資源簡介

PCR技術和基因編輯技術
1.RT-PCR（逆轉錄PCR）
常規的PCR過程是由DNA依賴的DNA聚合酶以DNA作為模板進行擴增的，而逆轉錄PCR則由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉錄酶）來完成。首先，由逆轉錄酶將RNA單鏈轉錄為與其互補的DNA（cDNA），再通過常規PCR和相應引物進行另一DNA鏈的合成以及DNA雙鏈的擴增。逆轉錄PCR是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數的RNA，廣泛應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監測某種RNA的含量。
2.反向PCR
反向PCR是克隆基因組已知序列旁側序列的一種方法。其原理是選取已知序列中不存在的內切酶對基因組進行酶切，使已知序列和待檢測的旁側序列位于同一片段被切下，然后對該片段進行自身環化。以該環化DNA作為模板，根據已知序列設計一對反向引物進行擴增，從而獲得所需的未知序列信息。利用該技術也可以實現對現有的環狀DNA（如質粒）的線性化。
3.不對稱PCR
不對稱PCR是利用不等量的一對引物經PCR擴增后產生大量的單鏈DNA的過程，這對引物分別稱為非限制性引物和限制性引物，兩條引物的比例通常為100∶1，這樣隨著PCR反應的進行，濃度低的引物很快被消耗光，高濃度引物隨即產生大量的目的單鏈DNA。低濃度引物的加入保證了擴增過程具有足夠多的模板，而高濃度引物則保證了單鏈DNA的大量合成。
4.熒光定量PCR
（1）熒光染料
熒光染料與DNA雙鏈結合時發出熒光信號，不摻入鏈中的（游離的）染料不會發出任何熒光信號。
（2）水解探針，以TaqMan探針為代表。
①水解探針的組成
②水解探針（TaqMan）工作原理
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光報告基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。圖示如下：
5.巢式PCR
巢式PCR先用待擴增DNA外側的一對引物完成一次PCR，再將其作為模板，根據原來引物內側的序列設置新的引物，再次完成第二次PCR。由于第二次PCR的模板DNA片段更短，引物更小因此可以減少第一次擴增中出現的非特異性擴增片段，提升擴增的精確性。但由于操作過程中的開蓋處理，會增加產物污染的概率。圖示如下：
6.重疊延伸PCR
重疊延伸PCR技術是采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來的技術，可通過定點誘變在體外改造DNA分子，并將改造后的目的基因導入質粒構建目的基因表達載體。
（1）上圖所示的重疊延伸PCR技術中，PCR1的引物是引物A、引物C。PCR4可獲得大量定點誘變目的基因，此時的引物為引物C、引物D。PCR3時模板DNA不能選擇DNA分子③的原因是子鏈的延伸方向只能從5'→3'，以DNA分子③作模板時子鏈不能延伸。
（2）為使重疊延伸PCR技術改造后的目的基因（該基因序列不含圖中限制酶的識別序列）能與載體正確連接，PCR4時，應在基因上、下游引物的5'端分別添加限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ的酶切位點。
7.基因編輯技術
CRISPR/Cas9基因編輯技術能對基因進行定點編輯，其原理是由一條單鏈向導RNA（sgRNA）引導內切核酸酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割（如圖）。CRISPR復合體中的sgRNA的主要功能是與靶向基因（目的基因）上特定堿基序列互補，從而定向引導Cas9蛋白與靶向基因結合，并在特定位點切割DNA。
CRISPR/Cas9基因編輯技術培育轉基因生物，與傳統的基因工程相比，其明顯優點是可將目的基因定點插入所需位點，避免了因目的基因隨機插入宿主細胞DNA引起的生物安全性問題。CRISPR/Cas9基因編輯技術在基因治療、基因水平進行動植物的育種、研究基因的功能等方面有廣闊的應用前景。
1.（2024·江蘇南京調研）下圖是快速RT-PCR過程示意圖，①和②為逆轉錄酶催化的逆轉錄過程，③是PCR過程。據圖分析下列敘述錯誤的是（　　）
A.逆轉錄酶具有DNA聚合酶能力
B.③PCR過程只需要引物b
C.RT-PCR可檢測基因表達水平
D.RT-PCR可檢測合胞病毒等RNA病毒
2.（2024·山東濰坊質檢）反向PCR流程如圖所示，該技術可利用一段已知DNA序列設計合理的引物，擴增已知序列兩端的未知序列。圖中已知序列一條鏈的堿基排列順序為“5'—AACTATGCGCTCATGAGCAATGCGTAGCCTCT—3'”。下列敘述錯誤的是（　　）
A.Ⅰ酶切：用一種限制酶切割DNA，以使兩端未知序列形成相同的黏性末端
B.Ⅱ連接：使用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間形成磷酸二酯鍵
C.設計的兩種引物分別是“5'—AACTATGCGCTCATGA—3'”和“5'—AGAGGCTACGCATTGC—3'”
D.對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。該DNA單鏈序列可能為“5'—AATTCCAGT—……—CTGAATT—3'”
3.不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產生大量單鏈DNA（ssDNA）的方法，如圖所示。不對稱PCR中加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1∶100，PCR反應最初的若干次循環中，其擴增產物主要是雙鏈DNA（dsDNA），但當限制性引物消耗完后，就會產生大量的ssDNA。下列相關說法錯誤的是（　　）
A.用不對稱PCR方法擴增目的基因時，不需要知道基因的全部序列
B.進行最初若干次循環的目的是增加模板DNA的量
C.最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈的堿基序列一致
D.因為雙鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離
4.（2024·河北正定一中高三月考）人類猴痘由Yaba猴病毒（雙鏈DNA病毒）引起，實時熒光定量PCR（qPCR）可用于Yaba 猴病毒的快速檢測。進行qPCR 時，在反應體系加入 TaqMan探針，TaqMan探針兩端連有熒光基團（R）和抑制熒光發出的淬滅基團（Q），完整的TaqMan探針不發出熒光，當探針被水解后R基團會發出熒光（如圖所示），隨循環次數的增加，熒光信號強度增加。
（1）采用 qPCR 檢測Yaba 猴病毒需在一定的　　　　溶液中才能進行，反應體系中還需提供DNA模板、原料、　　　　、TaqMan探針、TaqDNA聚合酶、Mg2＋等。qPCR過程中，Taq DNA 聚合酶的兩個作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（2）qPCR檢測病毒的核酸一般具有特異性強和靈敏度高的特點，這與反應體系中加入的　　　　和　　　　有關。但有時也可能會出現“假陰性”的結果。可能的原因有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（答出兩點）。
（3）在PCR反應體系中一般都要加入Mg2＋，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。為了探究Mg2＋對PCR擴增效果的影響，科研人員在PCR反應體系中加入不同濃度的Mg2＋進行了實驗。結果如圖所示，據此可得出的結論有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
5.（2024·江蘇如皋模擬）巢式PCR是一種特殊的聚合酶鏈式反應，使用兩組不同的引物實現目標DNA片段的擴增。第一組外引物擴增出的DNA片段（中間產物）長度超出目標區域，第二組內引物稱為巢式引物，其結合部位在中間產物內部的目標區域，從而擴增出目標產物，具體過程如圖所示。請回答下列問題。
（1）巢式PCR反應體系中需加入DNA模板、　　　　　　　　、　　　　　　　、引物、Mg2＋、緩沖液等。
（2）巢式PCR過程中反應溫度最低的一步是　　　。巢式PCR中外引物的第一階段擴增和內引物的第二階段擴增通常在不同的離心管中進行，可防止　　　　在第一階段PCR中與模板結合。
（3）若直接用圖中的內引物對模板DNA擴增，則內引物與模板的非目標區域進行堿基互補配對的概率會　　　　（填“上升”或“下降”），不易得到目標產物。巢式PCR獲得的產物特異性　　　　（填“高”或“低”）。
6.（2024·江蘇常州模擬）重疊延伸PCR技術是常規PCR技術的衍生，它依據需要連接的基因中核苷酸序列（或基因片段）設計出多對具有互補末端的引物，先分段對模板進行擴增，再將PCR產物混合，其中的重疊鏈將相互搭橋、互為模板而延伸，最終實現不同來源的擴增片段重疊拼接起來的目的，如圖1所示。請分析并回答下列問題：
（1）圖1中的過程②在　　　　個反應體系中進行，原因是　　　　　　　　　　。經過程②后，體系中存在不同長度的DNA片段，獲取所需DNA的方法是　　　　　　。①中引物2和引物3的游離部分分別與　　　　　　　　　　　　　　　　的部分序列同源。
（2）圖1中的過程⑥　　　　（填“需要”或“不需要”）另加引物，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。進行②⑥⑧⑩過程時，需要在一定的緩沖溶液中進行，⑩過程除圖示條件還需要加入　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（3）重疊延伸PCR技術可用于基因的定點突變。基因定點突變是根據目的基因（如圖2蛋白A基因）的序列，設計4條單鏈寡核苷酸片段為引物（圖2中的引物A→D），原理是取引物A、B進行PCR1反應，以及引物C、D進行PCR2反應，然后將需要的兩個片段混合、延伸并大量擴增。圖2引物B和引物C中的∧、∨代表　　　　　　　　，引物B和引物C堿基序列間存在的關系是　　　　。
7.（2021·海南選擇考）CRISPR/Cas9是一種高效的基因編輯技術，Cas9基因表達的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在單鏈向導RNA（sgRNA）引導下，切割DNA雙鏈以敲除目標基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因編輯技術的工作原理如圖所示。
（1）過程①中，為構建CRISPR/Cas9重組質粒，需對含有特定sgRNA編碼序列的DNA進行酶切處理，然后將其插入到經相同酶切處理過的質粒上，插入時所需要的酶是　　　　　　　　　　 。
（2）過程②中，將重組質粒導入大腸桿菌細胞的方法是　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（3）過程③～⑤中，sgRNA與Cas9蛋白形成復合體，該復合體中的sgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結合，二者結合所遵循的原則是　　　　　　　　。隨后，Cas9蛋白可切割　　　　　　　序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除一個長度為1 200 bp的基因，在DNA水平上判斷基因敲除是否成功所采用的方法是　　　　　　　　　　，基因敲除成功的判斷依據是　　　　　　　　　。
（5）某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人員將該蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9質粒中獲得重組質粒，隨后將其導入到大腸桿菌細胞，通過基因編輯把該蛋白酶基因插入到基因組DNA中，構建得到能大量分泌該蛋白酶的工程菌。據圖簡述CRISPR/Cas9重組質粒在受體細胞內，將該蛋白酶基因插入到基因組DNA的編輯過程：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
拓展微課7　PCR技術和基因編輯技術
針對訓練用活
1.B　③PCR過程需要一對引物，B錯誤。
2.C　由圖可知，經過Ⅰ酶切過程后，由于用一種限制酶切割DNA，從而使兩端未知序列形成相同的黏性末端，A正確；Ⅱ過程是將DNA片段連接起來，該過程中使用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，B正確；設計的兩種引物需要與已知序列發生堿基互補配對，而后向兩側延伸合成未知序列，因此合成的引物分別是“5'—TCATGAGCGCATAGTT—3'”和“5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3'”，C錯誤；對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列，由于F序列是未知序列，根據限制酶產生的黏性末端，推測該DNA單鏈序列可能為“5'—AATTCCAGT—……—CTGAATT—3'”，D正確。
3.C　不對稱PCR中加入的一對引物中含量較多的被稱為非限制性引物，非限制性引物是與乙鏈結合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，C錯誤。
4.（1）緩沖　引物　催化合成DNA子鏈；催化探針水解　（2）引物　探針　取樣不規范；取樣所獲樣本量不足；病毒發生了基因突變　（3）TaqDNA聚合酶需要Mg2＋激活　在不含 Mg2＋的緩沖液中靶基因幾乎無法擴增；在不同濃度的Mg2＋緩沖液中靶基因的擴增效果不同；在實驗濃度下，4 mM 為最佳濃度
5.（1）耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）　原料（4種脫氧核苷酸）　（2）復性　內引物　（3）上升　高
解析：（1）PCR（聚合酶鏈式反應）反應包括三個基本步驟，即：模板DNA的變性、模板DNA與引物的復性、引物的延伸。PCR反應體系包括5種基本成分，依次為：引物、TaqDNA聚合酶、原料（4種脫氧核苷酸）、模板DNA、Mg2＋。（2）PCR過程包括過程高溫變性、低溫復性、中溫延伸。故巢式PCR過程中反應溫度最低的一步是復性。巢式PCR兩次擴增所用的引物是不同的，因此兩個階段反應不在同一試管完成的主要原因是防止內引物在第一階段PCR中與模板結合。（3）巢式PCR通過兩輪PCR反應，使用兩套引物擴增特異性的DNA片段，第二對引物的功能是特異性的擴增位于首輪PCR產物內的一段DNA片段。第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在內引物的存在下進行第二輪擴增，從而提高反應的特異性獲得的產物特異性更高。若直接用圖中的內引物對模板DNA擴增，則內引物與模板的非目標區域進行堿基互補配對的概率會上升，不易得到目標產物。
6.（1）2　引物互補影響PCR結果　（瓊脂糖凝膠）電泳分離　外顯子B、外顯子A　（2）不需要　兩條DNA的交錯部分即可作為其延伸的引物　原料（四種脫氧核苷酸）、耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）　（3）突變堿基　互補
解析：（1）分析題圖1可知，擴增外顯子A需要用引物1和引物2，擴增外顯子B需要引物3和引物4，由于引物2和引物3互補，所以需要在兩個反應體系中進行。DNA分子在瓊脂糖凝膠中時有電荷效應和分子篩效應，具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子泳動速度不一樣。由圖1可知，①中引物2和引物3的游離部分分別與外顯子B、外顯子A的部分序列同源。（2）由于引物2有一部分與外顯子A重疊，還有一部分與外顯子B重疊，可作為其延伸的引物，故圖1中的過程⑥不需要另加引物。進行②⑥⑧過程就屬于DNA分子的復制了，所以DNA分子復制時需要四種脫氧核苷酸，由于整個過程在PCR儀器中，所以需要耐高溫的DNA聚合酶。（3）基因定點突變是根據目的基因的序列，使基因上的某堿基缺失、增添或替換，故圖2引物B和引物C中的“A”代表突變堿基，分析圖2可知，引物B和引物C堿基序列間存在的關系互補。
7.（1）DNA連接酶　（2）感受態細胞法　（3）堿基互補配對原則　目標DNA特定的核苷酸　（4）DNA分子雜交技術　不出現雜交帶　（5）CRISPR/Cas9重組質粒在受體細胞內進行轉錄和表達，轉錄的產物是sgRNA，表達的產物是Cas9蛋白，二者形成復合體，該復合體中的sgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結合，從而插入到基因組DNA中
解析：（1）過程①中，為構建CRISPR/Cas9重組質粒，需對含有特定sgRNA編碼序列的DNA進行酶切處理，然后將其插入到經相同酶切處理過的質粒上，插入時所需要的酶是DNA連接酶。（2）大腸桿菌是原核生物，屬于微生物，將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。（3）根據題圖可知，在CRISPR/Cas9基因編輯技術中，sgRNA是根據靶基因設計的引導RNA，準確引導Cas9蛋白切割與sgRNA配對的靶基因DNA序列。Cas9蛋白能借助sgRNA分子與目標DNA進行特異性結合的原因是sgRNA分子上的堿基序列與目標DNA分子上的堿基序列可以通過堿基互補配對原則實現sgRNA與目標DNA特定序列的特定識別，進而定位；由此可見，Cas9蛋白在功能上屬于限制酶，可切割目標DNA特定的核苷酸序列。（4）可利用DNA分子雜交技術判斷基因敲除是否成功，若不出現雜交帶，則說明基因敲除成功。（5）根據題圖可知，CRISPR/Cas9重組質粒在受體細胞內進行轉錄和表達，轉錄的產物是sgRNA，表達的產物是Cas9蛋白，二者形成復合體，該復合體中的sgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結合，從而插入到基因組DNA中。
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拓展微課7　
PCR技術和基因編輯技術
高中總復習·生物
1. RT-PCR（逆轉錄PCR）
常規的PCR過程是由DNA依賴的DNA聚合酶以DNA作為模板進行擴增的，
而逆轉錄PCR則由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉錄酶）來完成。首先，由
逆轉錄酶將RNA單鏈轉錄為與其互補的DNA（cDNA），再通過常規PCR
和相應引物進行另一DNA鏈的合成以及DNA雙鏈的擴增。逆轉錄PCR是一
種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數的RNA，廣泛應用于遺傳病的診
斷，并且可以用于定量監測某種RNA的含量。
2. 反向PCR
反向PCR是克隆基因組已知序列旁側序列的一種方法。其原理是選取已知
序列中不存在的內切酶對基因組進行酶切，使已知序列和待檢測的旁側序
列位于同一片段被切下，然后對該片段進行自身環化。以該環化DNA作為
模板，根據已知序列設計一對反向引物進行擴增，從而獲得所需的未知序
列信息。利用該技術也可以實現對現有的環狀DNA（如質粒）的線性化。
3. 不對稱PCR
不對稱PCR是利用不等量的一對引物經PCR擴增后產生大量的單鏈DNA的
過程，這對引物分別稱為非限制性引物和限制性引物，兩條引物的比例通
常為100∶1，這樣隨著PCR反應的進行，濃度低的引物很快被消耗光，高
濃度引物隨即產生大量的目的單鏈DNA。低濃度引物的加入保證了擴增過
程具有足夠多的模板，而高濃度引物則保證了單鏈DNA的大量合成。
4. 熒光定量PCR
（1）熒光染料
熒光染料與DNA雙鏈結合時發出熒光信號，不摻入鏈中的（游離的）染料
不會發出任何熒光信號。
（2）水解探針，以TaqMan探針為代表。
①水解探針的組成
②水解探針（TaqMan）工作原理
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探
針為寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基
團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴
增時，Taq酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光報告基團和
熒光淬滅基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增
一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR
產物形成完全同步。圖示如下：
5. 巢式PCR
巢式PCR先用待擴增DNA外側的一對引物完成一次PCR，再將其作為模
板，根據原來引物內側的序列設置新的引物，再次完成第二次PCR。由于
第二次PCR的模板DNA片段更短，引物更小因此可以減少第一次擴增中出
現的非特異性擴增片段，提升擴增的精確性。但由于操作過程中的開蓋處
理，會增加產物污染的概率。圖示如下：
6. 重疊延伸PCR
重疊延伸PCR技術是采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來的技術，可通過定點誘變在體外改造DNA分子，并將改造后的目的基因導入質粒構建目的基因表達載體。
（1）上圖所示的重疊延伸PCR技術中，PCR1的引物是引物A、引物C。
PCR4可獲得大量定點誘變目的基因，此時的引物為引物C、引物D。PCR3
時模板DNA不能選擇DNA分子③的原因是子鏈的延伸方向只能從5'→3'，
以DNA分子③作模板時子鏈不能延伸。
（2）為使重疊延伸PCR技術改造后的目的基因（該基因序列不含圖中限制
酶的識別序列）能與載體正確連接，PCR4時，應在基因上、下游引物的5'
端分別添加限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ的酶切位點。
7. 基因編輯技術
CRISPR/Cas9基因編輯技術能對基因進行定點編輯，其原理是由一條單鏈
向導RNA（sgRNA）引導內切核酸酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割
（如圖）。CRISPR復合體中的sgRNA的主要功能是與靶向基因（目的基
因）上特定堿基序列互補，從而定向引導Cas9蛋白與靶向基因結合，并在
特定位點切割DNA。
CRISPR/Cas9基因編輯技術培育轉基因生物，與傳統的基因工程相比，其
明顯優點是可將目的基因定點插入所需位點，避免了因目的基因隨機插入
宿主細胞DNA引起的生物安全性問題。CRISPR/Cas9基因編輯技術在基因
治療、基因水平進行動植物的育種、研究基因的功能等方面有廣闊的應用
前景。
1. （2024·江蘇南京調研）如圖是快速RT-PCR過程示意圖，①和②為逆轉
錄酶催化的逆轉錄過程，③是PCR過程。據圖分析下列敘述錯誤的是
（　　）
A. 逆轉錄酶具有DNA聚合酶能力
B. ③PCR過程只需要引物b
C. RT-PCR可檢測基因表達水平
D. RT-PCR可檢測合胞病毒等RNA病毒
解析：　③PCR過程需要一對引物，B錯誤。
√
2. （2024·山東濰坊質檢）反向PCR流程如圖所示，該技術可利用一段已知DNA序列設計合理的引物，擴增已知序列兩端的未知序列。圖中已知序列一條鏈的堿基排列順序為“5'—AACTATGCGCTCATGAGCAATGCGT
AGCCTCT—3'”。下列敘述錯誤的是（　　）
A. Ⅰ酶切：用一種限制酶切割DNA，以使兩端未
知序列形成相同的黏性末端
B. Ⅱ連接：使用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間
形成磷酸二酯鍵
C. 設計的兩種引物分別是“5'—AACTATGCGCTCA
TGA—3'”和“5'—AGAGGCTACGCATTGC—3'”
D. 對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。該DNA單鏈序列可
能為“5'—AATTCCAGT—……—CTGAATT—3'”
√
解析：　由圖可知，經過Ⅰ酶切過程后，由于用一種限制酶切割DNA，從
而使兩端未知序列形成相同的黏性末端，A正確；Ⅱ過程是將DNA片段連
接起來，該過程中使用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，
B正確；設計的兩種引物需要與已知序列發生堿基互補配對，而后向兩側
延伸合成未知序列，因此合成的引物分別是“5'—
TCATGAGCGCATAGTT—3'”和“5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3'”，C
錯誤；對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列，由于F序列是未
知序列，根據限制酶產生的黏性末端，推測該DNA單鏈序列可能為“5'—
AATTCCAGT—……—CTGAATT—3'”，D正確。
3. 不對稱PCR是利用不等量的一對引
物來產生大量單鏈DNA（ssDNA）的
方法，如圖所示。不對稱PCR中加入
的一對引物中含量較少的被稱為限制
性引物，含量較多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1∶100，
PCR反應最初的若干次循環中，其擴增產物主要是雙鏈DNA（dsDNA），
但當限制性引物消耗完后，就會產生大量的ssDNA。下列相關說法錯誤的
是（　　）
A. 用不對稱PCR方法擴增目的基因時，不需要知道基因的全部序列
B. 進行最初若干次循環的目的是增加模板DNA的量
C. 最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈的堿基序列一致
D. 因為雙鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離
√
解析：　不對稱PCR中加入的一對引物中含量較多的被稱為非限制性引
物，非限制性引物是與乙鏈結合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿
基序列一致，C錯誤。
4. （2024·河北正定一中高三月考）人類猴
痘由Yaba猴病毒（雙鏈DNA病毒）引起，實
時熒光定量PCR（qPCR）可用于Yaba 猴病
毒的快速檢測。進行qPCR 時，在反應體系
加入 TaqMan探針，TaqMan探針兩端連有
熒光基團（R）和抑制熒光發出的淬滅基團
（Q），完整的TaqMan探針不發出熒光，當探針被水解后R基團會發出熒光（如圖所示），隨循環次數的增加，熒光信號強度增加。
（1）采用 qPCR 檢測Yaba 猴病毒需在一定的 溶液中才能進行，
反應體系中還需提供DNA模板、原料、 、TaqMan探針、
TaqDNA聚合酶、Mg2＋等。qPCR過程中，Taq DNA 聚合酶的兩個作用
是 。
緩沖
引物
催化合成DNA子鏈；催化探針水解
（2）qPCR檢測病毒的核酸一般具有特異性強和靈敏度高的特點，這與反
應體系中加入的 和 有關。但有時也可能會出現“假陰
性”的結果。可能的原因有
（答出兩點）。
引物
探針
取樣不規范；取樣所獲樣本量不足；病毒發
生了基因突變
（3）在PCR反應體系中一般都要加入Mg2＋，原因是
。為了探究Mg2＋對PCR擴增效果的影響，科研人員在PCR
反應體系中加入不同濃度的Mg2＋進行了實驗。結果如圖所示，據此可得出
的結論有
。
TaqDNA聚合酶需
要Mg2＋激活
在不含 Mg2＋的緩沖液中靶基因幾乎無法擴增；在不同濃度的
Mg2＋緩沖液中靶基因的擴增效果不同；在實驗濃度下，4 mM 為最佳濃度
5. （2024·江蘇如皋模擬）巢式PCR是一種特殊的聚合酶鏈式反應，使用
兩組不同的引物實現目標DNA片段的擴增。第一組外引物擴增出的DNA片
段（中間產物）長度超出目標區域，第二組內引物稱為巢式引物，其結合
部位在中間產物內部的目標區域，從而擴增出目標產物，具體過程如圖所
示。請回答下列問題。
（1）巢式PCR反應體系中需加入DNA模板、
、 、引物、Mg2＋、緩
沖液等。
解析：PCR（聚合酶鏈式反應）反應包括三個基本步驟，即：模板DNA的變性、模板DNA與引物的復性、引物的延伸。PCR反應體系包括5種基本成分，依次為：引物、TaqDNA聚合酶、原料（4種脫氧核苷酸）、模板DNA、Mg2＋。
耐高溫的DNA聚合酶
（TaqDNA聚合酶）
原料（4種脫氧核苷酸）
（2）巢式PCR過程中反應溫度最低的一步是 。巢式PCR中外引物
的第一階段擴增和內引物的第二階段擴增通常在不同的離心管中進行，可
防止 在第一階段PCR中與模板結合。
解析： PCR過程包括過程高溫變性、低溫復性、中溫延伸。故巢式PCR過程中反應溫度最低的一步是復性。巢式PCR兩次擴增所用的引物是不同的，因此兩個階段反應不在同一試管完成的主要原因是防止內引物在第一階段PCR中與模板結合。
復性
內引物
（3）若直接用圖中的內引物對模板DNA擴增，則內引物與模板的非目標
區域進行堿基互補配對的概率會 （填“上升”或“下降”），不
易得到目標產物。巢式PCR獲得的產物特異性 （填“高”或“低”）。
解析：巢式PCR通過兩輪PCR反應，使用兩套引物擴增特異性的DNA片段，第二對引物的功能是特異性的擴增位于首輪PCR產物內的一段DNA片段。第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在內引物的存在下進行第二輪擴增，從而提高反應的特異性獲得的產物特異性更高。若直接用圖中的內引物對模板DNA擴增，則內引物與模板的非目標區域進行堿基互補配對的概率會上升，不易得到目標產物。
上升
高
6. （2024·江蘇常州模擬）重疊延伸PCR技
術是常規PCR技術的衍生，它依據需要連
接的基因中核苷酸序列（或基因片段）設計
出多對具有互補末端的引物，先分段對模板
進行擴增，再將PCR產物混合，其中的重疊
鏈將相互搭橋、互為模板而延伸，最終實現
不同來源的擴增片段重疊拼
接起來的目的，如圖1所示。
請分析并回答下列問題：
（1）圖1中的過程②在 個反應體系中進行，原因是
。經過程②后，體系中存在不同長度的DNA片段，獲取所需
DNA的方法是 。①中引物2和引物3的游離部
分分別與 的部分序列同源。
解析：分析題圖1可知，擴增外顯子A需要用引物1和引物2，擴增外
顯子B需要引物3和引物4，由于引物2和引物3互補，所以需要在兩個反應
體系中進行。DNA分子在瓊脂糖凝膠中時有電荷效應和分子篩效應，具有
不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。相對分子
質量相同，但構型不同的DNA分子泳動速度不一樣。由圖1可知，①中引
物2和引物3的游離部分分別與外顯子B、外顯子A的部分序列同源。
2
引物互補影響
PCR結果
（瓊脂糖凝膠）電泳分離
外顯子B、外顯子A
（2）圖1中的過程⑥ （填“需要”或“不需要”）另加引物，
原因是 。進行②⑥⑧⑩過
程時，需要在一定的緩沖溶液中進行，⑩過程除圖示條件還需要加入
。
解析： 由于引物2有一部分與外顯子A重疊，還有一部分與外顯子B重
疊，可作為其延伸的引物，故圖1中的過程⑥不需要另加引物。進行②⑥
⑧⑩過程就屬于DNA分子的復制了，所以DNA分子復制時需要四種脫氧核
苷酸，由于整個過程在PCR儀器中，所以需要耐高溫的DNA聚合酶。
不需要
兩條DNA的交錯部分即可作為其延伸的引物
原
料（四種脫氧核苷酸）、耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
（3）重疊延伸PCR技術可用于基因的定點突變。基因定點突變是根據目的
基因（如圖2蛋白A基因）的序列，設計4條單鏈寡核苷酸片段為引物（圖2
中的引物A→D），原理是取引物A、B進行PCR1反應，以及引物C、D進
行PCR2反應，然后將需要的兩個片段混合、延伸并大量擴增。圖2引物B
和引物C中的∧、∨代表 ，引物B和引物C堿基序列間存在的關
系是 。
解析： 基因定點突變是根據目的基因的序列，使基因上的某堿基缺
失、增添或替換，故圖2引物B和引物C中的“A”代表突變堿基，分析圖2
可知，引物B和引物C堿基序列間存在的關系互補。
突變堿基
互補
7. （2021·海南選擇考）CRISPR/Cas9是一種高效的基因編輯技術，Cas9
基因表達的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在單鏈向導RNA（sgRNA）引
導下，切割DNA雙鏈以敲除目標基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因
編輯技術的工作原理如圖所示。
（1）過程①中，為構建CRISPR/Cas9重組質粒，需對含有特定sgRNA編碼
序列的DNA進行酶切處理，然后將其插入到經相同酶切處理過的質粒上，
插入時所需要的酶是 。
解析：過程①中，為構建CRISPR/Cas9重組質粒，需對含有特定
sgRNA編碼序列的DNA進行酶切處理，然后將其插入到經相同酶切處理過
的質粒上，插入時所需要的酶是DNA連接酶。
（2）過程②中，將重組質粒導入大腸桿菌細胞的方法是 。
解析：大腸桿菌是原核生物，屬于微生物，將目的基因導入微生物
細胞的方法是感受態細胞法。
DNA連接酶
感受態細胞法
（3）過程③～⑤中，sgRNA與Cas9蛋白形成復合體，該復合體中的
sgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結合，二者結合所遵循的原則
是 。隨后，Cas9蛋白可切割
序列。
堿基互補配對原則
目標DNA特定的核
苷酸
解析： 根據題圖可知，在CRISPR/Cas9基因編輯技術中，sgRNA
是根據靶基因設計的引導RNA，準確引導Cas9蛋白切割與sgRNA配對
的靶基因DNA序列。Cas9蛋白能借助sgRNA分子與目標DNA進行特異
性結合的原因是sgRNA分子上的堿基序列與目標DNA分子上的堿基序
列可以通過堿基互補配對原則實現sgRNA與目標DNA特定序列的特定
識別，進而定位；由此可見，Cas9蛋白在功能上屬于限制酶，可切割
目標DNA特定的核苷酸序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除一個長度為1 200 bp的基因，在
DNA水平上判斷基因敲除是否成功所采用的方法是 ，基因敲除成功的判斷依據是 。
解析： 可利用DNA分子雜交技術判斷基因敲除是否成功，若不出現雜交帶，則說明基因敲除成功。
DNA分子雜交技術
不出現雜交帶
（5）某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人員將該蛋白酶基因
插入到CRISPR/Cas9質粒中獲得重組質粒，隨后將其導入到大腸桿菌細
胞，通過基因編輯把該蛋白酶基因插入到基因組DNA中，構建得到能大量
分泌該蛋白酶的工程菌。據圖簡述CRISPR/Cas9重組質粒在受體細胞內，
將該蛋白酶基因插入到基因組DNA的編輯過程：


。
CRISPR/Cas9重組質粒
在受體細胞內進行轉錄和表達，轉錄的產物是sgRNA，表達的產物是Cas9
蛋白，二者形成復合體，該復合體中的sgRNA可識別并與目標DNA序列特
異性結合，從而插入到基因組DNA中
解析： 根據題圖可知，CRISPR/Cas9重組質粒在受體細胞內進行轉錄
和表達，轉錄的產物是sgRNA，表達的產物是Cas9蛋白，二者形成復合
體，該復合體中的sgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結合，從而插入
到基因組DNA中。
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