資源簡介

第58講　基因工程的基本工具和基本操作程序
一、選擇題
1.（2025·江蘇南通統(tǒng)考）如圖所示三個DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamH Ⅰ和Sau3AⅠ三種限制酶的識別序列與切割位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述錯誤的是（　?。?br/>A.三種限制酶切割產(chǎn)生的末端的長度大小相同
B.這三種限制酶切割后形成的都是黏性末端
C.BamH Ⅰ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此連接
D.圖中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，會增加兩個游離的磷酸基團(tuán)
2.（2025·吉林四平高三聯(lián)考）科學(xué)家利用PCR技術(shù)擴(kuò)增人乳頭瘤病毒HPV-16L1基因，構(gòu)建了含HPV-16L1基因的表達(dá)載體pBI-L1，經(jīng)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株。該技術(shù)利用轉(zhuǎn)基因煙草作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)出了純度較高的HPV-16L1蛋白。下列說法錯誤的是（　?。?br/>A.利用PCR擴(kuò)增HPV-16L1基因的前提是已知該基因的一段堿基序列
B.構(gòu)建表達(dá)載體pBI-L1時可使用兩種不同限制酶以確保正確連接
C.必須選用煙草的受精卵作為受體細(xì)胞才能保證每個細(xì)胞中含有目的基因
D.可以用抗原—抗體雜交法檢測再生植株是否表達(dá)出HPV-16L1蛋白
3.（2025·山東聊城一模）下列關(guān)于DNA的提取和DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的敘述，正確的是（　?。?br/>A.利用DNA和蛋白質(zhì)在冷酒精中溶解性的差異可將DNA進(jìn)一步純化分離
B.在提取白色絲狀物時雙向攪拌比單向攪拌更有利于獲得結(jié)構(gòu)完整的DNA
C.PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水和移液器等在使用前都必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理
D.PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定，電泳時電泳緩沖液不能沒過凝膠
4.（2025·遼寧沈陽模擬）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中常用的轉(zhuǎn)化方法之一。下列與該方法相關(guān)的敘述，錯誤的是（　?。?br/>A.土壤農(nóng)桿菌是重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞
B.T-DNA是擬核DNA上的一段序列
C.農(nóng)桿菌能侵染雙子葉植物和裸子植物
D.新鮮葉圓片與農(nóng)桿菌在適宜條件下共培養(yǎng)，部分細(xì)胞會被轉(zhuǎn)化
5.（2025·廣東深圳光明區(qū)高三檢測）如圖為某種質(zhì)粒的簡圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，P為轉(zhuǎn)錄的啟動部位。已知目的基因的兩端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，受體細(xì)胞為無任何抗藥性的原核細(xì)胞。下列有關(guān)敘述正確的是（　　）
A.將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用EcoRⅠ酶切，在DNA連接酶作用下，生成的由兩個DNA片段連接形成的產(chǎn)物有兩種
B.DNA連接酶的作用是將酶切后得到的黏性末端連接起來，形成一個重組質(zhì)粒時形成兩個磷酸二酯鍵
C.為了防止目的基因反向連接和質(zhì)粒自身環(huán)化，酶切時可選用的酶是EcoRⅠ和BamH Ⅰ
D.受體細(xì)胞能在含青霉素的培養(yǎng)基中生長，表明目的基因已成功導(dǎo)入該細(xì)胞
6.（2025·廣東梅州聯(lián)考）PCR引物的3'端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵，5'端無嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列，dNTP（四種脫氧核苷三磷酸）是DNA合成的原料。下列相關(guān)說法錯誤的是（　?。?br/>A.圖示環(huán)節(jié)所需的溫度比上一個環(huán)節(jié)的低
B.dNTP作為擴(kuò)增的原料會依次連接到3'端
C.Taq DNA聚合酶催化磷酸二酯鍵的形成
D.經(jīng)過1個循環(huán)后，獲得的子代DNA的雙鏈中脫氧核苷酸數(shù)量相同
7.（2025·廣東肇慶調(diào)研）在基因工程操作中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶（R1和R2）處理基因載體，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖所示。以下相關(guān)敘述中，錯誤的是（　?。?br/>A.該載體最可能為環(huán)形DNA分子
B.兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點(diǎn)
C.限制酶R1與R2的切割位點(diǎn)最短相距200 bp
D.限制酶作用位點(diǎn)會導(dǎo)致氫鍵和肽鍵斷裂
8.（2025·湖南衡陽月考）戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白（pORF2）位于病毒表面，構(gòu)成病毒的衣殼。我國科研人員利用基因工程技術(shù)，在大腸桿菌中表達(dá)pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如圖。下列關(guān)于該疫苗的敘述錯誤的是（　　）
A.過程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B.重組基因表達(dá)載體上的啟動子需來源于大腸桿菌
C.過程⑤需要用Ca2＋處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)
D.過程⑥大量制備pORF2蛋白前應(yīng)做相應(yīng)的檢測與鑒定
9.圖甲為培育轉(zhuǎn)基因生物時選用的載體，圖乙是含有目的基因的一段DNA序列，圖中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列敘述錯誤的是（　?。?br/>A.若通過PCR技術(shù)提取該目的基因，應(yīng)該選用引物a和引物c
B.構(gòu)建表達(dá)載體時可選用BclⅠ和BamHⅠ這兩種限制酶
C.若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，需用Ca2＋處理大腸桿菌
D.只利用含四環(huán)素的培養(yǎng)基就不能直接篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的受體細(xì)胞
二、非選擇題
10.（2025·廣東湛江高三一模）甜蛋白是一種高甜度的特殊蛋白質(zhì)，將甜蛋白基因?qū)敕芽商岣叻烟鹞叮纳乒麑?shí)品質(zhì)，獲得超甜植株。下圖是甜蛋白基因和Ti質(zhì)粒上限制酶切割位點(diǎn)示意圖?；卮鹣铝邢嚓P(guān)問題：
（1）利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得超甜番茄的核心步驟是　　　　　　　　，該過程需要選擇　　　　　　　　限制酶切割甜蛋白基因。
（2）Ti質(zhì)粒上的啟動子是　　　　　　　識別和結(jié)合的位點(diǎn)，為了保證甜蛋白基因能夠在番茄細(xì)胞中表達(dá)，應(yīng)將Ti質(zhì)粒上的啟動子替換為　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄細(xì)胞時，T-DNA的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，該過程發(fā)生的變異類型為　　　　　　。然后在添加　　　　　　（填物質(zhì)）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)番茄細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織。
（4）若得到的超甜番茄體細(xì)胞中導(dǎo)入的是2個甜蛋白基因，則讓其自交，若子代表型及比例為　　　　　，則說明2個甜蛋白基因插入兩對同源染色體上（含有1個和2個甜蛋白基因的番茄甜味相同）。
第58講　基因工程的基本工具和基本操作程序
1.C　根據(jù)題圖并結(jié)合三種限制酶的切割位點(diǎn)可知，這三種限制酶切割后形成的都是黏性末端，且長度大小相同，A、B正確；用BamH Ⅰ和Sau3AⅠ切割DNA片段會形成相同的黏性末端，故BamH Ⅰ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端能按照堿基互補(bǔ)配對彼此連接，C錯誤；圖中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，會斷裂兩個磷酸二酯鍵，從而增加兩個游離的磷酸基團(tuán)，D正確。
2.C　利用PCR擴(kuò)增HPV-16L1基因的前提是已知該基因的一段堿基序列，根據(jù)該序列制作引物，A正確；用兩種不同限制酶，可保證目的基因和載體定向連接，且不發(fā)生自身環(huán)化，B正確；除選用煙草的受精卵作為受體細(xì)胞外，也可選用煙草的根尖分生區(qū)細(xì)胞作為受體細(xì)胞，然后通過植物組織培養(yǎng)使每個細(xì)胞中均含有目的基因，C錯誤；分子水平對目的基因進(jìn)行檢測，可根據(jù)抗原—抗體雜交技術(shù)檢測相應(yīng)蛋白質(zhì)，D正確。
3.A　DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可利用這個特性將DNA與蛋白質(zhì)分離，A正確；在提取白色絲狀物時用玻璃棒輕輕單向攪拌更有利于獲得結(jié)構(gòu)完整的DNA，B錯誤；PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水在使用前都必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理，移液器不需要進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理，C錯誤；通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物時，電泳緩沖液沒過凝膠1 mm為宜，D錯誤。
4.B　將目的基因與載體相連形成重組質(zhì)粒后，要導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌內(nèi)，再讓農(nóng)桿菌去侵染植物細(xì)胞，A正確；T-DNA是位于Ti質(zhì)粒中的一段序列，不位于擬核，B錯誤；農(nóng)桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力，C正確；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率不是100％，因此適宜條件下，新鮮葉圓片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，部分細(xì)胞會被轉(zhuǎn)化，D正確。
5.C　根據(jù)題意可知，目的基因的兩端有EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ的酶切位點(diǎn)，將含有目的基因的DNA用EcoR Ⅰ酶切，會得到目的基因片段；根據(jù)質(zhì)粒的簡圖可知，將質(zhì)粒用EcoR Ⅰ酶切，會得到與質(zhì)粒周長等長的鏈狀DNA，因此將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用EcoR Ⅰ酶切，在DNA連接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—質(zhì)粒片段、質(zhì)?！|(zhì)粒片段三種產(chǎn)物，A錯誤。DNA連接酶的作用是將酶切后得到的黏性末端連接起來形成一個重組質(zhì)粒，該過程形成四個磷酸二酯鍵，B錯誤。EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的識別序列不同，獲取目的基因和切割質(zhì)粒時，同時選用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ切割，目的基因兩端形成的末端不同，切割后的質(zhì)粒兩端形成的末端也不同，再用DNA連接酶連接，可以防止目的基因反向連接和質(zhì)粒自身環(huán)化，C正確。導(dǎo)入普通質(zhì)粒的受體細(xì)胞和導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞都能在含青霉素的培養(yǎng)基中生長，因此能在含青霉素的培養(yǎng)基中生長的受體細(xì)胞不一定含有目的基因，D錯誤。
6.D　題圖中環(huán)節(jié)為引物與模板堿基互補(bǔ)配對，表示的是復(fù)性環(huán)節(jié)，復(fù)性的上一環(huán)節(jié)為變性，復(fù)性的溫度（50 ℃左右）比變性的溫度（90 ℃以上）低，A正確；在PCR擴(kuò)增中，子鏈延伸的方向是從5'端到3'端，所以dNTP作為擴(kuò)增的原料會依次連接到3'端，B正確；Taq DNA聚合酶能催化磷酸二酯鍵的形成，C正確；由于兩個引物均不在該片段的端點(diǎn)，因此一個循環(huán)后，得到的兩個DNA片段中脫氧核苷酸的數(shù)量不一定相同，一般PCR第三輪才可以擴(kuò)增出雙鏈脫氧核苷酸數(shù)量相同的子代DNA，D錯誤。
7.D　單用限制酶R1或R2切割均只得到一段序列（兩種限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段等長），可知載體可能是環(huán)狀DNA分子，當(dāng)用兩種限制酶R1和R2同時切割載體時，產(chǎn)生兩種長度的DNA片段，則這兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點(diǎn)，兩種限制酶同時切割可得到200 bp和600 bp的DNA分子片段，可知限制酶R1和R2的酶切位點(diǎn)最短相距200 bp，A、B、C正確；限制酶是切割DNA的工具，能夠特異性識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，D錯誤。
8.A　戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，過程①是以病毒RNA為模板合成DNA，獲取目的基因的過程，需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶，原料是四種脫氧核苷酸，A錯誤；啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的識別結(jié)合以驅(qū)動目的基因的轉(zhuǎn)錄，啟動子具有物種或組織特異性，構(gòu)建在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)pORF2的載體時，需要選擇大腸桿菌細(xì)胞的啟動子，而不能選擇其他物種的啟動子，B正確；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是Ca2＋處理法，需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，C正確。
9.B　根據(jù)圖甲可知，BamHⅠ會導(dǎo)致兩種抗性基因都被破壞，所以不宜選用BamHⅠ，為防止目的基因自身環(huán)化，可選用BclⅠ和Hind Ⅲ兩種限制酶切割，B錯誤；由于選擇BclⅠ和Hind Ⅲ這兩種限制酶，破壞了氨芐青霉素抗性基因，但沒有破壞四環(huán)素抗性基因，因此應(yīng)該先用含四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出含有基因表達(dá)載體和普通質(zhì)粒的大腸桿菌，再用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，D正確。
10.（1）基因表達(dá)載體的構(gòu)建　Xba Ⅰ和Hind Ⅲ　（2）RNA聚合酶　番茄細(xì)胞中能表達(dá)的基因的啟動子?。?）攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞并將其整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上　基因重組　卡那霉素?。?）超甜番茄∶普通番茄＝15∶1
解析：（1）基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建；切割目的基因時，不能選擇限制酶BamHⅠ，因?yàn)槠鋾茐哪康幕?，故目的基因左?cè)應(yīng)選擇限制酶Xba Ⅰ切割，目的基因應(yīng)插入質(zhì)粒的啟動子和終止子之間，故不能選擇限制酶SalⅠ，綜合考慮，目的基因右側(cè)應(yīng)選擇限制酶Hind Ⅲ切割（Hind Ⅲ靠近終止子，而EcoR Ⅰ靠近啟動子）。（2）Ti質(zhì)粒上的啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn)，啟動子具有組織特異性，為了保證甜蛋白基因能夠在番茄細(xì)胞中表達(dá)，應(yīng)將Ti質(zhì)粒上的啟動子替換為番茄細(xì)胞中能表達(dá)的基因的啟動子。（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄細(xì)胞時，T-DNA的作用是攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞并將其整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，該過程使受體細(xì)胞發(fā)生了基因重組。由于重組質(zhì)粒中含有卡那霉素抗性基因，因此在添加卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)番茄細(xì)胞，篩選出導(dǎo)入甜蛋白基因的細(xì)胞，進(jìn)而可獲得轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織。（4）若2個甜蛋白基因插入兩對同源染色體上，即相當(dāng)于雙雜合類型，遺傳上遵循基因的自由組合定律，則讓其自交，后代中只要含有甜蛋白基因，其性狀就表現(xiàn)為超甜，則其自交產(chǎn)生的后代的表型及比例為超甜番茄∶普通番茄＝15∶1。
2 / 3第58講　基因工程的基本工具和基本操作程序
課程標(biāo)準(zhǔn)
1.闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。
2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。
3.DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)。
4.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟件進(jìn)行虛擬PCR實(shí)驗(yàn)。
考點(diǎn)一　基因工程的基本工具
1.基因工程的概念
提醒 基因工程的理論基礎(chǔ)
2.基因工程的基本工具
（1）限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱限制酶）
提醒 ①將一個基因從DNA分子上切割下來需要切兩處，同時產(chǎn)生四個黏性末端或平末端。
②原核生物的限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。
（2）DNA連接酶
【教材拾遺】 （選擇性必修3 P72旁欄思考）DNA連接酶和DNA聚合酶不是一回事。原因是①DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。
（3）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體
1.（選擇性必修3 P71正文）切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列。 （　　）
2.（選擇性必修3 P71正文）限制酶在識別序列中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開形成的是黏性末端，在識別序列中心軸線處切開形成的是平末端。（　　）
3.（選擇性必修3 P71正文）E.coli DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端。 （　　）
4.（選擇性必修3 P71～72正文）基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA連接酶、載體。（　?。?br/>5.（選擇性必修3 P72正文）質(zhì)粒上標(biāo)記基因的存在，是便于重組DNA分子的篩選。（　?。?br/>1.（2024·江西上饒期末）基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行的操作，需要有專門的工具。下列關(guān)于基因工程所需基本工具的敘述，錯誤的是（　?。?br/>A.用不同的限制酶分別切割含目的基因的DNA和質(zhì)粒可能產(chǎn)生相同的末端
B.T4 DNA連接酶可以催化磷酸二酯鍵形成進(jìn)而連接黏性末端或平末端
C.作為載體的質(zhì)粒上通常有抗生素合成基因作為標(biāo)記基因，以便于重組DNA的篩選
D.原核細(xì)胞內(nèi)的限制酶可切割入侵的DNA分子，通常不切割細(xì)菌自身的DNA分子
2.（2025·山東濟(jì)南高三期末）下列關(guān)于生物學(xué)中常見的幾種酶的敘述，正確的是（　?。?br/>A.DNA連接酶將目的基因的黏性末端與載體的黏性末端之間的堿基黏合
B.用限制性內(nèi)切核酸酶從質(zhì)粒上切下一個目的基因需消耗4個水分子
C.利用PCR儀擴(kuò)增DNA分子時常用一種耐高溫的DNA連接酶
D.在解離根尖分生區(qū)細(xì)胞時加入纖維素酶有利于提高解離的效果
題后歸納
與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
3.限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，以下說法正確的是（　?。?br/>A.限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割煙草花葉病毒的核酸
B.DNA連接酶能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵
C.E.coli DNA連接酶只能連接黏性末端，不能連接平末端
D.限制酶主要從原核生物中分離純化而來，所以也能剪切自身的DNA
考點(diǎn)二　基因工程的基本操作程序
1.目的基因的篩選與獲取
（1）篩選合適的目的基因
①目的基因：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。主要是指　　　　　　　的基因。
②篩選目的基因的方法
（2）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
提醒 ①在PCR過程中實(shí)際加入的原料為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。②引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸，作為新子鏈的合成起點(diǎn)，只能結(jié)合在母鏈的3'端，使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸。
③復(fù)性溫度過高，則引物難以與模板鏈結(jié)合；溫度過低則易使兩條母鏈配對結(jié)合，均無法獲得PCR產(chǎn)物。④真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2＋。
2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）
提醒 啟動子、起始密碼子、終止子、終止密碼子的區(qū)別
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
提醒 ①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入（非人工操作）是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。
②導(dǎo)入的目的基因，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的檢測與鑒定
1.（選擇性必修3 P77正文）目的基因一定是編碼蛋白質(zhì)的基因。（　?。?br/>2.（選擇性必修3 P77相關(guān)信息）利用PCR擴(kuò)增目的基因時，要用2種不同但能夠互補(bǔ)配對的引物。（　　）
3.（選擇性必修3 P79旁欄思考）PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時不必知道基因的全部序列，該技術(shù)既可以擴(kuò)增DNA又可以擴(kuò)增mRNA。（　　）
4.（選擇性必修3 P80正文）基因表達(dá)載體中的啟動子和終止子決定著翻譯的開始與結(jié)束。（　?。?br/>5.（選擇性必修3 P80旁欄思考）生物的所有DNA通過注射或花粉管通道法轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中，就可獲得具有理想性狀的轉(zhuǎn)基因植物。（　?。?br/>6.（選擇性必修3 P81資料卡）Ti質(zhì)粒上的T-DNA可攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，并可將目的基因整合到該細(xì)胞的染色體DNA中。（　?。?br/>7.（選擇性必修3 P83練習(xí)與應(yīng)用）應(yīng)用PCR技術(shù)，可以檢測轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因是否存在及其是否表達(dá)。（　?。?br/>1.（2024·重慶期末）利用PCR技術(shù)可以獲取如圖中的目的基因。下列敘述正確的是（　?。?br/>A.用圖中引物②和引物⑤至少要經(jīng)過3次循環(huán)才能獲得目的基因
B.用圖中引物③和引物④至少要經(jīng)過2次循環(huán)才能獲得目的基因
C.合成新鏈?zhǔn)菑囊锏?'開始延伸
D.用圖中引物①和引物⑤經(jīng)過2次循環(huán)可獲得4種雙鏈DNA分子
題后歸納
PCR擴(kuò)增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律
循環(huán)次數(shù) 1 2 3 n
DNA分子數(shù) 2 4 8 2n
含引物A（或B）的DNA分子數(shù) 1 3 7 2n－1
同時含引物A、B的DNA分子數(shù) 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物數(shù)量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
2.（2024·福建廈門期末）研究人員擬利用下圖所示的目的基因片段和質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體。下列相關(guān)敘述錯誤的是（　?。?br/>名稱 識別序列及切割位點(diǎn) 名稱 識別序列及切割位點(diǎn)
SmaⅠ CCC↓GGG GGG↑CCC EcoRⅠ G↓AATTC CTTAA↑G
AvrⅡ C↓CTAGG GGATC↑C XbalⅠ T↓CTAGA AGATC↑T
A.應(yīng)選用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基因，SmaⅠ和AvrⅡ切割質(zhì)粒
B.應(yīng)選用T4 DNA連接酶連接目的基因與質(zhì)粒
C.重組表達(dá)載體能被XbalⅠ識別并切割
D.目的基因以β鏈為模板鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)錄
題后歸納
限制酶的選擇
（1）不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
（2）保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個及以上的標(biāo)記基因，則可合理對其中一些標(biāo)記基因進(jìn)行酶切破壞，從而達(dá)到比一個標(biāo)記基因更高的篩選成功率，防止只有一個標(biāo)記基因時出現(xiàn)的“假陽性”（即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正常表達(dá)標(biāo)記基因，造成無效篩選）。
（3）善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點(diǎn)時，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點(diǎn)的兩種不同的限制酶，對目的基因所在序列和載體進(jìn)行剪切，即“雙酶切法”。其優(yōu)點(diǎn)和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目的基因與載體反向連接，即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動子的方向（或描述為“RNA聚合酶的移動方向”）必須是相同的，否則目的基因?qū)牒鬅o法正常表達(dá)。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
（4）巧用“同尾酶”：同尾酶指來源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當(dāng)不適合選擇某種限制酶時，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。
3.（2025·廣東廣州一模）為使玉米獲得抗除草劑性狀，科研人員進(jìn)行了相關(guān)操作（如圖所示）。含有內(nèi)含子的報告基因不能在原核生物中正確表達(dá)，其正確表達(dá)產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色。轉(zhuǎn)化過程中愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，會導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長。下列敘述錯誤的是（　?。?br/>A.T-DNA可將基因G轉(zhuǎn)移并整合到愈傷組織細(xì)胞的染色體DNA上
B.利用物質(zhì)K和抗生素進(jìn)行篩選1，可獲得農(nóng)桿菌的藍(lán)色菌落
C.利用物質(zhì)K和除草劑進(jìn)行篩選2，更易于獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株
D.愈傷組織重新分化為芽、根等器官的過程中，需要添加植物激素
歸納總結(jié)
如何篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞
（1）原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果目的基因插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。
（2）被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌。
（3）篩選方法：將細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖中1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即含有目的基因的菌落，如圖中1、5 菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
考點(diǎn)三　DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定
1.DNA的粗提取與鑒定
（1）實(shí)驗(yàn)原理
（2）實(shí)驗(yàn)步驟
提醒 ①加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絲狀沉淀。
②本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核（無DNA）?？蛇x用雞血細(xì)胞作為材料。
③DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)中過濾不能用濾紙代替紗布，因?yàn)镈NA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。
2.DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定
（1）實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)
（2）PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟
（3）DNA的電泳鑒定
1.（選擇性必修3 P74正文）DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度大。（　?。?br/>2.（選擇性必修3 P74正文）可用濾紙過濾洋蔥研磨液以除去其中的雜質(zhì)。（　　）
3.（選擇性必修3 P84正文）在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關(guān)。（　?。?br/>4.（選擇性必修3 P85正文）進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)驗(yàn)所需的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在20 ℃儲存。（　　）
5.（選擇性必修3 P85正文）為了節(jié)約資源，移液器上的槍頭在實(shí)驗(yàn)過程中不必更換。 （　?。?br/>1.（2023·廣東高考11題）“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過程是：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是（　　）
A.裂解：使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)
B.分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等
C.沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度
D.鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色
2.（2025·山東日照高三模擬）某生物興趣小組利用蘋果進(jìn)行“DNA的粗提取與鑒定”的實(shí)驗(yàn)，下列操作正確的是（　?。?br/>A.蘋果組織研磨前經(jīng)冷凍處理可以提高DNA的提取量
B.研磨液離心，保留沉淀物并加入酒精去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)
C.將預(yù)冷酒精溶液加入上清液，攪拌后可析出純凈的DNA
D.將絲狀物溶于NaCl溶液，加入二苯胺試劑振蕩后呈藍(lán)色
3.（2025·江蘇淮安期中）關(guān)于“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列相關(guān)敘述錯誤的是（　　）
A.凝膠中的DNA分子通過染色，可以在紫外燈下被檢測出來
B.微量離心管、蒸餾水和移液器在使用前均需進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理
C.DNA向著與其所帶電荷相反的電極移動，遷移速率與凝膠濃度、DNA的大小和構(gòu)象有關(guān)
D.PCR所用的緩沖液從冰箱拿出之后，應(yīng)放在冰塊上緩慢融化，目的是不破壞穩(wěn)定性較差的成分
1.（2024·湖南高考5題）某同學(xué)將質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶酶切時，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是（　　）
A.限制酶失活，更換新的限制酶
B.酶切條件不合適，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和酶的用量等
C.質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致酶識別位點(diǎn)缺失，更換正常質(zhì)粒DNA
D.酶切位點(diǎn)被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶
2.（2024·安徽高考14題）下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯誤的是（　　）
A.實(shí)驗(yàn)中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低
B.利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA
C.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物
D.將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應(yīng)，可檢測溶液中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)
溯源教材
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。（見選擇性必修3 P74正文）
（2）DNA在不同濃度NaC1溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。（見選擇性必修3 P74正文）
（3）在一定溫度下，DNA與二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色。（見選擇性必修3 P74正文）
3.（2024·黑吉遼高考7題）關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)，下列敘述正確的是（　?。?br/>A.瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小
B.凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置
C.在同一電場作用下，DNA片段越長，向負(fù)極遷移速率越快
D.瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來
4.（2024·江西高考12題）γ-氨基丁酸在醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。利用L-谷氨酸脫羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因（gadB）導(dǎo)入生產(chǎn)菌株E.coli A，構(gòu)建了以L-谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列敘述正確的是（　?。?br/>A.上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB
B.E.coli B發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸時，L-谷氨酸鈉的作用是供能
C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)粒
5.（2024·全國甲卷38題）某同學(xué)采用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)蛋白E?；卮鹣铝袉栴}。
（1）該同學(xué)利用PCR擴(kuò)增目的基因。PCR的每次循環(huán)包括變性、復(fù)性、延伸3個階段，其中DNA雙鏈打開成為單鏈的階段是　　　　　　，引物與模板DNA鏈堿基之間的化學(xué)鍵是　　　　　　　。
（2）質(zhì)粒載體上有限制酶a、b、c的酶切位點(diǎn)，限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。構(gòu)建重組質(zhì)粒時，與用酶a單酶切相比，用酶a和酶b雙酶切的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（答出2點(diǎn)即可）；使用酶c單酶切構(gòu)建重組質(zhì)粒時宜選用的連接酶是　　　　　　　　　　　　。
（3）將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌前，通常先將受體細(xì)胞處理成感受態(tài)，感受態(tài)細(xì)胞的特點(diǎn)是　　　　　　　　　　。若要驗(yàn)證轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中含有重組質(zhì)粒，簡要的實(shí)驗(yàn)思路和預(yù)期結(jié)果是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（4）蛋白E基因中的一段DNA編碼序列（與模板鏈互補(bǔ)）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，編碼從GGG開始，部分密碼子見表。若第一個核苷酸G缺失，則突變后相應(yīng)肽鏈的序列是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
氨基酸 賴氨酸 精氨酸 絲氨酸 脯氨酸 亮氨酸 甘氨酸 終止
密碼子 AAG AGA AGC CCA CCC CUG GGC GGG UGA
6.（2024·新課標(biāo)卷35題）某研究小組將纖維素酶基因（N）插入某種細(xì)菌（B1）的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株（B2）。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(diǎn)（Ⅰ～Ⅳ）、引物（P1～P4）的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如圖所示，→表示引物5'→3'方向?；卮鹣铝袉栴}。
（1）限制酶切割的化學(xué)鍵是　　　　　　　　　。為保證N基因能在菌株B2中表達(dá)，在構(gòu)建片段甲時，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點(diǎn)之間，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（2）CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割細(xì)菌B1基因組中與向?qū)NA結(jié)合的DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對可以形成的堿基對有G—C和　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（3）用引物P1和P2進(jìn)行PCR可驗(yàn)證片段甲插入了細(xì)菌B1基因組，所用的模板是　　　　　　??；若用該模板與引物P3和P4進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（4）與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細(xì)菌處理秸稈的優(yōu)點(diǎn)是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　?。ù鸪?點(diǎn)即可）。
?。?）通過基因工程技術(shù)引入外源基因可改變中國水仙花色。 （2024·福建高考）（　?。?br/>（2）使用不同的限制酶也能產(chǎn)生相同的黏性末端。 （2024·貴州高考）（　?。?br/>（3）PCR技術(shù)中的DNA延伸過程無需引物參與即可完成半保留復(fù)制。 （2022·遼寧高考）（　　）
（4）粗提取DNA時的過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解。 （2022·山東高考）（　?。?br/>（5）動、植物細(xì)胞DNA的提取必須在無菌條件下進(jìn)行。 （2022·湖北高考）（　　）
第58講　基因工程的基本工具和基本操作程序
【破考點(diǎn)·抓必備】
考點(diǎn)一
知識梳理夯基
1.基因重組　分子
2.（1） 原核生物　 特定核苷酸序列　 磷酸二酯鍵　 磷酸二酯鍵?。?） 環(huán)狀雙鏈DNA分子　 噬菌體　 自我復(fù)制　 受體DNA　 標(biāo)記
概念檢測
1.×　提示：不同種類限制酶識別序列不同。
2.√　3.√
4.×　提示：限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具，前兩者屬于工具酶，質(zhì)粒屬于載體。
5.√
典題演練應(yīng)用
1.C　不同限制酶識別的堿基序列一般不同，但切割后所產(chǎn)生的黏性末端可能是一樣的，像這種能切割不同的DNA 片段但產(chǎn)生相同黏性末端的一類限制酶稱為同尾酶，A正確；T4 DNA連接酶既可以連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，也可以連接雙鏈DNA片段的平末端，催化磷酸二酯鍵形成，B正確；作為載體的質(zhì)粒上通常有抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，以便于重組DNA的篩選，不是抗生素合成基因，C錯誤；原核生物內(nèi)的限制酶可切割入侵的DNA分子而保護(hù)自身，一般不切割自身的DNA分子，D正確。
2.B　黏性末端與黏性末端之間的互補(bǔ)配對的堿基自動形成氫鍵，DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵，A錯誤；切下一個目的基因需要打開2個切口，水解4個磷酸二酯鍵，故需消耗4個水分子，B正確；利用PCR儀擴(kuò)增DNA分子時常用耐高溫的DNA聚合酶，C錯誤；對根尖分生區(qū)細(xì)胞進(jìn)行解離時用解離液處理，不需要纖維素酶，D錯誤。
3.A　限制酶只能切割DNA分子，煙草花葉病毒的核酸是RNA，不能切割，A正確；DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，B錯誤；E.coli DNA連接酶能連接黏性末端，也能連接平末端，C錯誤；限制酶主要從原核生物中分離純化而來，但是因?yàn)樵松顳NA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾，所以不能剪切自身的DNA，D錯誤。
考點(diǎn)二
知識梳理夯基
1.（1）①編碼蛋白質(zhì)?、谌斯ず铣赡康幕颉』蛭膸臁。?） 引物　 脫氧核苷酸　 耐高溫　 溫度　 兩種引物　 耐高溫的DNA聚合酶　 指數(shù)形式　 瓊脂糖凝膠電泳
2.RNA聚合酶　受體細(xì)胞中是否含有目的基因
3. 目的基因　 子房中　 T-DNA　 染色體　 顯微注射　 受精卵
4. PCR　 目的基因　 轉(zhuǎn)錄出了mRNA　 抗原—抗體雜交
概念檢測
1.×　提示：目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。
2.×　提示：PCR擴(kuò)增目的基因時，2種不同的引物不能互補(bǔ)配對。
3.×
4.×　提示：啟動子和終止子決定著轉(zhuǎn)錄的開始與結(jié)束。
5.×　6.√　7.×
典題演練應(yīng)用
1.A　用圖中引物②和引物⑤經(jīng)過1次循環(huán)能獲得含母鏈和引物②、母鏈和引物⑤的兩種雙鏈DNA，經(jīng)過2次循環(huán)能獲得一條鏈為目的基因的堿基序列的雙鏈DNA，經(jīng)過3次循環(huán)能獲得兩條鏈均為目的基因的DNA片段，A正確；用圖中引物③和引物④循環(huán)不能獲得目的基因，因?yàn)楹铣傻男骆準(zhǔn)菑囊锏?'開始延伸，用引物③和引物④延伸不包含目的基因的堿基序列，B錯誤；合成新鏈?zhǔn)菑囊锏?'開始延伸，C錯誤；用圖中引物①和引物⑤經(jīng)過2次循環(huán)可獲得3種雙鏈DNA分子，D錯誤。
2.C　據(jù)表可知，AvrⅡ和XbalⅠ切割后可產(chǎn)生相同的黏性末端，由圖可知，為了保證目的基因能正向接入載體，應(yīng)選用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基因，SmaⅠ和AvrⅡ切割質(zhì)粒，A正確；圖中用SmaⅠ切割后產(chǎn)生平末端，用AvrⅡ和XbalⅠ切割后產(chǎn)生黏性末端，所以應(yīng)用T4 DNA連接酶目的基因與質(zhì)粒，B正確；重組表達(dá)載體序列不能被AvrⅡ、XbalⅠ識別，不能被二者切割，C錯誤；轉(zhuǎn)錄的方向?yàn)?'→3'端，據(jù)圖可知，目的基因以β鏈為模板鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，D正確。
3.B　將目的基因（基因G）插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，可以把目的基因（基因G）整合到愈傷組織細(xì)胞的染色體DNA上，A正確；含有內(nèi)含子的報告基因不能在原核生物中正確表達(dá)，農(nóng)桿菌屬于原核生物，無法正確表達(dá)出產(chǎn)物，也就無法催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色，B錯誤；含有內(nèi)含子的報告基因的產(chǎn)物在愈傷組織細(xì)胞中能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色，而愈傷組織表面殘留的農(nóng)桿菌，會導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長，因此利用物質(zhì)K和除草劑進(jìn)行篩選2，更易于獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株，C正確；植物組織培養(yǎng)過程需要添加植物激素誘導(dǎo)愈傷組織重新分化為芽、根等器官，D正確。
考點(diǎn)三
知識梳理夯基
1.（1）酒精　藍(lán)色?。?）冷卻后
2.（1）相反　凝膠的濃度　大小和構(gòu)象?。?）紫外燈
概念檢測
1.√　2.×
3.×　提示：在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。
4.×　提示：緩沖液和酶應(yīng)在－20 ℃條件下儲存。
5.×　提示：移液器上的槍頭在實(shí)驗(yàn)過程中必須更換，避免試劑的污染。
典題演練應(yīng)用
1.D　裂解的目的是使細(xì)胞破裂，釋放出DNA等物質(zhì)，A正確；DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)等，DNA分離過程中混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等可被去除，B正確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)，可反復(fù)多次以提高DNA的純度，C正確；進(jìn)行DNA鑒定時可以使用二苯胺試劑，但要進(jìn)行沸水浴加熱后才能觀察到顏色變化，D錯誤。
2.A　由于冷凍后的細(xì)胞易破碎，所以將蘋果組織研磨前經(jīng)液氮冷凍處理，可以提高DNA的提取量，A正確。提取DNA時，研磨液離心，過濾并取濾液。由于DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精，在濾液中加入酒精去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，B錯誤。DNA不溶于酒精，因此可用體積分?jǐn)?shù)為95％的冷酒精析出DNA，靜置2～3分鐘，可見絲狀物即為DNA的粗提取物，C錯誤。鑒定DNA時，應(yīng)將絲狀物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑并進(jìn)行沸水浴，冷卻后才可出現(xiàn)藍(lán)色，D錯誤。
3.B　PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水在使用前都必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理，移液器不需要進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理，B錯誤。
【研真題·扣教材】
1.B　限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應(yīng)更換新的限制酶，A正確；酶切條件不合適通常會使切割效果下降，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和pH等，調(diào)整酶的用量沒有作用，B錯誤；質(zhì)粒DNA突變會導(dǎo)致限制酶識別位點(diǎn)缺失，進(jìn)而造成限制酶無法對質(zhì)粒DNA進(jìn)行切割，此時應(yīng)更換為正常質(zhì)粒DNA，C正確；質(zhì)粒DNA上酶切位點(diǎn)被甲基化修飾，會導(dǎo)致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進(jìn)行酶切，此時應(yīng)換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。
2.D　研磨液有利于DNA的溶解，換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低，A正確；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可初步分離DNA，B正確；DNA在NaCl溶液中的溶解度隨著NaCl濃度的變化而改變，因此可用不同濃度的NaCl溶液對DNA進(jìn)行粗提取，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍(lán)色，二苯胺試劑用于鑒定DNA，D錯誤。
3.A　應(yīng)根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比為0.8％～1.2％的瓊脂糖溶液，A正確；凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示電泳的進(jìn)度，而不是指示DNA分子的具體位置，B錯誤；在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)，在同一電場作用下，DNA片段（帶負(fù)電）越長，DNA向正極遷移的速率越慢，C錯誤；凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來，D錯誤。
4.D　不能直接從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB，只能分離得到含有目的基因gadB序列的染色體DNA，如題圖所示，若要獲取目的基因，需要進(jìn)行PCR，A錯誤；由題意知L-谷氨酸鈉是合成γ-氨基丁酸的底物，用L-谷氨酸脫羧酶（GadB）催化L-谷氨酸（或L-谷氨酸鹽）脫羧（谷氨酸→氨基丁酸＋CO2）生產(chǎn)γ-氨基丁酸，該過程L-谷氨酸鈉的作用是底物而不是供能，B錯誤；菌株E.coli A中沒有L-谷氨酸脫羧酶基因（gadB），不能表達(dá)產(chǎn)生L-谷氨酸脫羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E.coli B中導(dǎo)下L-谷氨酸脫羧酶基因（gadB），L-谷氨酸脫羧酶基因（gadB）表達(dá)產(chǎn)生L-谷氨酸脫羧酶（gadB），能高效降解L-谷氨酸鈉生成γ-氨基丁酸，而不是高效降解γ-氨基丁酸，C錯誤；圖中質(zhì)粒下方括號內(nèi)備注含多克隆位點(diǎn)，表明質(zhì)粒上含有多種限制酶的識別序列，除了Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ外還有其他的限制酶可選，D正確。
5.（1）變性　氫鍵?。?）用酶a和酶b雙酶切可防止載體和目的基因自身環(huán)化以及目的基因的反向連接，保證目的基因和載體正確連接，從而提高重組率　T4 DNA連接酶　（3）能吸收周圍環(huán)境中DNA分子　將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的基因組DNA提取出來，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標(biāo)記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示雜交帶，就表明轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中含有重組質(zhì)粒（合理即可）?。?）甘氨酸—脯氨酸—絲氨酸
解析：（1）PCR的每次循環(huán)包括變性、復(fù)性、延伸3個階段，其中DNA雙鏈打開為單鏈的階段是變性，引物與模板DNA鏈堿基之間的化學(xué)鍵是氫鍵。（2）用酶a和酶b雙酶切可防止載體和目的基因自身環(huán)化以及目的基因的反向連接，保證目的基因和載體正確連接，從而提高重組率。使用酶c單酶切只能形成平末端，T4 DNA連接酶可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。（3）感受態(tài)細(xì)胞的特點(diǎn)是能吸收周圍環(huán)境中DNA分子。欲驗(yàn)證轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中含有重組質(zhì)粒，可將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的基因組DNA提取出來，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標(biāo)記，以此為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示雜交帶，就表明轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中含有重組質(zhì)粒。（4）依據(jù)DNA分子模板鏈和編碼鏈的堿基配對情況、轉(zhuǎn)錄過程的堿基配對情況，可推出轉(zhuǎn)錄形成的mRNA上的堿基序列和編碼鏈相近，只存在T和U的差別，即正常mRNA堿基序列為GGGCCCAAGCUGAGAUGA，編碼序列缺失第一個核苷酸G后，產(chǎn)生的異常mRNA堿基序列為GGCCCAAGCUGAGAUGA，對應(yīng)的密碼子依次是GGC（甘氨酸）、CCA（脯氨酸）、AGC（絲氨酸）、UGA（終止密碼子），即突變后相應(yīng)肽鏈的序列是甘氨酸—脯氨酸—絲氨酸。
6.（1）磷酸二酯鍵　不破壞N基因，且能保證N基因正常表達(dá)?。?）C—G、U—A、A—T?。?）N基因的兩條鏈　無擴(kuò)增產(chǎn)物?。?）實(shí)現(xiàn)廢物利用，減少環(huán)境污染
解析：（1）限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。在構(gòu)建片段甲時，將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點(diǎn)之間，可保證片段甲含有啟動子和終止子，且不破壞N基因，從而使N基因能在菌株B2中表達(dá)。（2）向?qū)NA為核糖核苷酸序列，含有堿基A、U、C、G；B1基因組DNA為脫氧核苷酸序列，含有堿基A、T、C、G。故向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對可形成的堿基對有G—C和C—G、A—T、U—A。（3）由題中信息“利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2”可知，用引物P1和P2進(jìn)行PCR驗(yàn)證片段甲插入了細(xì)菌B1基因組所用的模板為N基因的兩條鏈。結(jié)合題圖分析可知，P4是以細(xì)菌B1基因組DNA為模板設(shè)計的引物，故N基因的兩條鏈為模板，以P3和P4為引物進(jìn)行PCR，不能擴(kuò)增出目的條帶。（4）焚燒秸稈會污染環(huán)境，利用高效降解纖維素的細(xì)菌處理秸稈可實(shí)現(xiàn)廢物利用，減少環(huán)境污染。
真題重組練
?。?）√　（2）√
（3）×　提示：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA鏈，只能催化單個的脫氧核苷酸添加到已有的核酸片段的3'端，故延伸過程需要引物參與。
（4）√
（5）×　提示：動、植物細(xì)胞的DNA提取不需要在無菌條件下進(jìn)行。
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第58講　基因工程的基本工具和基本操作程序
高中總復(fù)習(xí)·生物
課程標(biāo)準(zhǔn)
1. 闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和
載體三種基本工具。
2. 闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基
因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測與鑒
定等步驟。
3. DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)。
4. 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟
件進(jìn)行虛擬PCR實(shí)驗(yàn)。
1. 破考點(diǎn)·抓必備
2. 研真題·扣教材
3. 驗(yàn)收效·提能力
目錄
Contents
01
破考點(diǎn)·抓必備
梳理歸納， 鞏固基本知識
考點(diǎn)一　基因工程的基本工具
1. 基因工程的概念
c
c
提醒 基因工程的理論基礎(chǔ)
2. 基因工程的基本工具
（1）限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱限制酶）
c
c
c
c
提醒 ①將一個基因從DNA分子上切割下來需要切兩處，同時產(chǎn)生四個黏性
末端或平末端。
②原核生物的限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在
該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。
（2）DNA連接酶
【教材拾遺】 （選擇性必修3 P72旁欄思考）DNA連接酶和DNA聚合酶不
是一回事。原因是①DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶
是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用時
需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。
（3）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體
c
c
c
c
c
1. （選擇性必修3 P71正文）切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地
識別6個核苷酸序列。 （　×?。?br/>提示：不同種類限制酶識別序列不同。
×
2. （選擇性必修3 P71正文）限制酶在識別序列中心軸線兩側(cè)將DNA分子
的兩條鏈分別切開形成的是黏性末端，在識別序列中心軸線處切開形成的
是平末端。　 （　√　）
√
3. （選擇性必修3 P71正文）E. coli DNA連接酶既可連接平末端，又可連
接黏性末端。 （　√?。?br/>4. （選擇性必修3 P71～72正文）基因工程中用到的工具酶有限制酶、
DNA連接酶、載體?！?（　×?。?br/>提示：限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工
具，前兩者屬于工具酶，質(zhì)粒屬于載體。
5. （選擇性必修3 P72正文）質(zhì)粒上標(biāo)記基因的存在，是便于重組DNA分
子的篩選。 （　√?。?br/>√
×
√
1. （2024·江西上饒期末）基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行的操作，需要有專門的工具。下列關(guān)于基因工程所需基本工具的敘述，錯誤的是（　　）
A. 用不同的限制酶分別切割含目的基因的DNA和質(zhì)?？赡墚a(chǎn)生相同的末端
B. T4 DNA連接酶可以催化磷酸二酯鍵形成進(jìn)而連接黏性末端或平末端
C. 作為載體的質(zhì)粒上通常有抗生素合成基因作為標(biāo)記基因，以便于重組
DNA的篩選
D. 原核細(xì)胞內(nèi)的限制酶可切割入侵的DNA分子，通常不切割細(xì)菌自身的
DNA分子
√
解析：　不同限制酶識別的堿基序列一般不同，但切割后所產(chǎn)生的黏
性末端可能是一樣的，像這種能切割不同的DNA 片段但產(chǎn)生相同黏性
末端的一類限制酶稱為同尾酶，A正確；T4 DNA連接酶既可以連接雙
鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，也可以連接雙鏈DNA片段的平末端，催
化磷酸二酯鍵形成，B正確；作為載體的質(zhì)粒上通常有抗生素抗性基因
作為標(biāo)記基因，以便于重組DNA的篩選，不是抗生素合成基因，C錯
誤；原核生物內(nèi)的限制酶可切割入侵的DNA分子而保護(hù)自身，一般不
切割自身的DNA分子，D正確。
2. （2025·山東濟(jì)南高三期末）下列關(guān)于生物學(xué)中常見的幾種酶的敘述，
正確的是（　?。?br/>A. DNA連接酶將目的基因的黏性末端與載體的黏性末端之間的堿基黏合
B. 用限制性內(nèi)切核酸酶從質(zhì)粒上切下一個目的基因需消耗4個水分子
C. 利用PCR儀擴(kuò)增DNA分子時常用一種耐高溫的DNA連接酶
D. 在解離根尖分生區(qū)細(xì)胞時加入纖維素酶有利于提高解離的效果
√
解析： 　黏性末端與黏性末端之間的互補(bǔ)配對的堿基自動形成氫鍵，
DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵，A錯誤；切下一個目的基因需要打開2個
切口，水解4個磷酸二酯鍵，故需消耗4個水分子，B正確；利用PCR儀擴(kuò)
增DNA分子時常用耐高溫的DNA聚合酶，C錯誤；對根尖分生區(qū)細(xì)胞進(jìn)行
解離時用解離液處理，不需要纖維素酶，D錯誤。
題后歸納
與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
3. 限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，以下說法正確的是（　?。?br/>A. 限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割煙草花葉病毒的核酸
B. DNA連接酶能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵
C. E. coli DNA連接酶只能連接黏性末端，不能連接平末端
D. 限制酶主要從原核生物中分離純化而來，所以也能剪切自身的DNA
解析： 　限制酶只能切割DNA分子，煙草花葉病毒的核酸是RNA，不能
切割，A正確；DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，B錯誤；E. coli DNA
連接酶能連接黏性末端，也能連接平末端，C錯誤；限制酶主要從原核生
物中分離純化而來，但是因?yàn)樵松顳NA分子中不存在該酶的識別序列
或識別序列已經(jīng)被修飾，所以不能剪切自身的DNA，D錯誤。
√
考點(diǎn)二　基因工程的基本操作程序
1. 目的基因的篩選與獲取
（1）篩選合適的目的基因
①目的基因：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得
預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。主要是指 的基因。
②篩選目的基因的方法
編碼蛋白質(zhì)　
c
c
（2）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
提醒 ①在PCR過程中實(shí)際加入的原料為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、
dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。
②引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸，作
為新子鏈的合成起點(diǎn)，只能結(jié)合在母鏈的3'端，使DNA聚合酶能夠從引物
的3'端開始連接脫氧核苷酸。
③復(fù)性溫度過高，則引物難以與模板鏈結(jié)合；溫度過低則易使兩條母鏈配
對結(jié)合，均無法獲得PCR產(chǎn)物。
④真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖液
中一般要添加Mg2＋。
2. 基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）
提醒 啟動子、起始密碼子、終止子、終止密碼子的區(qū)別
3. 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
c
c
c
c
c
c
c
提醒 ①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入：第一次拼接是將目的基因
拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因
的T-DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含
目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入（非人工操作）是指含目的基
因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。
②導(dǎo)入的目的基因，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能整合到染色體DNA上。
存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物
中，造成“基因污染”。
4. 目的基因的檢測與鑒定
c
c
c
c
c
c
1. （選擇性必修3 P77正文）目的基因一定是編碼蛋白質(zhì)的基因。
（　×?。?br/>提示：目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用
的因子。
2. （選擇性必修3 P77相關(guān)信息）利用PCR擴(kuò)增目的基因時，要用2種不同
但能夠互補(bǔ)配對的引物。 （　×?。?br/>提示：PCR擴(kuò)增目的基因時，2種不同的引物不能互補(bǔ)配對。
×
×
3. （選擇性必修3 P79旁欄思考）PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時不必知道基因的
全部序列，該技術(shù)既可以擴(kuò)增DNA又可以擴(kuò)增mRNA。　 （　×?。?br/>4. （選擇性必修3 P80正文）基因表達(dá)載體中的啟動子和終止子決定著翻
譯的開始與結(jié)束。 （　×?。?br/>提示：啟動子和終止子決定著轉(zhuǎn)錄的開始與結(jié)束。
×
×
5. （選擇性必修3 P80旁欄思考）生物的所有DNA通過注射或花粉管通道
法轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中，就可獲得具有理想性狀的轉(zhuǎn)基因植物?！?br/>（　×　）
6. （選擇性必修3 P81資料卡）Ti質(zhì)粒上的T-DNA可攜帶目的基因進(jìn)入宿主
細(xì)胞，并可將目的基因整合到該細(xì)胞的染色體DNA中。　 （　√　）
7. （選擇性必修3 P83練習(xí)與應(yīng)用）應(yīng)用PCR技術(shù)，可以檢測轉(zhuǎn)基因抗凍番
茄植株中目的基因是否存在及其是否表達(dá)?！?（　×　）
×
√
×
1. （2024·重慶期末）利用PCR技術(shù)可以獲取如圖中的目的基因。下列敘
述正確的是（　?。?br/>A. 用圖中引物②和引物⑤至少要經(jīng)過3次循環(huán)才能獲得目的基因
B. 用圖中引物③和引物④至少要經(jīng)過2次循環(huán)才能獲得目的基因
C. 合成新鏈?zhǔn)菑囊锏?'開始延伸
D. 用圖中引物①和引物⑤經(jīng)過2次循環(huán)可獲得4種雙鏈DNA分子
√
解析：　用圖中引物②和引物⑤經(jīng)過1次循環(huán)能獲得含母鏈和引物②、母
鏈和引物⑤的兩種雙鏈DNA，經(jīng)過2次循環(huán)能獲得一條鏈為目的基因的堿
基序列的雙鏈DNA，經(jīng)過3次循環(huán)能獲得兩條鏈均為目的基因的DNA片
段，A正確；用圖中引物③和引物④循環(huán)不能獲得目的基因，因?yàn)楹铣傻?br/>新鏈?zhǔn)菑囊锏?'開始延伸，用引物③和引物④延伸不包含目的基因的堿
基序列，B錯誤；合成新鏈?zhǔn)菑囊锏?'開始延伸，C錯誤；用圖中引物①
和引物⑤經(jīng)過2次循環(huán)可獲得3種雙鏈DNA分子，D錯誤。
題后歸納
PCR擴(kuò)增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律
循環(huán)次數(shù) 1 2 3 n
DNA分子數(shù) 2 4 8 2n
含引物A（或B）的
DNA分子數(shù) 1 3 7 2n－1
同時含引物A、B的
DNA分子數(shù) 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物數(shù)量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－
2 2n＋1－2
2. （2024·福建廈門期末）研究人員擬利用如圖所示的目的基因片段和質(zhì)
粒構(gòu)建基因表達(dá)載體。下列相關(guān)敘述錯誤的是（　　）
名稱 識別序列及切割位點(diǎn) 名稱 識別序列及切割位點(diǎn)
SmaⅠ CCC↓GGG GGG↑CCC EcoRⅠ G↓AATTC
CTTAA↑G
AvrⅡ C↓CTAGG GGATC↑C XbalⅠ T↓CTAGA
AGATC↑T
A. 應(yīng)選用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基因，SmaⅠ和AvrⅡ切割質(zhì)粒
B. 應(yīng)選用T4 DNA連接酶連接目的基因與質(zhì)粒
C. 重組表達(dá)載體能被XbalⅠ識別并切割
D. 目的基因以β鏈為模板鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)錄
√
解析：　據(jù)表可知，AvrⅡ和XbalⅠ切割后可產(chǎn)生相同的黏性末端，由圖可
知，為了保證目的基因能正向接入載體，應(yīng)選用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基
因，SmaⅠ和AvrⅡ切割質(zhì)粒，A正確；圖中用SmaⅠ切割后產(chǎn)生平末端，用
AvrⅡ和XbalⅠ切割后產(chǎn)生黏性末端，所以應(yīng)用T4 DNA連接酶目的基因與質(zhì)
粒，B正確；重組表達(dá)載體序列不能被AvrⅡ、XbalⅠ識別，不能被二者切
割，C錯誤；轉(zhuǎn)錄的方向?yàn)?'→3'端，據(jù)圖可知，目的基因以β鏈為模板鏈
進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，D正確。
題后歸納
限制酶的選擇
（1）不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
（2）保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必
須具備標(biāo)記基因，所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選
擇SmaⅠ。若載體上有兩個及以上的標(biāo)記基因，則可合理對其中一些標(biāo)記基
因進(jìn)行酶切破壞，從而達(dá)到比一個標(biāo)記基因更高的篩選成功率，防止只有
一個標(biāo)記基因時出現(xiàn)的“假陽性”（即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正
常表達(dá)標(biāo)記基因，造成無效篩選）。
（3）善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多
種酶切位點(diǎn)時，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位
點(diǎn)的兩種不同的限制酶，對目的基因所在序列和載體進(jìn)行剪切，即“雙酶
切法”。其優(yōu)點(diǎn)和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目的基因與載體
反向連接，即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載
體啟動子的方向（或描述為“RNA聚合酶的移動方向”）必須是相同的，
否則目的基因?qū)牒鬅o法正常表達(dá)。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩
種限制酶。
（4）巧用“同尾酶”：同尾酶指來源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限
制酶。當(dāng)不適合選擇某種限制酶時，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏
性末端。
3. （2025·廣東廣州一模）為使玉米獲得
抗除草劑性狀，科研人員進(jìn)行了相關(guān)操
作（如圖所示）。含有內(nèi)含子的報告基
因不能在原核生物中正確表達(dá)，其正確
表達(dá)產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色。轉(zhuǎn)化過程中愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，會導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長。下列敘述錯誤的是（?。?br/>A. T-DNA可將基因G轉(zhuǎn)移并整合到愈傷組織細(xì)胞的染色體DNA上
B. 利用物質(zhì)K和抗生素進(jìn)行篩選1，可獲得農(nóng)桿菌的藍(lán)色菌落
C. 利用物質(zhì)K和除草劑進(jìn)行篩選2，更易于獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株
D. 愈傷組織重新分化為芽、根等器官的過程中，需要添加植物激素
√
解析：　將目的基因（基因G）插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)
化作用，可以把目的基因（基因G）整合到愈傷組織細(xì)胞的染色體DNA
上，A正確；含有內(nèi)含子的報告基因不能在原核生物中正確表達(dá)，農(nóng)桿菌
屬于原核生物，無法正確表達(dá)出產(chǎn)物，也就無法催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)
色，B錯誤；含有內(nèi)含子的報告基因的產(chǎn)物在愈傷組織細(xì)胞中能催化無色
物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色，而愈傷組織表面殘留的農(nóng)桿菌，會導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組
織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長，因此利用物質(zhì)K和除草劑進(jìn)行篩選2，
更易于獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株，C正確；植物組織培養(yǎng)過程需要添加
植物激素誘導(dǎo)愈傷組織重新分化為芽、根等器官，D正確。
歸納總結(jié)
如何篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞
（1）原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果目
的基因插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。
如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。
（2）被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含
質(zhì)粒的細(xì)菌。
（3）篩選方法：將細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的
是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖中1、2、3、4、5菌落，再利
用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、
4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即含有目的基因的菌落，如圖中1、5
菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
考點(diǎn)三　DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定
1. DNA的粗提取與鑒定
（1）實(shí)驗(yàn)原理
c
c
（2）實(shí)驗(yàn)步驟
c
提醒 ①加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷
裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絲狀沉淀。
②本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動物成
熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核（無DNA）?？蛇x用雞血細(xì)胞作為材料。
③DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)中過濾不能用濾紙代替紗布，因?yàn)镈NA會被吸附到濾
紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。
2. DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定
（1）實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)
c
c
c
c
（2）PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟
（3）DNA的電泳鑒定
c
1. （選擇性必修3 P74正文）DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度大?！?br/>（　√?。?br/>2. （選擇性必修3 P74正文）可用濾紙過濾洋蔥研磨液以除去其中的雜
質(zhì)。　 （　×?。?br/>3. （選擇性必修3 P84正文）在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子
的大小相關(guān)。　 （　×?。?br/>提示：在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象
等有關(guān)。
√
×
×
4. （選擇性必修3 P85正文）進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)驗(yàn)所需的
緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在20 ℃儲存?！?（　×?。?br/>提示：緩沖液和酶應(yīng)在－20 ℃條件下儲存。
5. （選擇性必修3 P85正文）為了節(jié)約資源，移液器上的槍頭在實(shí)驗(yàn)過程
中不必更換。 （　×　）
提示：移液器上的槍頭在實(shí)驗(yàn)過程中必須更換，避免試劑的污染。
×
×
1. （2023·廣東高考11題）“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過程是：裂
解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是（　?。?br/>A. 裂解：使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)
B. 分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等
C. 沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度
D. 鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色
√
解析：　裂解的目的是使細(xì)胞破裂，釋放出DNA等物質(zhì)，A正確；DNA
不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA
與蛋白質(zhì)等，DNA分離過程中混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等可被去除，B正
確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，通過控制NaCl溶液的濃度
去除雜質(zhì)，可反復(fù)多次以提高DNA的純度，C正確；進(jìn)行DNA鑒定時可以
使用二苯胺試劑，但要進(jìn)行沸水浴加熱后才能觀察到顏色變化，D錯誤。
2. （2025·山東日照高三模擬）某生物興趣小組利用蘋果進(jìn)行“DNA的粗
提取與鑒定”的實(shí)驗(yàn)，下列操作正確的是（　?。?br/>A. 蘋果組織研磨前經(jīng)冷凍處理可以提高DNA的提取量
B. 研磨液離心，保留沉淀物并加入酒精去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)
C. 將預(yù)冷酒精溶液加入上清液，攪拌后可析出純凈的DNA
D. 將絲狀物溶于NaCl溶液，加入二苯胺試劑振蕩后呈藍(lán)色
√
解析：　由于冷凍后的細(xì)胞易破碎，所以將蘋果組織研磨前經(jīng)液氮冷
凍處理，可以提高DNA的提取量，A正確。提取DNA時，研磨液離
心，過濾并取濾液。由于DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋
白質(zhì)則溶于酒精，在濾液中加入酒精去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，B錯誤。
DNA不溶于酒精，因此可用體積分?jǐn)?shù)為95％的冷酒精析出DNA，靜置
2～3分鐘，可見絲狀物即為DNA的粗提取物，C錯誤。鑒定DNA時，
應(yīng)將絲狀物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑并進(jìn)行沸水
浴，冷卻后才可出現(xiàn)藍(lán)色，D錯誤。
3. （2025·江蘇淮安期中）關(guān)于“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)，下
列相關(guān)敘述錯誤的是（　　）
A. 凝膠中的DNA分子通過染色，可以在紫外燈下被檢測出來
B. 微量離心管、蒸餾水和移液器在使用前均需進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理
C. DNA向著與其所帶電荷相反的電極移動，遷移速率與凝膠濃度、DNA
的大小和構(gòu)象有關(guān)
D. PCR所用的緩沖液從冰箱拿出之后，應(yīng)放在冰塊上緩慢融化，目的是不
破壞穩(wěn)定性較差的成分
解析：　PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水在使用前都必須
進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理，移液器不需要進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理，B錯誤。
√
02
研真題·扣教材
探究分析， 培養(yǎng)核心技能
1. （2024·湖南高考5題）某同學(xué)將質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶酶切時，發(fā)現(xiàn)DNA
完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是
（　?。?br/>A. 限制酶失活，更換新的限制酶
B. 酶切條件不合適，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和酶的用量等
C. 質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致酶識別位點(diǎn)缺失，更換正常質(zhì)粒DNA
D. 酶切位點(diǎn)被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶
√
解析：　限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應(yīng)更換新的限制酶，
A正確；酶切條件不合適通常會使切割效果下降，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和
pH等，調(diào)整酶的用量沒有作用，B錯誤；質(zhì)粒DNA突變會導(dǎo)致限制酶識別
位點(diǎn)缺失，進(jìn)而造成限制酶無法對質(zhì)粒DNA進(jìn)行切割，此時應(yīng)更換為正常
質(zhì)粒DNA，C正確；質(zhì)粒DNA上酶切位點(diǎn)被甲基化修飾，會導(dǎo)致對DNA甲
基化敏感的限制酶無法進(jìn)行酶切，此時應(yīng)換用對DNA甲基化不敏感的限制
酶，D正確。
2. （2024·安徽高考14題）下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，
錯誤的是（　　）
A. 實(shí)驗(yàn)中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低
B. 利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA
C. DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物
D. 將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應(yīng)，可檢測溶液中是否含有蛋白
質(zhì)雜質(zhì)
√
解析：　研磨液有利于DNA的溶解，換為蒸餾水，DNA提取的效率會降
低，A正確；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可
初步分離DNA，B正確；DNA在NaCl溶液中的溶解度隨著NaCl濃度的變化
而改變，因此可用不同濃度的NaCl溶液對DNA進(jìn)行粗提取，C正確；在沸
水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍(lán)色，二苯胺試劑用于鑒定DNA，
D錯誤。
溯源教材
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精?！。ㄒ娺x擇性必修3 P74
正文）
（2）DNA在不同濃度NaC1溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶
液。?。ㄒ娺x擇性必修3 P74正文）
（3）在一定溫度下，DNA與二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色?！。ㄒ娺x擇性必修3
P74正文）
3. （2024·黑吉遼高考7題）關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實(shí)
驗(yàn)，下列敘述正確的是（　　）
A. 瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小
B. 凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置
C. 在同一電場作用下，DNA片段越長，向負(fù)極遷移速率越快
D. 瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來
√
解析：　應(yīng)根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶
液，一般配制質(zhì)量體積比為0.8％～1.2％的瓊脂糖溶液，A正確；凝膠載
樣緩沖液中指示劑的作用是指示電泳的進(jìn)度，而不是指示DNA分子的具體
位置，B錯誤；在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的
大小和構(gòu)象等有關(guān)，在同一電場作用下，DNA片段（帶負(fù)電）越長，DNA
向正極遷移的速率越慢，C錯誤；凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波
長為300 nm的紫外燈下被檢測出來，D錯誤。
4. （2024·江西高考12題）γ-氨基丁酸在醫(yī)藥等
領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。利用L-谷氨酸脫羧酶
（GadB）催化L-谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ-氨基
丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法
將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因（gadB）導(dǎo)入生產(chǎn)菌株E. coli A，構(gòu)建了以L-谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌株E. coli B。
下列敘述正確的是（　?。?br/>A. 上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB
B. E. coli B發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸時，L-谷氨酸鈉的作用是供能
C. E. coli A和E. coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D. 可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)粒
√
解析：　不能直接從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB，只能分離得
到含有目的基因gadB序列的染色體DNA，如題圖所示，若要獲取目的基
因，需要進(jìn)行PCR，A錯誤；由題意知L-谷氨酸鈉是合成γ-氨基丁酸的底
物，用L-谷氨酸脫羧酶（GadB）催化L-谷氨酸（或L-谷氨酸鹽）脫羧（谷
氨酸→氨基丁酸＋CO2）生產(chǎn)γ-氨基丁酸，該過程L-谷氨酸鈉的作用是底物
而不是供能，B錯誤；菌株E. coli A中沒有L-谷氨酸脫羧酶基因（gadB），不能表達(dá)產(chǎn)生L-谷氨酸脫羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E. coli B中導(dǎo)下L-谷氨酸脫羧酶基因（gadB），L-谷氨酸脫羧酶基因（gadB）
表達(dá)產(chǎn)生L-谷氨酸脫羧酶（gadB），能高效降解L-谷氨酸鈉生成γ-氨基丁
酸，而不是高效降解γ-氨基丁酸，C錯誤；圖中質(zhì)粒下方括號內(nèi)備注含多克
隆位點(diǎn)，表明質(zhì)粒上含有多種限制酶的識別序列，除了Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ外還
有其他的限制酶可選，D正確。
5. （2024·全國甲卷38題）某同學(xué)采用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)蛋
白E。回答下列問題。
（1）該同學(xué)利用PCR擴(kuò)增目的基因。PCR的每次循環(huán)包括變性、復(fù)性、延
伸3個階段，其中DNA雙鏈打開成為單鏈的階段是 ，引物與模板
DNA鏈堿基之間的化學(xué)鍵是 。
解析：PCR的每次循環(huán)包括變性、復(fù)性、延伸3個階段，其中DNA雙鏈打開為單鏈的階段是變性，引物與模板DNA鏈堿基之間的化學(xué)鍵是氫鍵。
變性
氫鍵
（2）質(zhì)粒載體上有限制酶a、b、c的酶切位點(diǎn)，限制酶的切割位點(diǎn)如圖所
示。構(gòu)建重組質(zhì)粒時，與用酶a單酶切相比，用酶a和酶b雙酶切的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)
在
（答出2點(diǎn)即可）；使用酶c單酶切構(gòu)建重組質(zhì)粒時宜選用的連接酶是 。
用酶a和酶b雙酶切可防止載體和目的基因自身環(huán)化以及目的基因的反
向連接，保證目的基因和載體正確連接，從而提高重組率
T4 DNA連接酶
解析：用酶a和酶b雙酶切可防止載體和目的基因自身環(huán)化以及目的基因的反向連接，保證目的基因和載體正確連接，從而提高重組率。使用酶c單酶切只能形成平末端，T4 DNA連接酶可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。
（3）將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌前，通常先將受體細(xì)胞處理成感受態(tài)，感
受態(tài)細(xì)胞的特點(diǎn)是 。若要驗(yàn)證轉(zhuǎn)化的大腸
桿菌中含有重組質(zhì)粒，簡要的實(shí)驗(yàn)思路和預(yù)期結(jié)果是


。
能吸收周圍環(huán)境中DNA分子
將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌
的基因組DNA提取出來，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等
作標(biāo)記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示雜交帶，就
表明轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中含有重組質(zhì)粒（合理即可）
解析：感受態(tài)細(xì)胞的特點(diǎn)是能吸收周圍環(huán)境中DNA分子。欲驗(yàn)證轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中含有重組質(zhì)粒，可將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的基因組DNA提取出來，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標(biāo)記，以此為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示雜交帶，就表明轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中含有重組質(zhì)粒。
（4）蛋白E基因中的一段DNA編碼序列（與模板鏈互補(bǔ)）是
GGGCCCAAGCTGAGATGA，編碼從GGG開始，部分密碼子見表。若第
一個核苷酸G缺失，則突變后相應(yīng)肽鏈的序列是 。
氨基酸 賴氨酸 精氨酸 絲氨酸 脯氨酸 亮氨酸 甘氨酸 終止
密碼子 AAG AGA AGC CCA CCC CUG GGC GGG UGA
甘氨酸—脯氨酸—絲氨酸
解析：依據(jù)DNA分子模板鏈和編碼鏈的堿基配對情況、轉(zhuǎn)錄過程的堿基配對情況，可推出轉(zhuǎn)錄形成的mRNA上的堿基序列和編碼鏈相近，只存在T和U的差別，即正常mRNA堿基序列為GGGCCCAAGCUGAGAUGA，編碼序列缺失第一個核苷酸G后，產(chǎn)生的異常mRNA堿基序列為GGCCCAAGCUGAGAUGA，對應(yīng)的密碼子依次是GGC（甘氨酸）、CCA（脯氨酸）、AGC（絲氨酸）、UGA（終止密碼子），即突變后相應(yīng)肽鏈的序列是甘氨酸—脯氨酸—絲氨酸。
6. （2024·新課標(biāo)卷35題）某研究小組將纖維素酶基因（N）插入某種細(xì)菌
（B1）的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株（B2）。該小組在含有N
基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基
因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯
技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(diǎn)（Ⅰ～Ⅳ）、引物
（P1～P4）的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如圖所示，→表示引物5'→3'方
向?；卮鹣铝袉栴}。
（1）限制酶切割的化學(xué)鍵是 。為保證N基因能在菌株B2中
表達(dá)，在構(gòu)建片段甲時，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ
酶切位點(diǎn)之間，原因是 。
解析： 限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。在構(gòu)建片段甲時，將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點(diǎn)之間，可保證片段甲含有啟動子和終止子，且不破壞N基因，從而使N基因能在菌株B2中表達(dá)。
磷酸二酯鍵
不破壞N基因，且能保證N基因正常表達(dá)　
（2）CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割細(xì)菌B1基因組中與向?qū)NA結(jié)合的
DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對可以形成的堿基對有G—C
和 。
解析： 向?qū)NA為核糖核苷酸序列，含有堿基A、U、C、G；B1基因組DNA為脫氧核苷酸序列，含有堿基A、T、C、G。故向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對可形成的堿基對有G—C和C—G、A—T、U—A。
C—G、U—A、A—T
（3）用引物P1和P2進(jìn)行PCR可驗(yàn)證片段甲插入了細(xì)菌B1基因組，所用的
模板是 ；若用該模板與引物P3和P4進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)
果是 。
解析： 由題中信息“利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入
B1的基因組，得到菌株B2”可知，用引物P1和P2進(jìn)行PCR驗(yàn)證片段甲插入
了細(xì)菌B1基因組所用的模板為N基因的兩條鏈。結(jié)合題圖分析可知，P4是
以細(xì)菌B1基因組DNA為模板設(shè)計的引物，故N基因的兩條鏈為模板，以P3
和P4為引物進(jìn)行PCR，不能擴(kuò)增出目的條帶。
N基因的兩條鏈
無擴(kuò)增產(chǎn)物
（4）與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細(xì)菌處理秸稈的優(yōu)點(diǎn)
是 （答出2點(diǎn)即可）。
解析： 焚燒秸稈會污染環(huán)境，利用高效降解纖維素的細(xì)菌處理秸稈
可實(shí)現(xiàn)廢物利用，減少環(huán)境污染。
實(shí)現(xiàn)廢物利用，減少環(huán)境污染
（1）通過基因工程技術(shù)引入外源基因可改變中國水仙花色?！。?024·福
建高考） （　√?。?br/>（2）使用不同的限制酶也能產(chǎn)生相同的黏性末端?！。?024·貴州高考）
（　√?。?br/>（3）PCR技術(shù)中的DNA延伸過程無需引物參與即可完成半保留復(fù)制。　
（2022·遼寧高考） （　×　）
提示：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA鏈，只能催化單個的脫氧核苷酸
添加到已有的核酸片段的3'端，故延伸過程需要引物參與。
√
√
×
（4）粗提取DNA時的過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA
降解?！。?022·山東高考） （　√?。?br/>（5）動、植物細(xì)胞DNA的提取必須在無菌條件下進(jìn)行?！。?022·湖北高
考） （　×?。?br/>提示：動、植物細(xì)胞的DNA提取不需要在無菌條件下進(jìn)行。
√
×
03
驗(yàn)收效·提能力
跟蹤訓(xùn)練，檢驗(yàn)學(xué)習(xí)效果
一、選擇題
1. （2025·江蘇南通統(tǒng)考）如圖所示三個DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamH
Ⅰ和Sau3AⅠ三種限制酶的識別序列與切割位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述錯誤的是
（　　）
A. 三種限制酶切割產(chǎn)生的末端的長度大小相同
B. 這三種限制酶切割后形成的都是黏性末端
C. BamH Ⅰ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此連接
D. 圖中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，會增加兩個游離的磷酸基團(tuán)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
√
解析： 　根據(jù)題圖并結(jié)合三種限制酶的切割位點(diǎn)可知，這三種限制酶切
割后形成的都是黏性末端，且長度大小相同，A、B正確；用BamH Ⅰ和
Sau3AⅠ切割DNA片段會形成相同的黏性末端，故BamH Ⅰ和Sau3AⅠ切割
DNA片段形成的末端能按照堿基互補(bǔ)配對彼此連接，C錯誤；圖中的DNA
片段被EcoRⅠ切割后，會斷裂兩個磷酸二酯鍵，從而增加兩個游離的磷酸
基團(tuán)，D正確。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2. （2025·吉林四平高三聯(lián)考）科學(xué)家利用PCR技術(shù)擴(kuò)增人乳頭瘤病毒
HPV-16L1基因，構(gòu)建了含HPV-16L1基因的表達(dá)載體pBI-L1，經(jīng)根瘤農(nóng)桿
菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株。該技術(shù)利用轉(zhuǎn)基因煙草作為生物反
應(yīng)器，生產(chǎn)出了純度較高的HPV-16L1蛋白。下列說法錯誤的是（　?。?br/>A. 利用PCR擴(kuò)增HPV-16L1基因的前提是已知該基因的一段堿基序列
B. 構(gòu)建表達(dá)載體pBI-L1時可使用兩種不同限制酶以確保正確連接
C. 必須選用煙草的受精卵作為受體細(xì)胞才能保證每個細(xì)胞中含有目的基因
D. 可以用抗原—抗體雜交法檢測再生植株是否表達(dá)出HPV-16L1蛋白
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
解析： 　利用PCR擴(kuò)增HPV-16L1基因的前提是已知該基因的一段堿基序
列，根據(jù)該序列制作引物，A正確；用兩種不同限制酶，可保證目的基因
和載體定向連接，且不發(fā)生自身環(huán)化，B正確；除選用煙草的受精卵作為
受體細(xì)胞外，也可選用煙草的根尖分生區(qū)細(xì)胞作為受體細(xì)胞，然后通過植
物組織培養(yǎng)使每個細(xì)胞中均含有目的基因，C錯誤；分子水平對目的基因
進(jìn)行檢測，可根據(jù)抗原—抗體雜交技術(shù)檢測相應(yīng)蛋白質(zhì)，D正確。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
3. （2025·山東聊城一模）下列關(guān)于DNA的提取和DNA片段的擴(kuò)增及電泳
鑒定的敘述，正確的是（　?。?br/>A. 利用DNA和蛋白質(zhì)在冷酒精中溶解性的差異可將DNA進(jìn)一步純化分離
B. 在提取白色絲狀物時雙向攪拌比單向攪拌更有利于獲得結(jié)構(gòu)完整的
DNA
C. PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水和移液器等在使用前都必
須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理
D. PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定，電泳時電泳緩沖液不能沒
過凝膠
√
1
2
3
4
5
6
7
8
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解析： 　DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可利
用這個特性將DNA與蛋白質(zhì)分離，A正確；在提取白色絲狀物時用玻璃棒
輕輕單向攪拌更有利于獲得結(jié)構(gòu)完整的DNA，B錯誤；PCR實(shí)驗(yàn)中使用的
微量離心管、槍頭、蒸餾水在使用前都必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理，移液
器不需要進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理，C錯誤；通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定
PCR的產(chǎn)物時，電泳緩沖液沒過凝膠1 mm為宜，D錯誤。
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4. （2025·遼寧沈陽模擬）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中常用的轉(zhuǎn)化
方法之一。下列與該方法相關(guān)的敘述，錯誤的是（　　）
A. 土壤農(nóng)桿菌是重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞
B. T-DNA是擬核DNA上的一段序列
C. 農(nóng)桿菌能侵染雙子葉植物和裸子植物
D. 新鮮葉圓片與農(nóng)桿菌在適宜條件下共培養(yǎng)，部分細(xì)胞會被轉(zhuǎn)化
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解析： 　將目的基因與載體相連形成重組質(zhì)粒后，要導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌
內(nèi)，再讓農(nóng)桿菌去侵染植物細(xì)胞，A正確；T-DNA是位于Ti質(zhì)粒中的一段
序列，不位于擬核，B錯誤；農(nóng)桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸
子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力，C正確；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)
化效率不是100％，因此適宜條件下，新鮮葉圓片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，部
分細(xì)胞會被轉(zhuǎn)化，D正確。
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5. （2025·廣東深圳光明區(qū)高三檢測）如圖為某種質(zhì)粒的簡圖，小箭頭所
指分別為限制性內(nèi)切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，P為轉(zhuǎn)錄的啟動
部位。已知目的基因的兩端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，受體細(xì)胞為無
任何抗藥性的原核細(xì)胞。下列有關(guān)敘述正確的是（　　）
A. 將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用EcoRⅠ酶
切，在DNA連接酶作用下，生成的由兩個DNA片
段連接形成的產(chǎn)物有兩種
B. DNA連接酶的作用是將酶切后得到的黏性末端連
接起來，形成一個重組質(zhì)粒時形成兩個磷酸二酯鍵
C. 為了防止目的基因反向連接和質(zhì)粒自身環(huán)化，酶切
時可選用的酶是EcoRⅠ和BamH Ⅰ
D. 受體細(xì)胞能在含青霉素的培養(yǎng)基中生長，表明目
的基因已成功導(dǎo)入該細(xì)胞
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解析：　根據(jù)題意可知，目的基因的兩端有EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ的酶切位
點(diǎn)，將含有目的基因的DNA用EcoR Ⅰ酶切，會得到目的基因片段；根據(jù)質(zhì)
粒的簡圖可知，將質(zhì)粒用EcoR Ⅰ酶切，會得到與質(zhì)粒周長等長的鏈狀
DNA，因此將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用EcoR Ⅰ酶切，在DNA連
接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—質(zhì)粒片段、質(zhì)
?！|(zhì)粒片段三種產(chǎn)物，A錯誤。DNA連接酶的作用是將酶切后得到的黏
性末端連接起來形成一個重組質(zhì)粒，該過程形成四個磷酸二酯鍵，B錯誤。EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的識別序列不同，獲取目的基因和切割質(zhì)粒時，同時選
用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ切割，目的基因兩端形成的末端不同，切割后的質(zhì)粒
兩端形成的末端也不同，再用DNA連接酶連接，可以防止目的基因反向連
接和質(zhì)粒自身環(huán)化，C正確。導(dǎo)入普通質(zhì)粒的受體細(xì)胞和導(dǎo)入重組質(zhì)粒的
受體細(xì)胞都能在含青霉素的培養(yǎng)基中生長，因此能在含青霉素的培養(yǎng)基中
生長的受體細(xì)胞不一定含有目的基因，D錯誤。
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6. （2025·廣東梅州聯(lián)考）PCR引物的3'端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵，5'端無
嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列，dNTP（四種脫氧核苷三磷酸）
是DNA合成的原料。下列相關(guān)說法錯誤的是（　?。?br/>A. 圖示環(huán)節(jié)所需的溫度比上一個環(huán)節(jié)的低
B. dNTP作為擴(kuò)增的原料會依次連接到3'端
C. Taq DNA聚合酶催化磷酸二酯鍵的形成
D. 經(jīng)過1個循環(huán)后，獲得的子代DNA的雙鏈中脫氧核苷酸數(shù)量相同
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解析：　題圖中環(huán)節(jié)為引物與模板堿基互補(bǔ)配對，表示的是復(fù)性環(huán)節(jié)，
復(fù)性的上一環(huán)節(jié)為變性，復(fù)性的溫度（50 ℃左右）比變性的溫度（90 ℃
以上）低，A正確；在PCR擴(kuò)增中，子鏈延伸的方向是從5'端到3'端，所以
dNTP作為擴(kuò)增的原料會依次連接到3'端，B正確；Taq DNA聚合酶能催化
磷酸二酯鍵的形成，C正確；由于兩個引物均不在該片段的端點(diǎn)，因此一
個循環(huán)后，得到的兩個DNA片段中脫氧核苷酸的數(shù)量不一定相同，一般
PCR第三輪才可以擴(kuò)增出雙鏈脫氧核苷酸數(shù)量相同的子代DNA，D錯誤。
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7. （2025·廣東肇慶調(diào)研）在基因工程操作中，科研人員利用識別兩種不
同序列的限制酶（R1和R2）處理基因載體，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢
測，結(jié)果如圖所示。以下相關(guān)敘述中，錯誤的是（　　）
A. 該載體最可能為環(huán)形DNA分子
B. 兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點(diǎn)
C. 限制酶R1與R2的切割位點(diǎn)最短相距200 bp
D. 限制酶作用位點(diǎn)會導(dǎo)致氫鍵和肽鍵斷裂
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解析：　單用限制酶R1或R2切割均只得到一段序列（兩種限制酶切割產(chǎn)
生的DNA片段等長），可知載體可能是環(huán)狀DNA分子，當(dāng)用兩種限制酶R1
和R2同時切割載體時，產(chǎn)生兩種長度的DNA片段，則這兩種限制酶在載體
上各有一個酶切位點(diǎn)，兩種限制酶同時切割可得到200 bp和600 bp的DNA
分子片段，可知限制酶R1和R2的酶切位點(diǎn)最短相距200 bp，A、B、C正
確；限制酶是切割DNA的工具，能夠特異性識別雙鏈DNA分子的某種特定
核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵
斷裂，D錯誤。
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8. （2025·湖南衡陽月考）戊型肝炎病毒
是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)
蛋白（pORF2）位于病毒表面，構(gòu)成病毒
的衣殼。我國科研人員利用基因工程技術(shù)，
在大腸桿菌中表達(dá)pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如圖。下列關(guān)于該疫苗的敘述錯誤的是（　?。?br/>A. 過程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B. 重組基因表達(dá)載體上的啟動子需來源于大腸桿菌
C. 過程⑤需要用Ca2＋處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中
DNA分子的生理狀態(tài)
D. 過程⑥大量制備pORF2蛋白前應(yīng)做相應(yīng)的檢測與鑒定
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解析：　戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，過程①是以病毒RNA為模板合成DNA，獲取目的基因的過程，需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶，原料是四種脫氧核苷酸，A錯誤；啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的識別結(jié)合以驅(qū)動目的基因的轉(zhuǎn)錄，啟動子具有物種或組織特異性，構(gòu)建在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)pORF2的載體時，需要選擇大腸桿菌細(xì)胞的啟動子，而不能選擇其他物種的啟動子，B正確；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是Ca2＋處理法，需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，C正確。
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9. 圖甲為培育轉(zhuǎn)基因生物時選用的載體，圖乙是含有目的基因的一段DNA
序列，圖中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列敘述錯誤的是（　?。?br/>A. 若通過PCR技術(shù)提取該目的基因，應(yīng)該選用引物a和引物c
B. 構(gòu)建表達(dá)載體時可選用BclⅠ和BamHⅠ這兩種限制酶
C. 若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，需用Ca2＋處理大腸桿菌
D. 只利用含四環(huán)素的培養(yǎng)基就不能直接篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的受體
細(xì)胞
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解析：　根據(jù)圖甲可知，BamHⅠ會導(dǎo)致兩種抗性基因都被破壞，所以不宜選用BamHⅠ，為防止目的基因自身環(huán)化，可選用BclⅠ和Hind Ⅲ兩種限制酶切割，B錯誤；由于選擇BclⅠ和Hind Ⅲ這兩種限制酶，破壞了氨芐青霉素抗性基因，但沒有破壞四環(huán)素抗性基因，因此應(yīng)該先用含四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出含有基因表達(dá)載體和普通質(zhì)粒的大腸桿菌，再用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，D正確。
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二、非選擇題
10. （2025·廣東湛江高三一模）甜蛋白是一種高甜度的特殊蛋白質(zhì)，將甜
蛋白基因?qū)敕芽商岣叻烟鹞?，改善果?shí)品質(zhì)，獲得超甜植株。如圖
是甜蛋白基因和Ti質(zhì)粒上限制酶切割位點(diǎn)示意圖?；卮鹣铝邢嚓P(guān)問題：
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（1）利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得超甜番茄的核心步驟是
，該過程需要選擇 限制酶切割甜蛋白基因。
解析： 基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建；切割目的基因時，不能選擇限制酶BamHⅠ，因?yàn)槠鋾茐哪康幕?，故目的基因左?cè)應(yīng)選擇限制酶Xba Ⅰ切割，目的基因應(yīng)插入質(zhì)粒的啟動子和終止子之間，故不能選擇限制酶SalⅠ，綜合考慮，目的基因右側(cè)應(yīng)選擇限制酶Hind Ⅲ切割（Hind Ⅲ靠近終止子，而EcoR Ⅰ靠近啟動子）。
基因表達(dá)載體的構(gòu)
建
Xba Ⅰ和Hind Ⅲ
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（2）Ti質(zhì)粒上的啟動子是 識別和結(jié)合的位點(diǎn)，為了保證
甜蛋白基因能夠在番茄細(xì)胞中表達(dá)，應(yīng)將Ti質(zhì)粒上的啟動子替換為
。
解析：Ti質(zhì)粒上的啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn)，啟動子具有組織特異性，為了保證甜蛋白基因能夠在番茄細(xì)胞中表達(dá)，應(yīng)將Ti質(zhì)粒上的啟動子替換為番茄細(xì)胞中能表達(dá)的基因的啟動子。
RNA聚合酶
番茄
細(xì)胞中能表達(dá)的基因的啟動子
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（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄細(xì)胞時，T-DNA的作用是
，該過程發(fā)生的變異類型
為 。然后在添加 （填物質(zhì)）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)番
茄細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織。
解析：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄細(xì)胞時，T-DNA的作用是攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞并將其整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，該過程使受體細(xì)胞發(fā)生了基因重組。由于重組質(zhì)粒中含有卡那霉素抗性基因，因此在添加卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)番茄細(xì)胞，篩選出導(dǎo)入甜蛋白基因的細(xì)胞，進(jìn)而可獲得轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織。
攜帶目的基因進(jìn)入受體
細(xì)胞并將其整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上
基因重組
卡那霉素
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（4）若得到的超甜番茄體細(xì)胞中導(dǎo)入的是2個甜蛋白基因，則讓其自交，
若子代表型及比例為 ，則說明2個甜蛋白
基因插入兩對同源染色體上（含有1個和2個甜蛋白基因的番茄甜味相同）。
解析：若2個甜蛋白基因插入兩對同源染色體上，即相當(dāng)于雙雜合類型，遺傳上遵循基因的自由組合定律，則讓其自交，后代中只要含有甜蛋白基因，其性狀就表現(xiàn)為超甜，則其自交產(chǎn)生的后代的表型及比例為超甜番茄∶普通番茄＝15∶1。
超甜番茄∶普通番茄＝15∶1
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