏈的原料
催化合成DNA子鏈
體內(nèi)DNA復(fù)制所需的基本條件
解旋酶
DNA母鏈
4種脫氧核苷酸
DNA聚合酶
三、利用PCR獲取和擴增目的基因（閱讀課本P77）
1
操作環(huán)境：
2
基本條件：
體外緩沖液（PCR擴增儀/PCR儀）
①模板：
②原料：
③酶：
④2種引物 ：
DNA母鏈
4種脫氧核苷酸
耐高溫的DNA聚合酶
緩沖液中添加Mg2+
引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸
PCR過程
90
50
72
℃
延伸
90
50
72
℃
變性
90
50
72
℃
復(fù)性
90
50
72
℃
變性
變性 ：溫度超過90℃時，雙鏈DNA解聚為單鏈
5`
3`
GGTC
GCTA
3`
5`
CCAG
CGAT
90
50
72
℃
復(fù)性
5`
3`
3`
5`
5`
5`
3`
3`
引物作用：使耐高溫的DNA聚合酶從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。
復(fù)性：兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。
GGTC
GCTA
CCAG
CGAT
CCAG
GCTA
兩種引物能堿基互補配對嗎？
90
50
72
℃
延伸
5`
3`
3`
5`
3`
5`
5`
3`
引物作用：使DNA聚合酶從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。
請同學(xué)們畫出第2,3次循環(huán)
至少要循環(huán) 次，可以獲取目的基因
3
延伸 ：耐高溫的DNA聚合酶將4種脫氧核苷酸連接到引物的3`端
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
目的基因
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
1、引物在PCR中能重復(fù)利用嗎？
不能
2、PCR循環(huán)n次，得到多少個DNA分子？ 消耗了多少個引物？
瓊脂糖凝膠電泳
6
產(chǎn)物鑒定：
較小的DNA片段在凝膠中的移動容易，距離遠，較大的DNA片段移動難，距離短
獲得Bt基因后，靠什么運輸進棉花細胞（受體細胞）？
PCR技術(shù) DNA復(fù)制
相同點 模板 原料 不同點 解旋 方式
場所
酶
能量
結(jié)果
DNA的兩條母鏈
四種脫氧核苷酸
DNA在高溫下變性解旋
解旋酶催化
體外復(fù)制
細胞內(nèi)（主要在細胞核內(nèi)）
耐高溫的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整個DNA分子
7
PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程比較
dNTP（原料）提供
細胞內(nèi)的ATP提供
例1 下列有關(guān)PCR技術(shù)的敘述,錯誤的是 (　　)
A.每一次循環(huán)后目的基因的數(shù)量可以增加一倍
B.PCR反應(yīng)過程中需要3個不同的溫度范圍
C.PCR反應(yīng)過程中加入的酶的顯著特性是耐高溫
D.模板DNA和引物能在每一次擴增中重復(fù)使用
任 務(wù) 活 動
D
二
第二步：基因表達載體的構(gòu)建
5‘
3‘
3‘
5‘
Bt基因
（目的基因）
PCR
Bt基因
EcoRⅠ酶切位點
EcoRⅠ酶切位點
二
第二步：基因表達載體的構(gòu)建
cDNA文庫
5‘
3‘
3‘
5‘
Bt基因
（目的基因）
PCR（設(shè)計引物）
Bt基因
EcoRⅠ酶切位點
EcoRⅠ酶切位點
質(zhì)粒
EcoRⅠ酶切位點
二
第二步：基因表達載體的構(gòu)建
cDNA文庫
5‘
3‘
3‘
5‘
Bt基因
（目的基因）
PCR（設(shè)計引物）
Bt基因！
EcoRⅠ酶切位點
EcoRⅠ酶切位點
質(zhì)粒
EcoRⅠ酶切位點
（目的基因）
Bt基因
二
第二步：基因表達載體的構(gòu)建
Bt基因！
EcoRⅠ酶切位點
EcoRⅠ酶切位點
質(zhì)粒
EcoRⅠ酶切位點
（目的基因）
Bt基因
二
第二步：基因表達載體的構(gòu)建
Bt基因！
EcoRⅠ酶切位點
EcoRⅠ酶切位點
質(zhì)粒
EcoRⅠ酶切位點
Bt基因
（目的基因）
重組DNA分子
基因表達載體構(gòu)建：
復(fù)制原點
標記基因
用同種限制酶或
能產(chǎn)生相同末端的限制酶分別切割含有目的基因的DNA片段，質(zhì)粒。
重組DNA復(fù)制所需結(jié)構(gòu)
標記基因作用：便于重組DNA分子的篩選
啟動子
位置：
功能：
RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
基因的上游
本質(zhì)：
DNA片段
二
第二步：基因表達載體的構(gòu)建
Bt基因
（目的基因）
如果目的基因需要復(fù)制需要什么結(jié)構(gòu)？
復(fù)制原點
如果目的基因需要表達需要什么條件？
需要啟動子和終止子
啟動子和終止子應(yīng)該加在哪？
啟動子
終止子
啟動子類型：
誘導(dǎo)型啟動子
組成型啟動子
組織特異性啟動子
誘導(dǎo)物
作用
誘導(dǎo)型啟動子
激活或抑制
目的基因表達
如：光誘導(dǎo)表達基因啟動子、真菌誘導(dǎo)表達基因啟動子和共生細菌誘導(dǎo)表達基因啟動子等。
二
第二步：基因表達載體的構(gòu)建
Bt基因！
EcoRⅠ酶切位點
EcoRⅠ酶切位點
質(zhì)粒
EcoRⅠ酶切位點
Bt基因
（目的基因）
重組DNA分子
基因表達載體構(gòu)建：
復(fù)制原點
標記基因
重組DNA復(fù)制所需結(jié)構(gòu)
標記基因作用：便于重組DNA分子的篩選
基因表達載體
啟動子
位置：
功能：
RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
基因的上游
終止子
位置：
功能：
基因的下游
轉(zhuǎn)錄的終止信號
本質(zhì)：
DNA片段
本質(zhì)：
DNA片段
啟動(終止)轉(zhuǎn)錄
啟動(終止)翻譯
作用
位于DNA上
位于mRNA上
位置
DNA片段
三個相鄰堿基
本質(zhì)
啟動(終止)子
啟始(終止)密碼子
歸納比較
閱讀教材P80，回答下列問題：
1.獲取Bt基因后，如果直接把目的基因?qū)胧荏w細胞，可能會出現(xiàn)什么樣的結(jié)果？
游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，且游離的DNA片段不能穩(wěn)定遺傳。
為什么要構(gòu)建基因表達載體？
1.使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代
2.同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。
基因表達載體構(gòu)建是基因工程的核心工作。
判斷：基因表達載體和載體是不同的（ ）
---基因工程的核心
問題探討：
1、使用一種DNA限制酶進行切割，是否只會得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？
活動一：基因表達載體的構(gòu)建
用Ecol RⅠ限制酶（識別GAATTC，切割GA之間）切割載體和目的基因。
目的基因能否自連？質(zhì)粒能否自連？目的基因與質(zhì)粒能否反向連接？
---基因工程的核心
問題探討：
1、使用一種DNA限制酶進行切割，是否只會得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？
載體
目的基因
自連
片段間的連接
目的基因自連
質(zhì)粒自連
目的基因與質(zhì)粒連接
目的基因與目的基因連接
質(zhì)粒與質(zhì)粒連接
正向連接 反向連接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
2.如何防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？
問題探討：
活動二：基因表達載體的構(gòu)建
用Ecol RⅠ（識別GAATTC，切割GA之間）和BglⅡ限制酶（識別AGATCT，切割A(yù)G之間），切割載體和目的基因，并將其連接。
雙酶切
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
選擇兩種不同的限制酶同時對目的基因和載體切割，防止目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。
【情境】目的基因?qū)胧荏w細胞之前,需構(gòu)建基因表達載體,圖甲、乙表示質(zhì)粒及目的基因所在DNA片段,圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。
(1)構(gòu)建基因表達載體時需要使用的工具酶為　　　　　　　　　　　　。
(2)用圖中的質(zhì)粒和DNA構(gòu)建基因表達載體時,不能使用SmaⅠ切割,原因是　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　
　。
(3)構(gòu)建基因表達載體時,可用EcoRⅠ同時切割質(zhì)粒和DNA,但會導(dǎo)致
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　等問題,為避免以上問題出現(xiàn),應(yīng)使用 　　 　　　　　　　　　 兩種限制酶。
SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因
目的基因自身環(huán)化、目的基因不能定向連接
BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)
限制酶和DNA連接酶
任務(wù)二　基因表達載體的構(gòu)建(導(dǎo)學(xué)案P75)
【情境】目的基因?qū)胧荏w細胞之前,需構(gòu)建基因表達載體,圖甲、乙表示質(zhì)粒及目的基因所在DNA片段,圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。
任務(wù)二　基因表達載體的構(gòu)建(導(dǎo)學(xué)案P75)
(4)構(gòu)建好的基因表達載體在目的基因前要加上　 　,其是　　 　識別和結(jié)合的部位。
(5)請簡要描述基因表達載體的構(gòu)建過程。

RNA聚合酶
用相同的限制酶分別切割載體和含目的基因的DNA片段,產(chǎn)生末端相同的切口,再用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處。
啟動子
目的基因的篩選與獲取
基因表達載體的構(gòu)建
將目的基因?qū)胧荏w細胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的檢測與鑒定
基因工程的基本操作程序
自主思考：閱讀課本相關(guān)內(nèi)容（P80-81），總結(jié)將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法有哪些？各自適用于什么生物？
三
受體細胞類型
植物細胞
動物細胞
微生物細胞
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
花粉管通道法
我國科學(xué)家獨創(chuàng)
常用
顯微注射法
Ca2+處理法
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
三
植物細胞
花粉管通道法
方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中
含目的基因的DNA 溶液
（我國科學(xué)家獨創(chuàng)）
一
將目的基因?qū)胫参锛毎?br/>第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
（我國科學(xué)家獨創(chuàng)）
三
植物細胞
花粉管通道法
方法二：在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。
一
將目的基因?qū)胫参锛毎?br/>第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
三
花粉管通道法
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
農(nóng)桿菌
農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。
一
將目的基因?qū)胫参锛毎?br/>第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
裸子植物
三
植物細胞
花粉管通道法
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
轉(zhuǎn)化：
目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。實質(zhì)是基因重組。
農(nóng)桿菌
農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。
Ti質(zhì)粒
T-DNA
（可轉(zhuǎn)移的DNA）
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
三
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
農(nóng)桿菌
Ti質(zhì)粒
T-DNA
（可轉(zhuǎn)移的DNA）
目的基因
構(gòu)建表達載體
含目的基因的
重組 Ti 質(zhì)粒
轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
含重組 Ti 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
三
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
農(nóng)桿菌
Ti質(zhì)粒
T-DNA
（可轉(zhuǎn)移的DNA）
目的基因
構(gòu)建表達載體
含目的基因的
重組 Ti 質(zhì)粒
轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
含重組 Ti 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌
導(dǎo)入植物細胞
將目的基因插入
染色體 DNA 中
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
三
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
農(nóng)桿菌
Ti質(zhì)粒
T-DNA
（可轉(zhuǎn)移的DNA）
目的基因
構(gòu)建表達載體
含目的基因的
重組 Ti 質(zhì)粒
轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
含重組 Ti 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌
導(dǎo)入植物細胞
將目的基因插入
染色體 DNA 中
表現(xiàn)出新性狀的植株
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
轉(zhuǎn)化：
目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。
三
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
農(nóng)桿菌
Ti質(zhì)粒
T-DNA
（可轉(zhuǎn)移的DNA）
目的基因
構(gòu)建表達載體
含目的基因的
重組 Ti 質(zhì)粒
轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
含重組 Ti 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌
導(dǎo)入植物細胞
將目的基因插入
染色體 DNA 中
第一次拼接
第二次拼接
第一次導(dǎo)入
第二次導(dǎo)入
該過程涉及兩次拼接和兩次導(dǎo)入，你能總結(jié)嗎？
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
目的基因
Ti質(zhì)粒
表
達
載
體
農(nóng)桿菌
植物細胞
植物細胞
染色體DNA
新性狀植株
構(gòu)建
轉(zhuǎn)入
導(dǎo)入
插入
表達
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法小結(jié)
三
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
三
受體細胞為受精卵
受體細胞為體細胞
（利用植物細胞的全能性）
方法一
方法二
農(nóng)桿菌的溶液
基因表達載體
農(nóng)桿菌
三
受體細胞類型
植物細胞
動物細胞
微生物細胞
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
花粉管通道法
我國科學(xué)家獨創(chuàng)
常用
顯微注射法
Ca2+處理法
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
三
受體細胞類型
植物細胞
動物細胞
微生物細胞
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
花粉管通道法
我國科學(xué)家獨創(chuàng)
常用
顯微注射法
Ca2+處理法
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
1、導(dǎo)入方法：
2、受體細胞:
顯微注射法
受精卵
為什么常選用受精卵作為受體細胞呢？
①體積大，易操作。
②受精卵全能性很高。
3、過程：
構(gòu)建基因表達載體并提純
利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中
體外胚胎培養(yǎng)
胚胎移植
獲得具有新性狀的動物
二
將目的基因?qū)雱游锛毎?br/>三
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞
受體細胞類型
植物細胞
動物細胞
微生物細胞
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
花粉管通道法
我國科學(xué)家獨創(chuàng)
常用
顯微注射法
Ca2+處理法
1、常用方法：
Ca2+處理
原核細胞（大腸桿菌應(yīng)用最廣）
可使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。
2、受體細胞：
三
將目的基因?qū)胛⑸锛毎?br/>吸收
Ca2+
基因表達載體
成熟mRNA
相應(yīng)酶去除內(nèi)含子
轉(zhuǎn)錄
翻譯
真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）
多肽鏈
前體mRNA
蛋白質(zhì)
加工
如果把一個真核生物的基因?qū)朐思毎斜磉_，一定會產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)嗎？
提示：一般不能產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)
原因：
①原核生物細胞里沒有相應(yīng)的酶來去除內(nèi)含子；
②原核生物沒有真核的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等）
提取
如果把真核基因?qū)朐思毎斜磉_，不考慮蛋白質(zhì)加工的問題，如何產(chǎn)生與原來結(jié)構(gòu)相同的蛋白質(zhì)嗎？
mRNA單鏈
逆轉(zhuǎn)錄酶
DNA
單鏈
DNA雙鏈
酶
這種雙鏈DNA是不含內(nèi)含子的DNA，叫做cDNA
成熟mRNA
去除內(nèi)含子
轉(zhuǎn)錄
真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）
前體mRNA
相應(yīng)酶
提示：把真核基因的cDNA導(dǎo)入到原核細胞中表達。（具體做法，如圖）
將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？
有人采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒有進行基因表達載體的構(gòu)建。這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。
基因工程第四步：目的基因的檢測與鑒定
思考：基因表達載體是否成功導(dǎo)入棉花細胞？Bt基因是否可以在棉花細胞中穩(wěn)定維持并表達出Bt蛋白？表達出的Bt蛋白是否具有殺蟲的功效？
Bt
Bt
棉花細胞
抗蟲棉植株
1.分子水平檢測
2.個體生物學(xué)水平
③檢測目的基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白
采摘抗蟲棉葉片飼喂棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲的生理狀況，從而判斷是否抗蟲及抗蟲程度等
②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA
①檢測棉花染色體的DNA上是否插入了目的基因
思考：Bt基因是否可以在棉花細胞中穩(wěn)定維持并表達出Bt蛋白？
表達出的Bt蛋白是否具有殺蟲的功效？
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
Bt(目的基因)
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
①檢測棉花染色體DNA上是否插入了目的基因
PCR技術(shù)
棉花細胞的所有染色體DNA
準備工作：根據(jù)目的基因的序列合成2種引物
提取轉(zhuǎn)基因生物全部DNA
根據(jù)目的基因的序列設(shè)計PCR引物
PCR
是否擴增出目的基因
瓊脂糖凝膠電泳
過程：
四
②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA
（一）分子水平檢測
轉(zhuǎn)基因生物
PCR
逆轉(zhuǎn)錄
逆轉(zhuǎn)錄酶
cDNA
提取全部RNA
RNA作為模板
PCR技術(shù)
第四步：目的基因的檢測與鑒定
5`CGATAGGCTTTAC3`
3`GCTATCCGAAATG5`
模板鏈—
5`CGAUAGGCUUUAC3`
mRNA—
PCR技術(shù)不可以擴增mRNA
目的基因
是否擴增出目的基因
瓊脂糖凝膠電泳
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
終止子
非編碼區(qū)
非編碼區(qū)
編碼區(qū)
編碼區(qū)上游
編碼區(qū)下游
啟動子
知識拓展：基因結(jié)構(gòu)：
mRNA
3`
5`
3`
5`
逆轉(zhuǎn)錄
cDNA
cDNA上沒有啟動子和終止子
構(gòu)建基因表達載體時，要在目的基因（ cDNA ）上游添加啟動子，下游添加終止子
四
③檢測目的基因是否翻譯出Bt抗蟲蛋白
方法：
抗原— 抗體雜交
蘇云金桿菌
提取
Bt抗蟲蛋白
注射小鼠體內(nèi)
抗體
標記抗體
提取蛋白
抗原
抗體
雜交
轉(zhuǎn)基因生物
（雜交帶）
四
（一）分子水平檢測
第四步：目的基因的檢測與鑒定
抗原
轉(zhuǎn)基因生物 鑒定方法 成功標志
抗蟲植物
抗病毒（菌）植物
抗鹽植物
抗除草劑植物
飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）
害蟲死亡
病毒（菌）感染（抗病接種實驗）
未出現(xiàn)病斑
鹽水澆灌
正常生長
噴灑除草劑
正常生長
個體水平鑒定：
轉(zhuǎn)基因生
物的DNA
目的基因探針
32P
變性
變性
32P
雜交DNA分子
（雜交帶）
5`CGATAGGCTTTAC3`
3`GCTATCCGAAATG5`
5`-------CGATAGGCTTTAC--------- 3`
3`-------GCTATCCGAAATG--------- 5`
CGATAGGCTTTAC
GCTATCCGAAATG
CGATAGGCTTTAC
GCTATCCGAAATG
5`-------CGATAGGCTTTAC--------- 3`
3`-------GCTATCCGAAATG--------- 5`
目的基因的篩選和獲取
利用PCR獲取和擴增
基因表達載體的構(gòu)建-核心
目的基因、啟動子、終止子、標記基因
將目的基因?qū)胧荏w細胞
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動物) 、Ca2+處理(微生物);
目的基因的檢測與鑒定
分子檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯
個體水平：是否具有抗性以及抗性強度等。
基因工程的基本操作程序（4個步驟）
1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。
（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）構(gòu)建含有afp基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶（ ）
（3）只要檢測出番茄細胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功（ ）
2.利用PCR既可以快速擴增特定基因，也可以檢測基因的表達。下列有關(guān)PCR的敘述錯誤的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶
B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶
C.復(fù)性過程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補配對原則
D.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和 4種核糖核苷酸
√
×
×
練習(xí)與應(yīng)用（P83）
一.概念檢測
D
1.研究人員在研究轉(zhuǎn)基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩(wěn)定性時，發(fā)現(xiàn)44株轉(zhuǎn)基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德爾遺傳規(guī)律，在它們的自交后代中出現(xiàn)了較多的沒有卡那霉素抗性的植株。請查找相關(guān)資料，嘗試對這個問題作出解釋。
外源基因插入基因組中可能為單位點插入，或者同一染色體多位點插入，或者不同染色體多位點插入。大多數(shù)情況下，插入的位點難以做到定點插入；插入的拷貝數(shù)也是隨機的。因此，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳是很復(fù)雜的。例如，科研人員在對轉(zhuǎn)GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的煙草進行基因表達分析時，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株的染色體DNA中整合了多個拷貝的基因，從而導(dǎo)致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩(wěn)定性。
練習(xí)與應(yīng)用（P83）
二、拓展應(yīng)用
2.八氫番茄紅素合酶（其基因用psy表示） 和胡蘿卜素脫飽和酶（其基因用crtⅠ表示）參與β-胡蘿卜素的合成。pmi為磷酸甘露醇異構(gòu)酶基因，它編碼的蛋白質(zhì)可使細胞在特殊培養(yǎng)基上生長。科學(xué)家將psy和crtⅠ基因轉(zhuǎn)入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡蘿卜素，由此生產(chǎn)出的大米稱為 “黃金大米”。請根據(jù)以上信息回答下列問題。
練習(xí)與應(yīng)用（P83）
二、拓展應(yīng)用
（1）科學(xué)家在培育“黃金大米”時，將ctrⅠ和psy基因?qū)牒琾mi基因的質(zhì)粒中，構(gòu)建了質(zhì)粒pSYN12424。該項研究的目的基因是______ ，標記基因是_____ ，質(zhì)粒pSYN12424的作用是______ 。
ctrⅠ基因和psy基因
pmi基因
將目的基因送入水稻細胞
（2）在構(gòu)建質(zhì)粒載體時，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的識別序列？為什么？
不能。限制酶可能將它切斷。
(3)請查找相關(guān)資料，了解科學(xué)家為什么 要培育“黃金大米”以及當前關(guān)于“是否要推廣 '黃金大米’”的各種爭論。你還可以提出自己的看法，并與同學(xué)交流討論。
維生素A在人體內(nèi)具有非常重要的生理功能，對視力、骨骼生長、免疫功能等都有調(diào)節(jié)作用。但是，人體不能合成維生素A，需要從食物中攝取。維生素A缺乏癥是南亞地區(qū)常見的由營養(yǎng)不良導(dǎo)致的疾病，該地區(qū)的居民一般以秈稻作為主食。β-胡蘿ト素是維生素A的前體，在人體內(nèi)它可以轉(zhuǎn)化為維生素A。因此，科學(xué)家將兩個參與β-胡蘿ト素合成的酶的基因轉(zhuǎn)入了秈稻中，使其胚乳中富含β-胡蘿ト素，期望讓人們通過日常食用主食就能補充足夠量的維生素A，從而降低維生素A缺乏癥的患病率。關(guān)于“是否要推廣'黃金大米'”的爭論主要圍繞其安全性、有效性等方面展開
練習(xí)與應(yīng)用（P83）
二、拓展應(yīng)用

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