資源簡介

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人教版高中生物 選擇性必修3
第1章　第2節　微生物的培養技術及應用
第二課時 微生物的選擇培養和計數
學習目標
1.能運用生物與環境相適應的觀點，解釋選擇培養基篩選微生物的原理。
2.能按照科學探究的要求，應用稀釋涂布平板法和微生物數量測定的方法，設計從土壤中分離分解尿素的細菌并進行計數的方案。依據設計的方案，運用無菌操作技術和微生物分離、培養的方法初步分離出目標菌。
自然界中微生物數量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當要分離的微生物在混合菌群中不是優勢種群時，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實現。該怎么辦呢？
事實1
稀釋涂布平板法中出現的雜菌
新課導入
科學實例
尋找耐高溫的DNA聚合酶
在美國黃石國家公園的一個熱泉中發現了耐熱的水生棲熱菌，并分離到耐高溫的DNA聚合酶。
美國黃石公園
相應的生存環境中尋找
耐寒微生物
耐熱微生物
石油分解菌
選擇培養基
實驗室微生物篩選原理:人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養、溫度和pH）等，同時抑制或阻止其他微生物生長。
纖維素分解菌
啟示
目錄
選擇培養基、微生物的選擇培養和數量測定
01
探究 實踐——土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
02
高溫環境下培養
無氧環境下培養
1.選擇培養基：
在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，稱為選擇培養基。
2.方法：
（1）在培養基中加入某種化學物質。
（2）改變培養基中的營養成分。
（3）改變微生物的培養條件。
耐高溫微生物
厭氧型微生物
兼性厭氧型
（一）選擇培養基
分離得到酵母菌、霉菌等
加高濃度食鹽的培養基
分離得到金黃色葡萄球菌
加入青霉素的培養基
分離固氮菌
分離自養型微生物
不加含碳有機物的無碳培養基
不加氮源的無氮培養基
尿素施入土壤后，會被某些細菌分解成NH3，再被轉化為NO3-、NH4+等被植物吸收。這些細菌能合成脲酶，脲酶催化尿素分解產生NH3，再被轉化為NO3-、NH4+等被植物吸收。通常1g土壤中有幾億到幾百億個土壤微生物，其中細菌的數量最多，能分解尿素的細菌只是其中的一部分。
事實2
結合材料思考
1.如果讓你配制一種培養基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養基的配方該如何設計？
在選擇培養基中，以尿素作為唯一氮源，只有能合成脲酶的細菌才能生長發育繁殖。
2.該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？
除以尿素作為唯一氮源外，該培養基的其他營養成分與普通培養基基本相同。
3.怎么證明一個選擇培養基具有選擇性呢？
應該設置基礎培養基（如牛肉膏蛋白胨培養基）或完全培養基作為對照，若對照培養基中生長的菌落數多于該選擇培養基，則該選擇培養基具有選擇性。
1.選擇培養基的作用：
2.微生物選擇培養獲取純培養物的方法：
分離并計數某種微生物的數量（例如，能分解尿素的細菌）。
由于土壤中細菌的數量龐大，要想得到能分解尿素的細菌的純培養物，必須要對土樣進行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的培養基上，也就是要采用稀釋涂布平板法。
選擇培養基
+
稀釋涂布平板
單菌落
（二）微生物的選擇培養
梯度稀釋
涂布平板
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 無菌水
90mL無菌水
10g
在火焰旁將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。
3.稀釋涂布平板法的操作過程：
（二）微生物的選擇培養
（1）梯度稀釋
微量
移液器
③取0.1mL菌液，滴加到培養基表面。
④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。
⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。
⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。
待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，培養。
各梯度分別涂布3個平板
1個不涂布作空白對照
3.稀釋涂布平板法的操作過程：
（二）微生物的選擇培養
（2）涂布平板
梯度稀釋
涂布平板
放入30~37℃恒溫箱中
培養1～2d
稀釋103倍
稀釋104倍
稀釋105倍
空白對照
恒溫培養箱
思考：
設置空白對照組的目的是什么？
檢測培養基滅菌是否徹底，保證實驗結果的準確性。
根據實驗結果，能否計算出細菌數目的是多少？原理是什么？
可以。
4.培養與觀察
（二）微生物的選擇培養
①分離微生物
②統計樣品中活菌的數目
（三）微生物的數量測定
1.稀釋涂布平板法
② 計數原則：
① 原理：
當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個______。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少______。
活菌
活菌
選擇30-300個菌落的平板進行計數；
每個稀釋度至少取3個平板取其平均值；
統計的結果一般用菌落數而不是活菌數；
統計的菌落往往比活菌的實際數目低；
恰當的稀釋度、涂布是否均勻是成功統計菌落數目的關鍵。
因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
M：代表稀釋倍數；
C：代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數；
V：代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)
4號試管的結果表明每克土壤中的活菌數約為________個
③ 計算公式：
每g樣品中的菌落數＝(C÷V)×M
1.1×108
——間接計數法
（三）微生物的數量測定
1.稀釋涂布平板法
常用于相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等的計數。
利用特定的____________或 ______________在________下觀察、計數，然后再計算 __________的樣品中微生物的數量；
①原理：
細菌計數板
血細胞計數板
顯微鏡
一定體積
②優點：
③缺點：
快速、直觀
①不能區分死菌和活菌→偏大
②不適于對運動細菌的計數。
③個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察。
臺盼藍染液染色，可以通過統計無色細胞的個數來對活菌進行計數。
——直接計數法
（三）微生物的數量測定
2.顯微鏡直接計數法
對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。
計數區
放大后的計數室
④計數方法：
每毫升原液所含細菌數＝
每小格平均細菌數×400×10000×稀釋倍數
（三）微生物的數量測定
2.顯微鏡直接計數法
——直接計數法
項目 顯微鏡直接計數法 稀釋涂布平板法
主要用具 顯微鏡、_____________ 　　　　　　 等 培養基等
計數依據 菌株本身 培養基上的　 　數
優點 計數方便、操作簡單 計數的都是活菌
缺點 死菌、活菌都計數在內 操作復雜、有一定誤差
計算公式 每毫升原液含菌株數＝ 每小格平均菌株數×400×104×稀釋倍數
血細胞計數板
或細菌計數板
菌落
（三）微生物的數量測定
每克樣品中的菌株數＝
兩種計數方法
知識總結
1、選擇培養基的類型
類型 條件 分離得到的菌種
改變培養條件 70～80 ℃的高溫 水生棲熱菌
添加某種化學物質 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
高濃度食鹽 金黃色葡萄球菌
特殊碳源、氮源 石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
營養缺陷 不加碳源 自養型微生物
不加氮源 固氮菌
平板劃線法 稀釋涂布平板法
主要步驟
接種工具
單菌落的獲得
用途
培養結果
相同點 接種環在固體培養基表面連續劃線
等比稀釋操作和涂布平板操作
接種環
涂布器
從最后劃線的區域挑取
稀釋度合適，整個平板上都可找到單菌落
分離純化菌種，獲得單菌落
①分離純化菌種，獲得單菌落②用于計數
都能將微生物分散到固體培養基表面，以獲得單細胞菌落，達到分離純化微生物的目的，也可用于觀察菌落特征
平板劃線法不能達到對細菌進行計數的目的，因為平板劃線法最開始的劃線很可能菌類會長成一片，導致無法計數，此外灼燒接種環的時候也會殺死一部分菌類。
稀釋涂布平板法會進行等比稀釋，在合適的稀釋倍數下，
均勻涂布得到的菌落互不接觸，可以確定菌類的密度，再通過計算可以得知原液的菌落數。
2、兩種純培養方法比較
跟蹤訓練
1.(2023·廣東，10)研究者擬從堆肥中取樣并篩選能高效降解羽毛、蹄角等廢棄物中角蛋白的嗜熱菌。根據堆肥溫度變化曲線(如圖)和選擇培養基篩選原理來判斷，下列最可能篩選到目標菌的條件組合是
A.a點時取樣、尿素氮源培養基
B.b點時取樣、角蛋白氮源培養基
C.b點時取樣、蛋白胨氮源培養基
D.c點時取樣、角蛋白氮源培養基
√
研究目的是篩選能高效降解羽毛、蹄角等廢棄物中角蛋白的嗜熱菌，因此目標菌既要耐高溫，又要能夠高效降解角蛋白，所以應在c點取樣，并且用角蛋白氮源培養基進行選擇培養，D正確。
跟蹤訓練
跟蹤訓練
√
2.如圖是純化微生物時采用的兩種接種方法接種后培養的效果圖，下列相關敘述正確的是
A.圖甲三個平板中所用培養液的稀釋倍數相同
B.圖甲、乙均適合分離微生物，但乙不適合對微生物進行計數
C.圖甲、圖乙所用的接種工具分別是接種環和涂布器
D.圖乙每次劃線應從同一起點開始以便使聚集的菌種逐步稀釋獲得單菌落
跟蹤訓練
根據圖甲中三個平板的菌落密度可知，三個平板中所用培養液的稀釋倍數不同，A錯誤；
圖甲、乙中若均為選擇
培養基，均可用于分離
微生物，圖乙是平板劃線法接種后的結果，不適合對微生物進行計數，B正確；
稀釋涂布平板法接種工具為涂布器，平板劃線法接種工具為接種環，C錯誤；
圖乙每次劃線應從上一次劃線的末端開始，以便使聚集的菌種逐步稀釋獲得單菌落，D錯誤。
視頻示范
土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
1.提出問題：
（1）土壤中含有能分解尿素的細菌，我們如何分離它們？
（2）每克土壤樣品究竟含有多少這樣的細菌？
利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養基，可以分離。
2.做出假設：
3.實驗原理：
土壤
取樣
制備
培養基
樣品稀釋
與取樣涂布
微生物的
培養與觀察
菌落計數
4.實驗步驟：
絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的選擇培養基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。
常見的分解尿素的微生物：芽孢桿菌、小球菌、棒狀桿菌等細菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。
（一）實驗設計
（1）無菌操作：
（2）做好標記：
（3）規劃時間：
本實驗使用的平板和試管較多，為避免混淆，最好在使用前做好標記。
對于耗時較長的生物實驗，需要事先規劃時間，以便提高實驗效率，在操作時有條不紊。
如
在標記培養皿時應該注明組別、培養日期和平板上培養樣品的稀釋度等。
取土樣的用具在使用前都需要滅菌。
（二）操作提示
（三）實驗過程
土壤取樣
制備培養基
樣品稀釋
與取樣涂布
微生物的
培養與觀察
菌落計數
①土壤要求：酸堿度接近中性且潮濕。
②取樣部位：距地表約3～8 cm的土壤層。
制備以尿素為唯一氮源的選擇培養基。
制備牛肉膏蛋白胨培養基
測土壤中細菌數量，一般選用1x104 、1x105 和1x106倍的稀釋液進行平板培養。
不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數在30～300、適于計數的平板。
測細菌數：一般用104、105、106稀釋液
測放線菌：一般用103、104、105稀釋液
測真菌數：一般用102、103、104稀釋液
（三）實驗過程
土壤取樣
制備培養基
樣品稀釋
與取樣涂布
微生物的
培養與觀察
菌落計數
測土壤中細菌數量，一般選用1x104 、1x105 和1x106倍的稀釋液進行平板培養。
在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數？
選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養，以保證能從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數
（三）實驗過程
土壤取樣
制備培養基
樣品稀釋
與取樣涂布
微生物的
培養與觀察
菌落計數
①每個濃度至少設置4個平板，1、2、3平板是選擇培養基（實驗組，三個重復），4為牛肉膏蛋白胨培養基
（用以判斷選擇培養基是否具有選擇作用）
若牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數目大于選擇培養基上的數目，則說明選擇培養基具有篩選作用。
（三）實驗過程
土壤取樣
制備培養基
樣品稀釋
與取樣涂布
微生物的
培養與觀察
菌落計數
②如何驗證培養基中是否含有雜菌？
設置2個平板作為對照：
不涂布稀釋液的選擇培養基和牛肉膏蛋白胨培養基。
若對照的培養基中無菌落生長，則說明未被雜菌污染。
（三）實驗過程
土壤取樣
制備培養基
樣品稀釋
與取樣涂布
微生物的
培養與觀察
菌落計數
土壤中分解尿素的細菌的分離、計數與鑒定
任務2
案例：兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數。從對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下兩種統計結果。
1.甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統計的菌落數為230。
2.乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統計的菌落數分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數的平均值163作為統計結果。
你認為這兩位同學的做法正確嗎？ 如果有問題，錯在哪？ 如何改進？
甲：沒有重復實驗（至少涂布3個平板）。為增加實驗的說服力與準確性，應設置重復實驗，在同一稀釋度下至少涂布3個平板，統計結果后計算平均值。
乙：其中一個平板計數結果與其他兩個相差太大，操作過程可能出現了錯誤。微生物計數時，如果實驗中出現重復實驗的結果差別很大的情況，應分析實驗過程中可能的影響因素，找出差異的原因，而不能簡單地將結果舍棄后進行計數。
土壤中分解尿素的細菌的分離、計數與鑒定
任務2
3.嘗試完成表中對微生物的分離與計數實驗結果的分析。
目的 現象 結論
是否有雜菌污染的判斷 ____________________________ 未被雜菌污染
培養物中菌落形態多樣，菌落數偏高 培養物中混入其他雜菌
選擇培養基是否起篩選作用 牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數目______選擇培養基上的數目 選擇培養基具有篩選作用
對照組的培養基中無菌落生長
大于
①培養：
②觀察：
根據不同微生物的需要，控制適宜的培養溫度和培養時間。細菌一般在30～37 ℃的溫度下培養1～2 d。
a．觀察方法：每隔24 h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養時間不足而遺漏部分菌落。
b．記錄菌落的特征：
包括菌落的形狀、大小和顏色等。
得到的菌落一定是分解尿素的細菌嗎？
不一定都是能分解尿素的微生物；因為有些微生物可以利用能分解尿素的細菌的代謝物進行生長繁殖。
（三）實驗過程
土壤取樣
制備培養基
樣品稀釋
與取樣涂布
微生物的
培養與觀察
菌落計數
在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑。培養某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養基堿性增強→ 酚紅變紅→脲酶陽性
①液體培養基可以直接看液體的變色情況；
②固體培養基上可以觀察菌落周圍是否出現紅色環帶，紅色環帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強。
鑒定培養基
土壤中分解尿素的細菌的鑒定
鑒定培養基
在培養基中加入某種指示劑或化學藥品(不影響微生物正常生長)，使微生物的某種代謝產物與培養基中的特定指示劑或化學藥品發生反應。從而達到鑒定的作用。
伊紅和美藍培養基鑒別大腸桿菌
剛果紅培養基鑒別纖維素分解菌
項目 選擇培養基 鑒別培養基
原理
用途
舉例
圖示
加入不影響甚至促進目標微生物生長，而抑制或阻止其他種類微生物生長的化學物質
加入某種指示劑或化學藥品(不影響微生物正常生長)，使微生物的某種代謝產物與培養基中的特定指示劑或化學藥品發生反應
培養、分離出目標微生物
鑒別不同的微生物
培養酵母菌和霉菌，可在培養基中加入青霉素，抑制細菌生長；用以尿素作為唯一氮源的培養基來培養尿素分解菌
可用伊紅—亞甲藍瓊脂培養基鑒定飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，菌落呈深紫色，并有金屬光澤)
跟蹤訓練
3.下列關于“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”實驗操作的敘述，不正確的是
A.利用稀釋涂布平板法準確估計菌落數目的關鍵是有恰當的稀釋度
B.若要判斷選擇培養基是否起到了選擇作用，需要設置未接種的牛肉膏
　蛋白胨培養基作為對照
C.該實驗應采用稀釋涂布平板法
D.用以尿素為唯一氮源且添加了酸堿緩沖劑的培養基來培養該細菌后不
　會使酚紅指示劑變紅
√
跟蹤訓練
利用稀釋涂布平板法估算菌落數目的關鍵是有恰當的稀釋度，若稀釋倍數太低、菌落數目太多，會連在一起，稀釋倍數太高，平板上菌落數目過少，都不宜進行計數，A正確；
若要判斷選擇培養基是否起到了選擇作用，需要設置接種在沒有選擇作用的細菌通用的牛肉膏蛋白胨培養基上培養作為對照，B錯誤；
分解尿素的細菌能合成脲酶，脲酶催化尿素分解產生氨，使培養基的堿性增強，用以尿素為唯一氮源且添加了酸堿緩沖劑的培養基來培養該細菌，能維持pH穩定，不會使酚紅指示劑變紅，D正確。
跟蹤訓練
4.(2023·江蘇連云港高二期末)在做“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”的實驗時，甲同學從對應稀釋倍數為106的培養基上篩選出大約150個菌落，而其他同學只篩選出大約50個菌落。下列有關敘述錯誤的是
A.甲同學出現這種結果的原因可能是土樣不同，也可能是操作過程出了問題
B.將甲同學配制的培養基在不加土樣的情況下進行培養作為空白對照，
　可以證明培養基是否受到污染
C.讓其他同學用與甲同學一樣的土壤進行實驗，如果結果與甲同學一致，
　則可以證明甲同學操作無誤
D.B、C選項的實驗思路都遵循了實驗的對照原則
√
B選項的實驗思路遵循了實驗的對照原則，C選項的實驗思路遵循了實驗的重復原則，D錯誤。
課堂小結
本堂課你學到了哪些知識？畫出概念圖進行總結

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