資源簡介

專題(十三)　基因工程
1．基因工程的基本工具
提醒：兩種不同的限制酶切割不同的DNA片段，產生相同的黏性末端，這兩種限制酶稱為同尾酶。
2．基因工程的基本操作程序
提醒：①目的基因的插入位點不是隨意的，基因表達需要啟動子與終止子的調控，所以目的基因應插入在啟動子與終止子之間。當需要目的基因在特定細胞中表達時，需要利用特定的啟動子，如目的基因要在乳腺細胞中表達時，啟動子要換成乳腺蛋白基因的啟動子。②鑒定目的基因的插入與轉錄，可使用PCR技術或分子雜交技術。
3．蛋白質工程
4．DNA的粗提取與鑒定
5．PCR技術
6．DNA片段的電泳鑒定
提醒：DNA電泳鑒定中的“兩液兩劑”
①電泳緩沖液維持整個電泳體系的pH穩定，提供導電介質，影響物質的電泳遷移率。②凝膠載樣緩沖液(內含指示劑)主要用于樣品的稀釋和保護，同時通過指示劑指示樣品在凝膠中的位置，有助于判斷電泳是否完成，以及何時停止電泳。③核酸染料是用來染色DNA分子的一種化學物質，以便在紫外燈下觀察和檢測核酸條帶。
1．(2024·湖南卷)某同學將質粒DNA進行限制酶酶切時，發現DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是(　　)
A．限制酶失活，更換新的限制酶
B．酶切條件不合適，調整反應條件如溫度和酶的用量等
C．質粒DNA突變導致酶識別位點缺失，更換正常質粒DNA
D．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶
B　[限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應更換新的限制酶，A正確；酶切條件不合適通常會使切割效果下降，調整反應條件如溫度和PH等，調整酶的用量沒有作用，B錯誤；質粒DNA突變會導致限制酶識別位點缺失，進而造成限制酶無法進行切割，此時應更換為正常質粒，C正確；質粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。]
2．(2024·江西卷)γ-氨基丁酸在醫藥等領域有重要的應用價值。利用L-谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脫羧是高效生產γ-氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導入生產菌株E．coliA，構建了以L-谷氨酸鈉為底物高效生產γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列敘述正確的是(　　)
A．上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB
B．E．coliB發酵生產γ-氨基丁酸時，L-谷氨酸鈉的作用是供能
C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質粒
A　[題意顯示，研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導入生產菌株E．coliA，說明可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB，A正確；題意顯示，用L-谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脫羧是高效生產γ-氨基丁酸的重要途徑之一，E．coliB中能表達L-谷氨酸脫羧酶(GadB)，因此可用E．coliB發酵生產γ-氨基丁酸，該過程中L-谷氨酸鈉的作用不是供能，B錯誤；將目的基因(gadB)導入菌株E．coliA構建高效生產γ-氨基丁酸的菌株E．coliB，E．coliA和E．coliB均不能高效降解γ-氨基丁酸，C錯誤；據題中信息無法推斷出是否有其他酶能夠替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質粒，D錯誤。]
3．(2024·山東卷)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是(　　)
A．整個提取過程中可以不使用離心機
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后，應充分搖勻再倒入燒杯中
C．鑒定過程中DNA雙螺旋結構不發生改變
D．僅設置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾
A　[在“DNA的粗提取與鑒定”實驗中，可將獲得的研磨液用紗布過濾后，在4 ℃的冰箱中放置幾分鐘，再取上清液，也可以直接將研磨液用離心機進行離心后取上清液，A正確；研磨液在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后，DNA在上清液中，應取上清液倒入燒杯中，B錯誤；鑒定過程中用沸水浴加熱，DNA雙螺旋結構會發生改變，C錯誤，僅設置一個對照組可以排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾，D錯誤。]
判斷與表達
(1)PCR技術中，提高復性的溫度能有效減少反應非特異條帶的產生。(2021·湖北卷T16) (√)
(2)基因工程中常用噬菌體轉化植物細胞。(2021·遼寧卷T3) (×)
提示：基因工程中常用農桿菌轉化植物細胞。
(3)利用蛋白質工程技術在N0(腈水合酶)的α和β亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩定的融合型腈水合酶(N1)，加入連接肽需要通過改造基因實現。(2021·遼寧卷T14) (√)
(4)粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液中加入與濾液體積相等的、體積分數為95%的冷卻的酒精后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物。(2021·山東卷T13) (×)
提示：向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后在得到的濾液中加入與濾液體積相等的、體積分數為95%的冷卻的酒精，此時DNA析出，不會進入濾液中。
(5)粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后顯藍色。(2023·江蘇卷T9) (×)
提示：粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后經過水浴加熱可顯藍色。
(6)為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對、短單鏈核酸。為使PCR產物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的5′端(填“3′端”或“5′端”)。(2022·山東卷T25)
(7)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。如圖所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是乙、丙。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中擴增出了400 bp片段，原因是目的基因反向連接。(2019·江蘇卷T33)
(8)基因遞送是植物遺傳改良的重要技術之一，農桿菌侵染植物細胞時，可將外源基因遞送到植物細胞中的原因是農桿菌細胞內含有Ti質粒，Ti質粒中的T-DNA能將外源基因遞送到植物細胞中，并與植物細胞的染色體DNA整合到一起。(2023·海南卷T20)
基因工程及其應用
1．(2024·湖北八市聯考)HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。雞卵清蛋白是由輸卵管上皮細胞中卵清蛋白基因特異性表達后分泌至輸卵管內，參與構成雞蛋清的蛋白質。下圖是利用基因工程技術制備HA蛋白雞輸卵管生物反應器的過程。幾種可供選擇的限制酶識別序列如下，下列說法錯誤的是(　　)
A．①為逆轉錄過程，該過程需要逆轉錄酶、4種游離的脫氧核苷酸等組分
B．目的基因與雞卵清蛋白基因啟動子拼接前應先在目的基因兩端分別引入HindⅢ和EcoRⅠ的識別序列
C．利用PCR技術擴增目的基因時，復性溫度偏低、引物特異性差均可導致產物中出現部分非目標序列
D．基因表達載體導入受精雞胚的胚盤可以使用顯微注射法
B　[圖中①以禽流感病毒RNA形成目的基因DNA過程，為逆轉錄過程，需要的酶是逆轉錄酶，逆轉錄合成的是DNA，需要4種脫氧核苷酸作為原料，A正確；目的基因兩端引入BamHⅠ和EcoRⅠ的識別序列，進而使目的基因能夠與雞卵清蛋白基因啟動子、載體正確連接，構建基因表達載體，B錯誤；PCR技術擴增目的基因時，若復性溫度偏低，則可能導致引物與非目的基因序列部分配對，進而擴增出非目標序列，引物特異性差也會導致和非目的基因序列部分配對，導致產物中出現部分非目標序列，C正確；受體細胞為動物細胞時通常采用顯微注射法，因此基因表達載體導入受精雞胚的胚盤可以使用顯微注射法，D正確。]
2．(2024·安徽合肥三模)AK、DHDPS是玉米中合成賴氨酸的兩種關鍵酶，賴氨酸達到一定濃度就會與兩種酶結合抑制它們的活性，如圖所示，因此玉米中賴氨酸含量比較低。將AK中第352位蘇氨酸變成異亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺變成異亮氨酸，該變化影響了其與賴氨酸的結合，使玉米葉片和種子內游離的賴氨酸分別提高5倍和2倍。下列有關分析錯誤的是(　　)
A．玉米中賴氨酸含量比較低與負反饋調節密切相關
B．要替換AK、DHDPS中的氨基酸需要通過改造相應基因來實現
C．改造后的AK和DHDPS與賴氨酸的結合能力增強
D．改造后的AK和DHDPS的空間結構發生改變
C　[由題可知，賴氨酸與AK、DHDPS結合，抑制它們的活性，屬于負反饋調節，A正確；根據題意“將AK中第352位蘇氨酸變成異亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺變成異亮氨酸”可知，該操作為蛋白質工程，蛋白質工程的實質是改造相應基因來實現的，B正確；由題分析可知，將AK中第352位蘇氨酸變成異亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺變成異亮氨酸，會導致改造后的AK和DHDPS的空間結構發生改變，與賴氨酸的結合能力降低，C錯誤，D正確。]
3．(2024·湖南長沙一模)研究人員從分解纖維素的細菌(A菌)中提取出一種纖維素酶基因(CBHⅡ)并進行PCR擴增，然后與高效表達載體pUT質粒(圖1)連接構建成重組質粒并導入A菌，從而獲得分解纖維素能力更強的工程菌(B菌)。請回答下列問題：
限制酶 識別序列及酶切位點
BglⅡ 5′-ATCT-3′
BstEⅡ 5′-TNACC-3′ (N為任意堿基)
SacⅠ 5′-GCTC-3′
MspⅠ 5′-GG-3′
BamHⅠ 5′-ATCC-3′
幾種限制酶識別序列及酶切位點
(1)構建成重組質粒時，應選擇限制酶________________對pUT質粒進行酶切，經酶切后形成了兩個DNA片段(X和Y)，X兩端的黏性末端分別為-CTAG和-CAATG，則Y兩端的黏性末端分別為-CTAG和________。
(2)CBHⅡ基因中無上述限制酶的酶切位點，兩端需添加相關酶切位點才能在酶切后與pUT質粒連接，因此在擴增CBHⅡ基因時，需要在兩種引物的________(填“5′”或“3′”)端分別添加相應限制酶的識別序列。
(3)為鑒定重組質粒是否構建成功以及是否成功導入A菌，將其接種在含抗生素________(填“M”或“N”)的培養基上培養，將3個不同菌落擴大培養后提取質粒分別進行雙酶切并進行電泳，結果如圖3所示(片段過小時檢測不到條帶)。據圖分析，菌落________中成功導入了重組質粒。
(4)為檢測B菌的纖維素分解能力，將含有20%纖維素的培養基分為三組，進行不同處理后，在相同條件下培養一段時間，測定培養基內纖維素含量，結果如圖4所示，對照組2的處理為接種________，說明______________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)需要將目的基因插入高效啟動子之后，至少保留一個標記基因M或N，故選擇BglⅡ、BstEⅡ對質粒進行酶切。根據表格中BstEⅡ識別序列和切割位點，X一端的黏性末端為-CAATG，則Y一端與之互補的為-CATTG。(2)引物是從子鏈的5′端往3′端方向延伸，為了能讓擴增出的目的基因與載體正確連接，則需要在引物的5′端分別添加相應限制酶的識別序列。(3)BstEⅡ和BglⅡ破壞了抗生素M抗性基因，但保留了抗生素N抗性基因，因此為鑒定重組質粒是否構建成功，以及是否成功導入A菌，將其接種在含抗生素N的培養基上培養，圖3為瓊脂糖凝膠電泳圖譜，由CBHⅡ基因大小可知，菌落2和3擴增出了目的基因，說明成功導入了重組質粒。(4)對照組1為空白對照，對照組2應為接種A菌，由柱狀圖長短可知，B菌分解纖維素能力比A菌更強。
[答案]　(1)BglⅡ、BstEⅡ　-CATTG　(2)5′　(3)N　2、3　(4)A菌　B菌分解纖維素能力比A菌更強
基因工程相關的實驗
4．(2024·河北衡水模擬)現用新鮮的加入抗凝劑的雞血來進行DNA的粗提取和鑒定實驗，其過程如圖所示。下列說法錯誤的是(　　)
A．在實驗材料的選擇上，雞血細胞比菜花細胞更容易吸水漲破
B．圖①和圖③中均用到了攪拌，但攪拌的力度和速度均不同
C．圖③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精的原理粗提取DNA
D．圖④甲試管中加入的是清水和二苯胺試劑，沸水浴后不會出現顏色變化
D　[動物細胞沒有細胞壁，因此雞血細胞相對于菜花細胞更容易吸水漲破，A正確；圖①攪拌的目的是加速吸水后的細胞破碎，因此力度和速度較大，圖③攪拌的目的是使析出的DNA纏繞在玻璃棒上，攪拌時力度小、速度緩，B正確；DNA不溶于酒精，細胞中的某些蛋白質可以溶于酒精，利用這一原理可以將蛋白質和DNA進一步分離，C正確；圖④甲試管中加入的是2 mol/L NaCl溶液和二苯胺試劑，沸水浴后不會出現顏色變化，D錯誤。]
5．(2023·山東濰坊三模)下列關于DNA片段的擴增及電泳鑒定實驗的說法，錯誤的是(　　)
A．放入PCR儀前，需要對離心管進行離心，使反應液集中在底部
B．配置瓊脂糖溶液時，需要根據DNA片段的大小調節瓊脂糖濃度
C．電泳時需要的兩種緩沖液分別含有核酸染料和指示劑
D．電泳時，需要根據電泳槽陽極至陰極之間的距離設定電壓
C　[使用PCR技術的具體操作順序：按配方準備好各組分→用微量移液器將各組分依次加入微量離心管中→離心使反應液集中在離心管底部→設計好PCR儀的循環程序→進行PCR反應，因此放入PCR儀前，需要對離心管進行離心，使反應液集中在底部，A正確；PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定，在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關，因此根據DNA片段的大小配制一定質量分數的瓊脂糖溶液以便分離DNA分子，B正確；凝膠載樣緩沖液內含指示劑，瓊脂糖溶液加入核酸染料，電泳緩沖液不含有核酸染料，C錯誤；接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5 V/cm，D正確。]
核心整合練(十三)　基因工程[A卷]
1．(2023·湖北卷)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環素抗性基因(TetR)作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體(重組質粒)，并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是(　　)
A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否
D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養基中能形成菌落
D　[若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉錄的產物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，重組質粒和質粒中都有四環素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝膠電泳技術可以分離不同大小的DNA片段，重組質粒的大小與質粒不同，能夠鑒定重組質粒構建成功與否，C正確；SphⅠ的酶切位點位于四環素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重組質粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養基中能形成菌落，在含Tet的培養基中不能形成菌落，D錯誤。]
2．(2024·安徽合肥三模)科研人員將寒帶地區海魚中的抗凍基因轉入千禧果細胞中，成功培育出抗凍千禧果。下圖為培育過程中使用的Ti質粒示意圖，其中Vir區的基因活化能促進T-DNA的加工和轉移，下列敘述正確的是(　　)
A．構建基因表達載體時，最好選擇限制酶Ⅱ和Ⅲ來切割質粒
B．利用PCR技術擴增抗凍基因，需提前檢測抗凍基因的全部堿基序列
C．Vir區的基因活化可促進抗凍基因整合到千禧果細胞的染色體DNA上
D．利用含卡那霉素的培養基可篩選出成功導入抗凍基因的千禧果細胞
C　[使用限制酶Ⅱ會破壞Vir區的基因，Vir區的基因活化能促進T-DNA的加工和轉移，是T-DNA轉移整合到受體細胞的染色體DNA上必不可少的，不能選擇限制酶Ⅱ，A錯誤；使用PCR技術擴增抗凍基因，只需要知道抗凍基因兩端堿基序列設計引物即可，B錯誤；農桿菌侵染植物細胞后，Ti質粒上的T-DNA能轉移到被侵染的細胞并整合到該細胞的染色體DNA上，所以Vir區的基因活化可促進抗凍基因整合到千禧果細胞的染色體DNA上，C正確；為篩選成功導入抗凍基因的千禧果細胞，最好在培養基中添加四環素，可以篩選成功導入抗凍基因的千禧果細胞，D錯誤。]
3．(2024·河北衡水模擬)翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)是在翻譯水平受到抑制的腫瘤相關蛋白，是一個高度保守且和細胞生長、死亡等功能有關的蛋白。現從果蠅基因組DNA中擴增果蠅dTCTP基因，經限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，插入表達質粒pGEX-4T-2上構建基因表達載體，最終表達有活性的dTCTP融合蛋白。關于該基因表達載體的構建，下列敘述錯誤的是(　　)
A．表達質粒pGEX-4T-2可以用限制酶BamHⅠ和EcoR Ⅰ進行雙酶切
B．dTCTP基因是該項研究中的目的基因
C．除了目的基因和標記基因外，該基因表達載體還必須有啟動子和終止子
D．將dTCTP基因插入表達質粒pGEX-4T-2上時，需要用到DNA聚合酶
D　[dTCTP基因經限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，因此一般需要相同的限制酶切割載體，產生相同的黏性末端，A正確；由題意知，從果蠅基因組DNA中擴增果蠅dTCTP基因，最終獲得dTCTP融合蛋白，故dTCTP基因是該項研究中的目的基因，B正確；基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等，C正確；利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體切口處，構建基因表達載體，D錯誤。]
4．(2024·遼寧丹東二模)利用AI(人工智能)破解蛋白質結構和功能之謎，建立蛋白質數據庫，并在此基礎上進行蛋白質結構設計和優化，會給未來蛋白質工程的發展帶來翻天覆地的變化。關于該技術的實施下列說法錯誤的是(　　)
A．用AI預測新型蛋白質的基因結構應依據中心法則原理
B．可以通過改造或合成基因來獲得AI設計的蛋白質
C．根據設計的某種蛋白質的氨基酸序列推理的基因序列中包含啟動子和終止子
D．用蛋白質的氨基酸序列推測的RNA編碼序列有多種可能，原因是密碼子的簡并
C　[用AI預測新型蛋白質的基因結構依據的原理是中心法則，從蛋白質結構反推出氨基酸序列，再反推出相應的基因序列，A正確；對蛋白質的改造是通過改造或合成基因來完成的，B正確；啟動子和終止子為非編碼區，故由氨基酸序列推理的基因序列中不包含啟動子和終止子，C錯誤；因為一種氨基酸可能對應多種密碼子(密碼子的簡并)，故用蛋白質的氨基酸序列推測的RNA編碼序列有多種可能，D正確。]
5．(2024·安徽卷)下列關于“DNA 粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是(　　)
A．實驗中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低
B．利用DNA和蛋白質在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA
C．DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物
D．將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應，可檢測溶液中是否含有蛋白質雜質
D　[研磨液有利于DNA的溶解，換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低，A正確；DNA不溶于酒精，但細胞中的某些蛋白質溶于酒精，可初步分離DNA，B正確；DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色，二苯胺試劑用于鑒定DNA，D錯誤。]
6．(2024·遼寧沈陽模擬)某實驗小組設計了快速檢測餐飲食品中金黃色葡萄球菌的方法，主要包括無菌采樣、培養基預增菌、煮沸法提取DNA 和實時熒光 PCR技術特異性檢測四個步驟。下列敘述錯誤的是(　　)
A．培養基預增菌可以通過保持營養的穩定供給使所提取的菌株均能正常生長
B．提取DNA時需將金黃色葡萄球菌的培養液放入離心機中離心后采集上清液
C．可根據金黃色葡萄球菌基因組的保守序列設計兩種引物，兩引物的序列不互補
D．為滿足PCR反應的需求，需控制復性溫度及添加 Mg2+以保證DNA的穩定增長
B　[培養基預增菌，目的是增加待測菌的數量，可以通過保持營養的穩定供給使所提取的菌株均能正常生長，A正確；提取DNA時需將金黃色葡萄球菌的培養液放入離心機中進行離心，將上清液去除后對菌體進行采集，B錯誤；兩種引物分別和目的基因的兩端的序列互補，兩引物的序列不互補，C正確；為滿足PCR反應的需求，需控制復性溫度及添加Mg2+以保證DNA的穩定增長，D正確。]
7．(2024·廣東卷)駒形桿菌可合成細菌纖維素(BC)并將其分泌到胞外組裝成膜。作為一種性能優異的生物材料，BC膜應用廣泛。研究者設計了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表達載體，將其轉入駒形桿菌后構建出一株能合成BC膜并可實現光控染色的工程菌株，為新型紡織原料的綠色制造及印染工藝升級提供了新思路(圖一)。
回答下列問題：
(1)研究者優化了培養基的________________(答兩點)等營養條件，并控制環境條件，大規模培養工程菌株后可在氣液界面處獲得BC菌膜(菌體和 BC膜的復合物)。
(2)研究者利用T7噬菌體來源的RNA聚合酶(T7RNAP)及藍光光敏蛋白標簽，構建了一種可被藍光調控的基因表達載體(光控原理見圖二a，載體的部分結構見圖二b)。構建載體時，選用了通用型啟動子PBAD(被工程菌RNA聚合酶識別)和特異型啟動子PT7(僅被T7RNAP識別)。為實現藍光控制染色，啟動子①②及③依次為________________，理由是_____________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)光控表達載體攜帶大觀霉素(抗生素)抗性基因。長時間培養時在培養液中加入大觀霉素，其作用為____________________________________________________
_____________________________________________________________________(答兩點)。
(4)根據預設的圖案用藍光照射已長出的BC菌膜并繼續培養一段時間，隨后將其轉至染色池處理，發現只有經藍光照射的區域被染成黑色，其原因是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(5)有企業希望生產其他顏色圖案的BC膜。按照上述菌株的構建模式提出一個簡單思路：___________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)培養基的營養物質包括水、無機鹽、碳源、氮源等，研究者培養工程菌，需要優化培養基的碳源、氮源等營養條件，并控制環境條件。(2)據題圖二a分析可知，藍光照射下，T7RNAP N端-nMag與pMag-T7RNAP C端結合，導致無活性的T7RNAP變成有活性的T7RNAP，結合圖一，藍光處理后，RNA聚合酶(T7RNAP)識別啟動子①使基因1轉錄獲得相應的mRNA，再以其為模板通過翻譯過程獲得酪氨酸酶，酪氨酸酶從而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可見基因2和3正常表達無活性產物，被藍光激活后再啟動基因1表達，綜合上述分析可知，為實現藍光控制染色，啟動子①②及③依次為PT7、PBAD和PBAD。(3)光控表達載體攜帶大觀霉素(抗生素)抗性基因。長時間培養時在培養液中加入大觀霉素，其具有抑制雜菌、去除丟失質粒的菌株的作用。(4)由(2)分析可知，細胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表達并合成黑色素，故用藍光照射已長出的BC菌膜并繼續培養一段時間，隨后將其轉至染色池處理，發現只有經藍光照射的區域被染成黑色。(5)由(2)分析可知，題干信息的設計思路最終BC膜被染成黑色，希望生產其他顏色圖案的BC膜，則需要將酪氨酸酶替換成催化其他色素合成的酶。
[答案]　(1)碳源、氮源　(2)PT7、PBAD和PBAD　基因2和3正常表達無活性產物，被藍光激活后再啟動基因1表達　(3)抑制雜菌；去除丟失質粒的菌株　(4)該處細胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表達并合成黑色素　(5)將酪氨酸酶替換成催化其他色素合成的酶
8．(2024·河北卷)新城疫病毒可引起家禽急性敗血性傳染病，我國科學家將該病毒相關基因改造為r2HN，使其在水稻胚乳特異表達，制備獲得r2HN疫苗，并對其免疫效果進行了檢測。
回答下列問題：
(1)實驗所用載體的部分結構及其限制酶識別位點如圖1所示。其中GtP為啟動子，若使r2HN僅在水稻胚乳表達，GtP應為________________啟動子。Nos為終止子，其作用為______________________。r2HN基因內部不含載體的限制酶識別位點。因此，可選擇限制酶________和________對r2HN基因與載體進行酶切，用于表達載體的構建。
(2)利用________方法將r2HN基因導入水稻愈傷組織。為檢測r2HN表達情況，可通過PCR技術檢測________________，通過________技術檢測是否翻譯出r2HN蛋白。
(3)獲得轉基因植株后，通常選擇單一位點插入目的基因的植株進行研究。此類植株自交一代后，r2HN純合體植株的占比為________。選擇純合體進行后續研究的原因是___________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)制備r2HN疫苗后，為研究其免疫效果，對實驗組雞進行接種，對照組注射疫苗溶劑。檢測兩組雞體內抗新城疫病毒抗體水平和特異應答的CD8＋T細胞(細胞毒性T細胞)水平，結果如圖2所示。據此分析，獲得的r2HN疫苗能夠成功激活雞的________免疫和________免疫。
(5)利用水稻作為生物反應器生產r2HN疫苗的優點是_______________________
____________________________________________________________________________________________________________________________。(答出兩點即可)
[解析]　(1)若使r2HN僅在水稻胚乳表達，則Gtp應為在胚乳中特異性表達的啟動子。Nos為終止子，終止子可以終止轉錄。r2HN基因內部不含載體的限制酶識別位點。KpnⅠ破壞了啟動子序列不能選用，SacⅠ位于終止子序列之外不能選用，則為了將目的基因插入載體的啟動子和終止子之間，則需要用限制酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ對r2HN基因與載體進行酶切，用于表達載體的構建。(2)獲得水稻愈傷組織后，通過農桿菌的侵染，使目的基因進入水稻細胞并完成轉化。為檢測r2HN表達情況，可通過PCR技術檢測r2HN的mRNA，可從轉基因水稻中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原—抗體雜交檢測是否翻譯出r2HN蛋白。(3)獲得轉基因植株后，通常選擇單一位點插入目的基因的植株進行研究。單一位點插入目的基因的植株相當于雜合子，雜合子自交，后代含有r2HN基因的純合子為1/4。由于純合體自交后代不發生性狀分離，具有遺傳的穩定性，所以選擇純合體進行后續研究。(4)據圖可知，實驗組的抗體水平和CD8＋T細胞水平都比對照組高，說明通過體液免疫產生了抗體，通過細胞免疫產生了細胞毒性T細胞，即r2HN疫苗能夠成功激活雞的體液免疫和細胞免疫。(5)通過水稻作為生物反應器生產r2HN疫苗具有不受性別的限制、可大量種植、成本低、安全性高等優點。
[答案]　(1)在胚乳中特異性表達的　終止轉錄　Hind Ⅲ　EcoRⅠ　(2)農桿菌轉化　r2HN的mRNA　抗原—抗體雜交　(3)1/4　純合體自交后代不發生性狀分離　(4)體液　細胞　(5)不受性別的限制、可大量種植、成本低、安全性高
9．(2024·湖北荊州三模)磷脂酸(PA)是調節植物生長發育和逆境響應的重要信使物質。為了解植物細胞中PA的動態變化，研究人員用無縫克隆技術將高度專一的PA結合蛋白(PABD)基因與綠色熒光蛋白(GFP)基因融合，構建有效監測細胞PA變化的熒光探針，并測定擬南芥細胞內PA含量。無縫克隆技術連接DNA片段的機理和構建熒光探針表達載體的過程如下圖。請回答下列問題：
注：bar為草胺膦抗性基因；Kanr為卡那霉素抗性基因。
(1)無縫克隆時，T5核酸外切酶沿________(填“5′→3′”或“3′→5′”)的方向水解DNA，形成黏性末端。T5核酸外切酶催化的最適溫度為37 ℃，而過程①選擇的溫度為50 ℃，目的是______________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)過程②兩個片段復性后存在“缺口”，因此過程③所需的酶有_____________
_____________________________________________________________________。
(3)PCR技術中通常要設計引物，引物的作用是_____________________________
_________________________，有時需要在引物的一端增加限制酶的酶切位點，目的通常是______________________________。PCR擴增PABD基因時需依據PABD基因一端的核苷酸序列和載體一端的核苷酸序列設計引物R1。據圖分析擴增目的基因片段時，所用的引物F1和R2可對應下表中的________(填序號)。
① 5′-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3′
② 5′-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTA- ACTAGTCTTAGTGGCGTC-3′
③ 5′-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATG- GTGAGCAAGGGCGA-3′
④ 5′-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTG- TACAGCTCGTCCA-3′
(4)利用農桿菌花序侵染法轉化擬南芥，將獲得的種子進行表面消毒，均勻鋪在含________的MS培養基上進行篩選和鑒定，將篩選得到的種子種植，可得到轉基因擬南芥，通過觀測轉基因擬南芥根尖細胞中__________________，了解PA的分布和含量。
[解析]　(1)由圖可知，無縫克隆時，過程①中T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，以形成黏性末端。溫度能影響酶活性，T5核酸外切酶催化的最適溫度為37 ℃，而過程①選擇的溫度為50 ℃，目的是降低酶活性，防止過度水解DNA。(2)過程②在復性的過程中，兩個片段的黏性末端可根據互補序列進行配對結合，但由于過程①形成的黏性末端大于互補配對的區段(同源序列)，因此在過程②復性后存在“缺口”。過程③缺口處DNA鏈的補齊可以看作DNA分子的復制過程，所需的酶有DNA聚合酶(DNA聚合酶將游離的單個脫氧核苷酸加到子鏈3′末端)和DNA連接酶(將兩個DNA片段進行連接)。(3) PCR技術中通常要設計引物，引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，有時需要在引物的一端增加限制酶的酶切位點，目的通常是便于目的基因與載體連接。用于PCR擴增的引物是根據一段已知目的基因(PABD基因)的核苷酸序列來設計的，由圖可知，PABD基因(目的基因)需要用載體進行連接，因此PCR擴增PABD基因時需依據PABD基因一端的核苷酸序列和載體一端的核苷酸序列設計引物R1。由重組DNA可知，GFP基因和PABD基因進行連接，PCR擴增GFP基因時需根據GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列設計引物R2，而設計引物F1僅需根據PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的堿基序列比引物R2的堿基序列短，因此擴增目的基因片段的引物F1對應于表中的①。PCR擴增GFP基因時需根據GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列設計引物R2，即引物R2的一部分能與引物F1進行堿基互補配對，綜上所述，R2對應于表中的④。(4)由圖可知，bar(草胺膦抗性基因)為標記基因，位于T-DNA上，農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞的染色體DNA上，因此利用農桿菌花序侵染法轉化擬南芥，將獲得的種子進行表面消毒，均勻鋪在含草胺膦的MS培養基上進行篩選和鑒定。由題意“將高度專一的PA結合蛋白(PABD)基因與綠色熒光蛋白(GFP)基因融合，構建有效監測細胞PA變化的熒光探針，并測定擬南芥細胞內PA含量”可知，通過觀測轉基因擬南芥根尖細胞中綠色熒光點的分布，了解PA的分布和含量。
[答案]　(1)5′→3′　降低酶活性，防止過度水解DNA　(2)DNA聚合酶和DNA連接酶　(3)使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸　便于目的基因與載體連接　①④　(4)草胺膦　綠色熒光點的分布
(教師用書獨具)
(2024·湖北武漢二模)水中物質污染會導致魚類雌性化異常。將綠色熒光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等轉入斑馬魚，可用于監測水體E物質，下圖中ERE和UAS是兩種誘導型啟動子，分別被E物質—受體復合物和Gal4蛋白特異性激活，啟動下游基因表達。下列敘述錯誤的是(　　)
A．根據題意可知斑馬魚的某些細胞存在E物質的受體
B．用ERE直接驅動GFP基因表達可提高監測的靈敏度
C．用于監測E物質污染的轉基因斑馬魚最好是不育的
D．基因表達載體最好以顯微注射法導入斑馬魚受精卵
B　[將綠色熒光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等轉入斑馬魚，可用于監測水體E物質，推測斑馬魚的某些細胞存在E物質的受體，A正確；結合題圖，ERE誘導Gal4轉錄，其翻譯產物Gal4蛋白與UAS結合驅動GFP基因表達可提高監測的靈敏度，這是一個間接驅動而非直接驅動的過程，B錯誤；用于監測E物質污染的轉基因斑馬魚最好是不育的，避免因有性生殖帶來的基因污染，C正確；基因表達載體最好以顯微注射法導入斑馬魚受精卵，受精卵全能性高，基因成功表達的概率大，D正確。]
核心整合練(十三)　基因工程[B卷]
1．(2023·廣東卷)“DNA的粗提取與鑒定”實驗的基本過程是：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是(　　)
A．裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質
B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質等
C．沉淀：可反復多次以提高DNA的純度
D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現藍色
D　[裂解的目的是使細胞破裂，釋放出DNA等物質，A正確；粗提取的DNA通過分離，可以去除混合物中的多糖、蛋白質等，B正確；根據DNA和蛋白質等雜質的溶解度差異，可以反復多次沉淀來提高DNA的純度，C正確；將DNA溶解于NaCl溶液，加入二苯胺試劑，混合均勻后，沸水中加熱五分鐘，待冷卻后，能呈現藍色，D錯誤。]
2．(2024·浙江杭州模擬)某二倍體動物種群有100個個體，其常染色體上某基因有A1、A2、A3三個等位基因。對這些個體的基因A1、A2、A3進行PCR擴增，凝膠電泳及統計結果如圖所示。該種群中A3的基因頻率是(　　)
A．52%　　 B．27%　　
C．32%　　 D．2%
B　[據圖可知，該動物種群中基因型為A3A3的有2個，A2A2的有8個，A1A1的有9個，A1A3的有15個，A1A2的有31個，A2A3的有35個，A3的基因數為2×2＋15＋35＝54，則種群中A3的基因頻率為54÷200×100%＝27%，B正確，A、C、D錯誤。]
3．(2024·湖北武漢一模)人乳鐵蛋白(hLF)是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結合糖蛋白，具有抑菌、抗腫瘤等多種生理功能，被認為是一種極具開發潛力的食品添加劑。某科研團隊將人乳鐵蛋白(hLF)基因轉入到山羊體內，從山羊的乳汁中獲得hLF，可以解決天然乳鐵蛋白資源短缺的問題，下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．可用PCR直接擴增人乳鐵蛋白的基因轉錄產物
B．重組載體中人乳鐵蛋白基因的啟動子是山羊乳腺蛋白基因啟動子
C．將目的基因導入山羊受精卵中一般應用的技術是顯微注射法
D．檢測人乳鐵蛋白基因是否成功翻譯常采用抗原—抗體雜交技術
A　[不可以直接用PCR擴增mRNA，需將mRNA逆轉錄成cDNA再進行擴增，A錯誤；為保證在供體山羊的乳汁中提取到人乳鐵蛋白，需要將人乳鐵蛋白基因與山羊乳腺蛋白基因的啟動子等調控元件重組在一起，B正確；一般用顯微注射法將目的基因導入山羊受精卵中，C正確；為檢測人乳鐵蛋白基因是否成功翻譯成蛋白質，檢測方法是從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原—抗體雜交，若出現相應現象，則表明目的基因已翻譯形成蛋白質，D正確。]
4．(2024·廣東廣州模擬)紫色西紅柿經基因編輯后可產生比普通西紅柿多9倍的花青素(紫色)。紫色花青素能降低人類患心臟病、糖尿病的風險。如圖是花青素基因(S)的cDNA(某種生物發育某個時期的mRNA經逆轉錄產生的互補DNA)和Ti質粒圖。下列敘述錯誤的是(　　)
A．由圖可知，最好選用XbaⅠ、Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti質粒
B．在用農桿菌侵染時，常要使用一些抗生素，其目的一是抑制農桿菌生長，二是篩選轉化細胞
C．用于擴增 S基因的引物需滿足的條件是兩種引物分別與兩條模板鏈 3′端的堿基序列互補配對
D．若檢測出標記基因所表達的性狀，則說明重組質粒已經成功導入西紅柿細胞
D　[由圖可知，最好選用XbaⅠ、 Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti質粒，既能保證目的基因與載體產生相同的黏性末端，又不破壞目的基因，A正確；在用農桿菌侵染時，既要讓農桿菌Ti質粒上的T-DNA整合到植物細胞的染色體DNA上，又要避免農桿菌的大量繁殖，因此培養基中通常加入抗生素，B正確；用于擴增S基因的引物需滿足的條件是兩種引物分別與兩條模板鏈3′端的堿基序列互補配對，以保證子鏈從5′端向3′端延伸，C正確；若檢測出目的基因所表達的性狀，則說明重組質粒已經成功導入西紅柿細胞，D錯誤。]
5．(2024·湖北黃石一模)如圖所示，研究人員將雪花蓮凝集素基因(GNA)和尾穗莧凝集素基因(ACA)與載體(pBI121)結合，然后導入棉花細胞。下列操作不符合實驗目的是(　　)
A．用PCR技術可檢測GNA和ACA基因是否導入棉花細胞中
B．將棉花細胞接種在含氨芐青霉素的培養基上可篩選出轉基因細胞
C．用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA-ACA融合基因
D．與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉錄方向正確
B　[根據GNA-ACA融合基因的兩端序列設計合適的引物，可以利用PCR技術檢測GNA和ACA基因是否導入棉花細胞中，A正確；由于重組質粒含有卡那霉素抗性基因，故將棉花細胞接種在含卡那霉素的培養基上可篩選出轉基因細胞，B錯誤；雪花蓮凝集素基因(GNA)和尾穗莧凝集素基因(ACA)均有BsaBⅠ酶切位點，所以用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA-ACA融合基因，C正確；圖中質粒與GNA-ACA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位點，與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉錄方向正確，D正確。]
6．(2024·北京昌平期末)科研人員在常規PCR基礎上發展出同時檢測多種病原體的多重PCR技術，檢測原理(a、b)及結果(c)如下圖。下列敘述錯誤的是(　　)
A．需要針對不同病原體設計特異性引物和熒光探針
B．圖中b是PCR反應的復性過程
C．多重PCR同時完成對4種病原體的檢測
D．由結果推測該檢測樣品中有A病原體的核酸
B　[不同的病原體的堿基序列是不同的，因此需要根據病原體的堿基序列設計不同的特異性引物和熒光探針，A正確；圖中b是PCR反應的延伸過程，該過程中發生合成子鏈的過程，B錯誤；科研人員在常規PCR基礎上發展出同時檢測多種病原體的多重PCR技術，由圖c可知，多重PCR同時完成對(A、B、C、D)4種病原體的檢測，實驗組中B、C、D的剩余探針熒光強度與陰性對照組相似，說明該檢測樣品中沒有B、C、D病原體的核酸，實驗組中A的剩余探針熒光強度與陰性對照組不同，說明該檢測樣品中有A病原體的核酸，C、D正確。]
7．(2023·遼寧卷)天然β-淀粉酶大多耐熱性差，不利于工業化應用。我國學者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并將改造的基因與pLN23質粒重組后導入大腸桿菌，最終獲得耐高溫的β-淀粉酶。回答下列問題：
(1)上述過程屬于________工程。
(2)PCR中使用的聚合酶屬于________(填寫編號)。
①以DNA為模板的RNA聚合酶
②以RNA為模板的RNA聚合酶
③以DNA為模板的DNA聚合酶
④以RNA為模板的DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484個氨基酸構成，研究發現，將該酶第476位天冬氨酸替換為天冬酰胺，耐熱性明顯提升。在圖1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替換堿基的引物是________(填寫編號)。
(4)為了使上述改造后的基因能在大腸桿菌中高效表達，由圖2所示的pLN23質粒構建得到基因表達載體。除圖示信息外，基因表達載體中還應該有目的基因(即改造后的基因)和________。
(5)目的基因(不含EcoRⅠ酶切位點)全長為1.5 kb，將其插入BamHⅠ位點。用EcoRⅠ酶切來自不同大腸桿菌菌落的質粒DNA，經瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段長度，這一操作的目的是____________________。正確連接的基因表達載體被EcoRⅠ酶切后長度為________kb。
(6)采用PCR還能在分子水平上確定目的基因是否轉錄，根據中心法則，可通過________反應獲得PCR的模板。
[解析]　(1)根據蛋白質的功能改變基因的結構，最終獲得耐高溫的β-淀粉酶，這屬于蛋白質工程。(2)PCR的原理是DNA雙鏈復制，使用的聚合酶是以DNA為模板的熱穩定的DNA聚合酶。(3)根據β-淀粉酶的編碼序列，替換的堿基在編碼序列中，則利用的引物應該把編碼序列全部擴增在內，則所用的引物是②③。含已替換堿基的引物是②。(4)作為基因工程載體的質粒應該包含：復制原點、限制酶的切割位點、標記基因、啟動子和終止子，根據圖示的表達載體可知，應還要包括目的基因和標記基因。(5)目的基因通過表達載體導入大腸桿菌中，大腸桿菌菌落的質粒DNA，經瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段長度，這一操作的目的是篩選出導入目的基因的大腸桿菌。正確連接的基因表達載體只有一個EcoRⅠ酶切位點，則切割后的長度為4.2＋1.5＝5.7 kb。(6)轉錄是以DNA為模板合成RNA的過程，通過PCR在分子水平上確定目的基因是否轉錄，則需要以RNA為模板逆轉錄出cDNA作為PCR反應的模板。
[答案]　(1)蛋白質　(2)③　(3)②　(4)標記基因　(5)篩選導入目的基因的大腸桿菌　5.7　(6)逆轉錄
8．(2024·廣東佛山二模)瘦素是一種由脂肪組織合成和分泌的肽類激素。P載體含有的綠色熒光蛋白(GFP)基因能在真核細胞中表達GFP。將目的基因插入GFP基因后，能表達出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根據熒光的強弱，可確定目的基因在細胞內的表達情況。為研究瘦素的功能，科學家構建了瘦素基因真核表達載體，檢測瘦素基因在小鼠成纖維細胞中的表達情況。瘦素基因及P載體的結構如圖所示。回答下列問題。
(1)PCR擴增瘦素基因時，與引物1互補的a鏈左側是脫氧核苷酸鏈的________(填“5′”或“3′”)端。據圖推測，構建該基因表達載體時，P載體上應有啟動子、終止子、標記基因、復制原點、________________________，以便與酶切后的瘦素基因正確連接。
(2)已知Hind Ⅲ和BamHⅠ在P載體上的切割位點非常接近。為確定重組質粒是否構建成功，用Hind Ⅲ、BamHⅠ分別對瘦素基因PCR產物、P載體和重組質粒雙酶切，再進行電泳，結果如圖所示。若重組質粒構建成功，請在圖中將酶切結果對應位置的條帶涂黑。
(3)Kanr/Neor是一種抗性基因，在真核細胞中表達具有新霉素抗性，而在原核細胞中表達具有卡那霉素抗性。同種基因在真核、原核細胞中表達結果不同，可能的原因是_____________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
本實驗中為篩選轉化的細胞，應在培養基中添加________。
(4)為檢測瘦素基因是否成功表達，可用的鑒定方法是_____________________(答出2種)。為進一步獲得更多能表達融合蛋白的細胞，還需要進行________________。
[解析]　(1)引物的作用是使DNA聚合酶從引物的3′端連接脫氧核苷酸，因此引物1左側為5′端，DNA分子是由兩條反向平行的脫氧核苷酸鏈組成，因此與引物1互補的a鏈左側是脫氧核苷酸鏈的3′端。構建該基因表達載體時，P載體上應有啟動子、終止子、標記基因、復制原點、Hind Ⅲ和BamHⅠ切割位點，以便于酶切后的瘦素基因正確連接。(2)由于Hind Ⅲ和BamHⅠ在P載體上的切割位點非常接近，因此用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ對P載體進行切割后，會形成一個大片段，接近4 700 bp，一個超小片段可忽略，即對P載體酶切產物電泳后，只出現接近4 700 bp的條帶，若重組質粒構建成功，重組載體上會攜帶瘦素基因，用Hind Ⅲ、BamHⅠ對重組質粒切割后，會出現兩個片段，一個是瘦素基因，一個是接近4 700 bp的片段，則電泳結果會出現兩個條帶，如圖所示：
(3)Kanr/Neor抗性基因在真核與原核細胞中有不同的啟動子或轉錄后的加工不同或翻譯后的加工不同，因此同種基因在真核、原核細胞中表達結果不同。本實驗中受體細胞為小鼠成纖維細胞，為真核細胞，則Kanr/Neor在真核細胞中表達具有新霉素抗性，為篩選轉化的細胞，應在培養基中添加新霉素，能存活的細胞為導入重組質粒的受體細胞。(4)瘦素基因表達產物為蛋白質，因此可以用抗原—抗體雜交技術檢測瘦素基因是否成功表達，同時目的基因插入GFP基因后，能表達出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根據熒光的強弱，可確定目的基因在細胞內的表達情況，即可以檢測綠色熒光的強弱。為進一步獲得更多能表達融合蛋白的細胞，還需要進行動物細胞培養。
[答案]　(1)3′　Hind Ⅲ和BamHⅠ切割位點　(2)
(3)Kanr/Neor抗性基因在真核與原核細胞中有不同的啟動子(或轉錄后的加工不同或翻譯后的加工不同)　新霉素　(4)抗原—抗體雜交技術、檢測綠色熒光強弱　動物細胞培養
9．(2024·湖北宜昌一模)科研人員構建了可表達WRK10-MYC 融合蛋白的重組農桿菌Ti質粒并成功轉化植物細胞得到轉基因植株，該質粒的部分結構如圖1所示，其中Kan為卡那霉素抗性基因，Hyg為潮霉素抗性基因，MYC標簽序列編碼標簽短肽MYC，WRK10蛋白為轉錄因子，可與圖2中PIF4基因啟動子某區段結合并激活該基因的轉錄。
(1)將重組農桿菌Ti質粒導入農桿菌時，需用Ca2+處理農桿菌，其目的是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)將農桿菌浸泡過的植物愈傷組織進行植物組織培養，培養基中需加入________________(填“潮霉素”“卡那霉素”或“潮霉素和卡那霉素”)進行篩選。
(3)已知利用LP和RP擴增結果為大帶，BP和RP擴增結果為小帶。可用圖中三種引物進行兩次PCR擴增和________________方法鑒定轉基因植物后代中的純合轉基因植株，PCR擴增時加入dNTP的目的是________________，其中BP引物和________鏈對應堿基序列相似。T-DNA插入植物染色體DNA 分子后會抑制原插入位點兩側引物的擴增產物的出現，則純合轉基因植株PCR產物的檢測結果為________(填“大帶”“小帶”或“大帶和小帶”)。
(4)為了探究WRK10蛋白與PIF4基因啟動子結合的具體區段(如圖2所示)，科研工作者利用短肽MYC抗體處理了對應的基因表達產物，后經一系列過程，得到圖3所示的結果，由此推測轉基因植株體內WRK10蛋白激活PIF4基因的表達的機制是___________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
MYC標簽序列編碼的標簽短肽MYC的作用是____________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)Ca2+處理農桿菌的目的是使農桿菌細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，以便后續將基因表達載體導入受體細胞。(2)卡那霉素抗性基因在啟動子與終止子以外，無法表達，因此將農桿菌浸泡過的植物愈傷組織進行植物組織培養，培養基中需加入潮霉素進行篩選。(3)PCR擴增結果需要用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，加入dNTP的目的是提供原料和能量，BP和RP擴增結果為小帶，BP引物和b 鏈結合，因此BP引物和a鏈對應堿基序列相似。如圖， BP位點在T-DNA片段上，又因為T-DNA插入植物染色體DNA分子后會抑制原插入位點兩側引物的擴增產物的出現，故純合轉基因植株PCR檢測結果為BP和RP擴增的小帶。(4)由實驗結果分析，紅光下處理時， MYC抗體陽性組PIF4基因表達量很高，推測轉基因植株體內WRK10蛋白激活PIF4基因的表達的機制是紅光條件下WRK10蛋白(轉錄因子)與PIF4基因啟動子的W12區段結合，從而激活該基因的表達。 MYC標簽序列編碼的標簽短肽MYC的作用是與MYC抗體結合，便于對WRK10蛋白表達的檢測、示蹤。
[答案]　(1)使農桿菌細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態　(2)潮霉素　(3)瓊脂糖凝膠電泳　提供原料和能量　a　小帶　(4)紅光條件下WRK10蛋白能夠結合PIF4基因啟動子的W12區段　與 MYC抗體結合，便于檢測、示蹤WRK10基因有無表達
(教師用書獨具)
(2023·浙江6月卷)某研究小組利用轉基因技術，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設計了引物1和引物2用于PCR擴增，PCR產物電泳結果如圖乙所示。
下列敘述正確的是(　　)
A．Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因的表達
B．翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子
D．若用引物1和引物3進行PCR，能更好地區分雜合子和純合子
B　[分析圖甲可知，啟動子在左側，Gata3-GFP基因在右側，啟動子啟動轉錄后，可以使GFP基因轉錄，Gata3基因的啟動子能控制GFP基因的表達，A錯誤；因啟動子在左側，轉錄的方向為從左向右，合成的mRNA從左向右為5′→3′，剛好是翻譯的方向，所以翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；整合GFP基因后，核酸片段變長，2號個體只有大片段，所以是Gata3-GFP基因純合子，4號個體只有小片段，是野生型，C錯誤；用引物1和引物3進行PCR擴增，不能區分雜合子和純合子，D錯誤。]
熱點拓展一　同尾酶
1．同尾酶定義
同尾酶，即能切割產生相同末端的限制酶，一般是指能產生相同黏性末端的限制酶。所有平末端酶產生的末端均是相同的，但一般不把它作為同尾酶來研究。同尾酶是不同的酶，它們只是切割DNA產生的末端相同，同尾酶之間的識別序列可以相同也可以不同，但基因工程中識別序列不同的同尾酶的應用性最大。在構建基因表達載體的過程中，若選擇的某種限制酶會破壞目的基因或質粒的重要片段時，可嘗試使用該酶的同尾酶進行切割。
2．同尾酶作用特點
同尾酶產生的黏性末端雖然可以像完全親和的黏性末端那樣進行連接，但是它與完全親和的黏性末端連接不同的是，連接后的產物往往失去原有的限制性內切核酸酶的切點，但是，少數情況下，也有能被某一種同尾酶識別并切割。例如，由BamHⅠ和Sau3AⅠ識別和切割序列分別是5′-ATCC-3′和5′ATC-3′，切割重組后，不能被BamHⅠ識別和切割，但仍能被Sau3AⅠ識別和切割。
這樣用同尾酶進行體外重組時，在限制酶切割反應之后不必將原有的限制酶失活，就可直接進行重組連接。由于連接體系中原有的限制酶的存在，從而保證了載體同外源DNA的連接。所以在這種連接反應中不必用堿性磷酸酶進行載體的脫磷酸反應而得到最高的連接效率，即不需要將5′端突出的磷酸基團消化掉，使質粒載體自身不能形成閉合的環狀結構。
(2024·湖南雅禮中學模擬)像BclⅠ(-ATCA-)、BglⅡ(-ATCT-)、MboⅠ(ATC-)這樣，識別序列不同，但能產生相同的黏性末端的一類限制酶被稱為同尾酶。如圖表示目的基因及質粒上的酶切位點。選用不同的限制酶對質粒和目的基因進行切割，并用DNA連接酶進行連接。下列分析錯誤的是(　　)
選項 切割質粒 切割目的基因 結果分析
A BclⅠ和 BglⅡ BclⅠ和 BglⅡ 形成的重組質粒的堿基排列順序不一定相同
B BclⅠ和 BglⅡ MboⅠ 切割后的質粒不可自我環化，切割后的目的基因可以自我環化
C MboⅠ BclⅠ和 BglⅡ 形成的重組質粒可被MboⅠ再次切開，但可能無法被BclⅠ和BglⅡ再次切開
D MboⅠ MboⅠ 切割后的質粒可以自我環化，切割后的目的基因也可以自我環化
B　[切割質粒和切割目的基因均用BclⅠ和BglⅡ，由于兩種酶切割后產生的黏性末端相同，形成重組質粒時目的基因可能反向連接，形成的堿基排列順序不一定相同，A正確。切割質粒用BclⅠ和BglⅡ，切割后產生的黏性末端相同，切割后的質粒可能自我環化；切割目的基因用MboⅠ，切割后產生黏性末端，切割后的目的基因可以自我環化，B錯誤。切割質粒用MboⅠ，產生黏性末端，切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ，產生黏性末端，形成的重組質粒中原來的BclⅠ和BglⅡ的切割位點的序列可能發生改變，不能再被這兩種酶切割，但不影響MboⅠ的作用，C正確。切割質粒用MboⅠ，切割目的基因用MboⅠ，產生的均為黏性末端，切割后的質粒可自我環化，切割后的目的基因也可以自我環化，D正確。]
熱點拓展二　啟動子與轉錄調控
1．啟動子的類型
啟動子是RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特異性結合和轉錄起始所需的保守序列，多數位于結構基因轉錄起始點的上游，啟動子本身不被轉錄。
啟動子對轉錄起始有調節和控制作用，決定著基因表達過程的起始以及在什么條件下開始。
參照轉錄調控模式，啟動子又可以分：
(1)組成型啟動子，該類啟動子能夠調控結構基因的表達基本恒定在一定程度上，在不同部位或組織表達水平差異不明顯。
(2)組織特異型啟動子，該類啟動子的調控作用使得基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，且表現出發育調節的特性。如構建乳腺生物反應器使用的即為乳腺細胞中特異表達基因的啟動子。
(3)誘導型啟動子，即在某些特定的物理或化學信號刺激后，基因轉錄水平在該類型啟動子調控下大幅度地提升。目前已經分離了眾多啟動子如熱誘導表達基因、光誘導表達基因、創傷誘導表達基因、真菌誘導表達基因和共生細菌誘導表達基因啟動子等。
2．啟動子位置及轉錄模板鏈的判斷
基于圖1中的信息能否判斷啟動子位置及轉錄模板鏈？答案是否定的，若要對轉錄情況做出準確判斷，必須要明確以下三個要素：
(1)鏈方向
(2)鏈性質(編碼鏈或模板鏈)
(3)功能區域(啟動子或終止子)
確定其中2個要素即可確定第3個要素。
舉例分析如下：
①基于圖2中模板鏈①及其方向，判斷啟動子的位置。
由于轉錄產生的RNA新鏈的合成方向為5′→3′，轉錄過程的發生是從啟動子到終止子，則推導出非編碼區2為啟動子。
②基于圖3中啟動子位置及DNA鏈的方向，判斷模板鏈位置。
轉錄過程的發生是從啟動子到終止子，轉錄產生的RNA新鏈的合成方向為5′→3′，且與模板鏈反向平行，推導出②為該基因的模板鏈。
③基于圖4中的模板鏈(①)及啟動子位置，判斷DNA鏈的方向。
轉錄過程的發生是從啟動子到終止子，轉錄出來的mRNA的5′端位于左側，3′端位于右側，由于①為模板鏈，其與轉錄產生的mRNA互補，且反向平行，所以①的方向從左至右為3′→5′，②的方向從左至右為5′→3′。
(2023·山東卷)科研人員構建了可表達J-V5融合蛋白的重組質粒并進行了檢測，該質粒的部分結構如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。
(1)與圖甲中啟動子結合的酶是______________。除圖甲中標出的結構外，作為載體，質粒還需具備的結構有____________________________________(答出2個結構即可)。
(2)構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物________。已知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的________(填“a鏈”或“b鏈”)相應部分的序列相同。
(3)重組質粒在受體細胞內正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應蛋白是否表達以及表達水平，結果如圖乙所示。其中，出現條帶1證明細胞內表達了______________，條帶2所檢出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重組質粒上的J基因表達的。
[解析]　(1)基因表達載體的構建中啟動子是為了啟動下游基因的“表達”，表達首先需要轉錄，因此RNA聚合酶識別和結合的部位才是轉錄的起始。作為載體，質粒還需具備的結構有限制酶的切割位點、標記基因、復制原點等。(2)用PCR擴增分析法確定重組質粒中目的基因插入方向是否正確時，常設計一對引物，一個引物與目的基因序列互補，另一個引物與質粒序列互補，兩引物延伸方向相反，以擴增出兩引物間的序列，若插入方向正確，則可擴增出相應序列，反之，則不能擴增出相應序列，故選用的引物應為F2和R1(或F1和R2)，若選用引物F1和R1，不論目的基因插入方向是否正確，都可擴增出目的基因序列。因為J基因的b鏈為轉錄的模板鏈，啟動子在左側，所以轉錄方向為從左到右，由于轉錄沿模板鏈3′到5′端方向合成RNA，所以J基因b鏈左側為3′端，引物要與DNA的3′端互補配對，所以F1與b鏈互補，a鏈也與b鏈互補，由此推知引物F1與a鏈相應部分序列相同。(3)抗J蛋白抗體和抗V5抗體均能檢測到條帶1，說明條帶1為J-V5融合蛋白，條帶2僅能由抗J蛋白抗體檢測到，說明該蛋白僅含J蛋白，不含V5標簽，故條帶2檢出的蛋白不是由重組質粒上的J基因表達的。
[答案]　(1)RNA聚合酶　限制酶的切割位點、標記基因、復制原點等　 (2)F2和R1(或F1和R2)　a鏈　(3)J-V5融合蛋白　不是
熱點拓展三　Southern印跡雜交
Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的方法。其原理為利用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈 DNA片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上，經干烤或者紫外線照射固定，再與相對應結構的放射性同位素標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。Southern印跡雜交實驗可以幫助研究人員檢測特定DNA序列的存在和數量，可應用于基因表達研究、基因組學、醫學診斷等領域。
實驗操作步驟如下：
一、DNA樣品準備：從組織或細胞中提取基因組DNA，使用一種或多種限制酶對基因組DNA進行切割，將其消化成大小不同的片段。
二、DNA電泳分離：制備瓊脂糖凝膠，在恒定電壓下，將切割后的DNA片段上樣至瓊脂糖凝膠中，進行電泳分離。電泳時間根據DNA片段的大小和凝膠濃度而定，以確保DNA片段按分子量大小在凝膠中形成清晰的條帶。
三、DNA變性和轉膜：將電泳后的凝膠浸泡在變性溶液中(如0.25 mol/L HCl和堿性溶液)，使DNA變性并斷裂成單鏈片段。將變性后的凝膠上的DNA片段轉移到固相支持物上，如硝酸纖維素膜或尼龍膜。在轉膜過程中，需要保持DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置一致。
四、DNA固定：將載有DNA片段的膜進行固定處理，以防止DNA在后續步驟中脫落。常用的固定方法有紫外線照射或干烤等。
五、探針標記與雜交：使用同位素(如放射性同位素)或非同位素(如地高辛)標記方法制備特異性探針。將固定好的膜置于預雜交液中，將標記好的探針加入預雜交液中，與膜上的DNA片段進行雜交反應。
六、洗膜與檢測：洗去未與DNA片段結合的游離探針。根據探針的標記方法選擇合適的檢測方法。對于放射性同位素標記的探針，通常采用放射自顯影進行檢測；對于非同位素標記的探針，則可以使用相應的顯色系統(如地高辛特異抗體檢測系統)進行檢測。
(2024·湖南常德模擬)Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。其基本方法是利用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至硝酸纖維素膜上并固定，再與放射性標記的探針進行雜交，利用放射自顯影檢測特定DNA分子。根據信息判斷，下列說法中錯誤的是(　　)
A．限制酶消化DNA片段時破壞了相鄰兩個核苷酸分子之間的磷酸二酯鍵
B．轉移至硝酸纖維素膜上的DNA片段中有2個游離的磷酸基團
C．標記探針與硝酸纖維素膜上的DNA分子部分堿基序列互補
D．可用Southern印跡雜交法從基因組文庫中獲取目的基因
B　[限制酶切割DNA分子內部核苷酸分子之間的磷酸二酯鍵，A正確；轉移至硝酸纖維素膜上的 DNA片段是單鏈DNA分子，其中有1 個游離的磷酸基團，B錯誤；核酸探針通過氫鍵與待檢測基因片段進行連接，進行堿基互補配對，C正確；放射性標記的探針進行雜交，利用放射自顯影檢測特定DNA分子，可用 Southern印跡雜交法從基因組文庫中獲取目的基因，D正確。]
熱點拓展四　PCR技術拓展
1．實時熒光定量RT-PCR技術檢測病毒核酸
病毒感染的常規檢測方法是通過實時熒光PCR鑒定。實時熒光PCR擴增目的基因，需額外添加熒光標記探針(一小段單鏈DNA，可與目的基因中部序列特異性結合)。當探針完整時，不產生熒光。在PCR過程中，與目的基因結合的探針被耐高溫的DNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發出的熒光可被檢測到(如圖甲)，通過實時熒光PCR檢測某冠狀病毒感染時，檢測到的熒光強度變化如圖乙，熒光到達預先設定閾值的循環數(Ct值)越小，說明病毒核酸濃度越高。
2．PCR定點突變——重疊延伸PCR技術
重疊延伸PCR技術其主要設計思路是用具有互補配對片段的引物(圖中的引物2和3，突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點)，分別進行PCR，獲得有重疊鏈的兩種DNA片段，再在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因。如某科研團隊運用重疊延伸PCR技術在水蛭素基因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖：
3．PCR定點突變——大引物PCR技術
大引物PCR需要用到三條引物進行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規上游引物和常規下游引物。第一輪PCR利用突變上游引物和常規下游引物進行擴增，得到不完整的含有突變位點的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴增產物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規上游引物一起擴增得到完整的含有突變位點的DNA片段。原理如圖。
4．反向PCR擴增已知序列兩側的未知序列
當DNA的某些序列已知，而需要擴增已知序列兩端的未知序列時，可采用反向PCR技術。原理：用限制酶消化該DNA，隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產物環化，這樣就獲得了已知序列兩側攜帶有未知序列的環狀DNA分子。以該已知序列為模板設計一對相反方向的特異性引物，該引物對已知序列反向，但對未知序列卻是相向的，從而得以擴增出未知序列。原理如圖。
5．巢式PCR
首先將目標的DNA模板與第一套引物(外引物)結合。第一套引物也可能結合到其他具有相似結合位點的片段上并擴增多種產物。但只有一種產物是目的片段(圖中未顯示可能的多種產物)。然后使用第二套引物(內引物)對第一輪PCR擴增的產物進行第二輪PCR擴增。由于第二套引物位于第一輪PCR產物內部，而非目的片段包含兩套引物結合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片段。這種巢式PCR擴增確保第二輪PCR產物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。原理如圖。
1．(2024·黑龍江大慶模擬)常規PCR只能擴增兩引物間的DNA區段，要擴增已知DNA序列兩側的未知DNA序列，可用反向PCR技術。反向PCR技術擴增的原理如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A．酶切階段，L中不能含有酶切時所選限制酶的識別序列
B．環化階段，可選E．coli DNA連接酶而不能選T4 DNA連接酶
C．應選擇引物2和引物3進行PCR，且二者之間不能互補配對
D．PCR擴增，每輪循環前應加入限制酶將環狀DNA切割成線狀
A　[在酶切階段，已知序列L中不能含有酶切時所選限制酶的識別序列，不然會將已知序列L切斷，造成序列識別混亂，A正確；T4 DNA連接酶或E．coli DNA連接酶都可以用來連接黏性末端，因此環化階段，可選用E．coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶，B錯誤；PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3′端通過堿基互補配對結合，為保證延伸的是已知序列兩側的未知序列，應該選擇引物1和引物4，且二者之間不能互補配對，C錯誤；PCR的擴增只需要第一次循環前加入足夠的限制酶，并不需要每輪都加入，D錯誤。]
2．(2024·廣東湛江二模)研究發現，若將第52位的脯氨酸(密碼子為CCA)替換成蘇氨酸(密碼子為ACA)，則可增強抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分堿基序列及可供選擇的引物如圖1所示，箭頭下方的數字代表堿基序號。現利用重疊延伸PCR技術對抗菌肽基因進行改造以獲得抑菌性更強的抗菌肽，過程如圖2所示，其中Ⅰ為轉錄模板鏈，引物上的“”代表突變位點。改造過程中PCR2所使用的引物組合為(　　)
A．引物1和引物4
B．引物2和引物6
C．引物2和引物4
D．引物3和引物5
B　[題圖可知，利用重疊延伸PCR技術對DNA分子進行定點突變的過程中，通過PCR2獲得產物CD時所用的引物組合為引物c、d。引物d與轉錄模板鏈的3′端結合，因此引物d的序列為5′GTCACGTG，引物2符合該序列。現要利用重疊延伸PCR技術對抗菌肽基因進行改造以獲得抑菌性更強的抗菌肽，則需要將第52位的脯氨酸替換成蘇氨酸。根據兩種氨基酸的密碼子可知，需要將mRNA上的第154號堿基由C替換為A，則需要將DNA非轉錄模板鏈上對應部分的堿基由C 替換為A。因此引物c的堿基序列為5′CCTGTTAT，引物6符合該序列。綜上所述，B符合題意，A、C、D不符合題意。]
熱點拓展五　基因組編輯技術
1．寡核苷酸介導的定點突變
寡核苷酸是一類只有20個以下堿基的短鏈核苷酸的總稱，利用寡核苷酸可以實現不依賴PCR的定點突變。
(1)首先人工合成一段含有特定突變位點的單鏈寡核苷酸片段(除突變位點外，該片段的其他部分可以與目的基因互補配對)。
(2)然后將該寡核苷酸片段與帶有目的基因的單鏈載體(通常由M13噬菌體衍生而來，內有一個環狀單鏈DNA分子)進行雜交。
(3)繼而在DNA聚合酶和DNA連接酶的作用下分別進行DNA鏈的合成和連接反應，得到含有突變位點的雙鏈載體。
(4)最后將雙鏈載體引入宿主細胞復制，并進行篩選和鑒定。
2．CRISPR/Cas9系統
CRISPR/Cas系統是細菌和古菌在長期演化過程中形成的一種免疫系統，用來抵抗外源遺傳物質的入侵，為它們提供獲得性免疫。CRISPR/Cas系統可以識別出外源DNA，并將它們切斷，沉默外源基因的表達。正是由于這種精確的靶向功能，CRISPR/Cas系統已被開發成一種高效的基因組編輯工具。其中最常見的是CRISPR/Cas9基因編輯技術。
(1)系統構成：向導RNA＋限制性內切核酸酶Cas9。由具有核酸內切酶功能的Cas9蛋白和一條人為重組的一段目的基因的單鏈向導RNA(SgRNA)組成，向導RNA可以指導Cas9蛋白對靶基因進行敲除、插入和突變修飾。
(2)編輯原理：向導RNA能與基因組DNA中特定堿基序列通過堿基互補配對結合在一起，引導Cas9到特定的基因位點進行切割；通過設計向導RNA中的20個堿基的識別序列，可人為選擇DNA上的目標位點進行切割。根據CRISPR/Cas9精準攻擊外源DNA的工作原理，就可以實現基因敲除。如果在此基礎上為細胞引入一個修復的模板質粒(供體DNA分子)，就可以實現基因的定點突變。
3．重疊延伸PCR技術、大引物PCR技術(見熱點拓展四)
1．定點突變技術是按照預定設計，對某個已知基因的特定堿基進行定點增刪或轉換，最終改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構。其中一種方法是利用寡核苷酸鏈介導的定點突變，過程如圖所示。下列關于利用寡核苷酸鏈介導的定點突變技術的敘述，錯誤的是(　　)
A．該技術的原理是基因發生堿基對的替換
B．過程①需要模板、原料、能量、酶等基本條件
C．過程②以寡核苷酸鏈延伸后的單鏈為模板
D．過程①②均遵循堿基互補配對原則
A　[定點突變改變特定位點的核苷酸，先是誘變寡核苷酸引物上的堿基對發生替換、增添或缺失，隨后經過延伸和復制，產生新的突變基因，A錯誤；該延伸過程屬于DNA復制過程，需要模板、原料、能量、酶等基本條件，B正確；題圖顯示過程②為以寡核苷酸鏈延伸后的單鏈為模板合成互補DNA鏈的過程，C正確；延伸過程遵循堿基互補配對的原則，需要DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸，D正確。]
2．(2021·海南卷)CRISPR/Cas9是一種高效的基因編輯技術，Cas9基因表達的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在單鏈向導RNA(SgRNA)引導下，切割DNA雙鏈以敲除目標基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因編輯技術的工作原理如圖所示。
回答下列問題。
(1)過程①中，為構建CRISPR/Cas9重組質粒，需對含有特定SgRNA編碼序列的DNA進行酶切處理，然后將其插入經相同酶切處理過的質粒上，插入時所需要的酶是____________________。
(2)過程②中，將重組質粒導入大腸桿菌細胞的方法是_______________________。
(3)過程③～⑤中，SgRNA與Cas9蛋白形成復合體，該復合體中的SgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結合，二者結合所遵循的原則是________________________。隨后，Cas9蛋白可切割__________序列。
(4)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除一個長度為1 200 bp的基因，在DNA水平上判斷基因敲除是否成功所采用的方法是________________，基因敲除成功的判斷依據是_________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(5)某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人員將該蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9質粒中獲得重組質粒，隨后將其導入大腸桿菌細胞，通過基因編輯把該蛋白酶基因插入基因組DNA中，構建得到能大量分泌該蛋白酶的工程菌。據圖簡述CRISPR/Cas9重組質粒在受體細胞內，將該蛋白酶基因插入基因組DNA的編輯過程：_____________________________________________________
__________________________________________________________________________________________________________________________________________。
[解析]　(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA連接酶，限制酶負責切割，DNA連接酶負責連接，因此為構建CRISPR/Cas9重組質粒，需對含有特定SgRNA編碼序列的DNA進行酶切處理，然后將其插入經相同酶切處理過的質粒上，插入時所需要的酶是DNA連接酶。(2)大腸桿菌是原核生物，屬于微生物，將目的基因導入微生物細胞的方法是Ca2+處理法。(3)根據題圖可知，在CRISPR/Cas9基因編輯技術中，SgRNA是根據靶基因設計的向導RNA，準確引導Cas9切割與SgRNA配對的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子與目標DNA進行特異性結合的原因在于SgRNA分子上的堿基序列與目標DNA分子上的堿基序列可以通過堿基互補配對原則實現SgRNA與目標DNA特定序列的特定識別，進而定位；由此可見，Cas9在功能上屬于限制酶，可切割目標DNA特定的核苷酸序列。(4)可利用DNA分子雜交技術判斷基因敲除是否成功，即利用經編輯過的DNA片段(從受體細胞中提取的基因組DNA)與標記的目標(對應)基因(探針)雜交，若無雜交帶，則敲除成功。(5)根據圖示可知，CRISPR/Cas9重組質粒在受體細胞內進行轉錄和表達，轉錄的產物是SgRNA，表達的產物是Cas9蛋白，二者形成復合體，該復合體中的SgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結合，引導Cas9蛋白切割目標DNA序列。
[答案]　(1)DNA連接酶　(2)Ca2+處理法　(3)堿基互補配對　目標(目的)DNA(基因)　(4)DNA分子雜交技術　經編輯過的DNA片段(從受體細胞中提取的基因組DNA)與標記的目標(對應)基因(探針)雜交，若無雜交帶，則敲除成功　(5)表達的Cas9蛋白和SgRNA，兩者形成復合體，SgRNA識別并結合目標DNA序列，引導Cas9蛋白切割目標DNA序列
熱點拓展練(十三)　基因工程
1．(2024·山東煙臺期中)同尾酶是指一組識別序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。下圖為EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅠ和MboⅠ四種限制酶的識別序列及酶切位點。下列說法正確的是(　　)
A．BamHⅠ、BglⅠ、MboⅠ屬于同尾酶，它們的識別序列相同
B．使用同尾酶構建基因表達載體時，切割位點的選擇范圍擴大
C．選用兩種不同的限制酶切割目的基因，可以防止目的基因自身的環化
D．用DNA連接酶將BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端連接后，可被二者重新切開
B　[BamHⅠ、BglⅠ、MboⅠ識別序列不同，但切出的黏性末端相同，屬于同尾酶，A錯誤；使用同尾酶構建基因表達載體時，切割位點的選擇范圍擴大，不同的酶也能切割出相同的黏性末端，B正確；圖中BamHⅠ、BglⅠ、MboⅠ識別序列不同，但切出的黏性末端相同，故選用兩種不同的限制酶切割目的基因，不一定可以防止目的基因自身的環化，C錯誤；用DNA連接酶將BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端連接后，不可被二者重新切開，D錯誤。]
2．(2024·浙江杭州二模)某研究小組構建了能表達ACTA1-GFP融合蛋白的重組質粒，該重組質粒的部分結構如下圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物。
A．RNA聚合酶與啟動子結合，調控ACTA1基因和GFP基因的表達
B．僅用F2和R1一對引物，即可確定ACTA1基因插入方向是否正確
C．ACTA1基因轉錄的模板鏈是a鏈，引物F1與a鏈的部分序列相同
D．若用引物F2和R2進行PCR，能更好地區分ACTA1-GFP基因純合子和雜合子
C　[據圖可知，ACTA1基因和GFP基因位于啟動子和終止子之間，故RNA聚合酶與啟動子結合，調控ACTA1基因和GFP基因的表達，A正確；僅用F2和R1一對引物，即可確定ACTA1基因插入方向是否正確，B正確；ACTA1基因轉錄的模板鏈是a鏈，引物F1與b鏈均可以和a鏈互補配對，因此引物F1與b鏈的部分序列相同，C錯誤；若用引物F2和R2進行PCR，能更好地區分ACTA1-GFP基因純合子和雜合子，D正確。]
3．(2024·江蘇鹽城模擬)常見的啟動子可分為三類：組成型啟動子，驅動基因在所有細胞、組織和器官中持續表達；組織特異型啟動子，調控基因只在某些特定的部位中表達；誘導型啟動子，通常在光、鹽等信號作用下，使目的基因的轉錄水平有所提高。下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．細胞分化與組織特異型啟動子的調控和組成型啟動子均有關
B．膀胱生物反應器的構建需要將目的基因連接在誘導型啟動子的下游
C．真核生物細胞中，一般一個啟動子只能啟動一個基因的轉錄
D．強啟動子可使基因高水平表達，啟動子的強弱主要取決于其與RNA聚合酶的親和性
B　[根據題干信息“組成型啟動子，驅動基因在所有細胞、組織和器官中持續表達；組織特異型啟動子，調控基因只在某些特定的部位中表達”可知，細胞分化與組織特異型啟動子的調控和組成型啟動子均有關，A正確；組織特異型啟動子，調控基因只在某些特定的部位中表達，因此膀胱生物反應器的構建需要將目的基因連接在組織特異型啟動子的下游，導入細胞中，保證基因在膀胱細胞中表達，B錯誤；一般情況下，真核生物細胞中，一個啟動子只能啟動一個基因的轉錄，C正確；強啟動子可使基因高水平表達，啟動子的強弱主要取決于其與RNA聚合酶的親和性，從而啟動基因的轉錄，D正確。]
4．(2024·四川綿陽期中)研究人員利用農桿菌侵染水稻葉片，經植物組織培養、篩選最終獲得了一株水稻突變體，現欲檢測該突變體是否由T-DNA插入所致。如圖是利用不同的限制酶處理突變體的總DNA，經電泳、核酸分子雜交的放射性自顯影結果，并與野生型和Ti質粒做對比(注：T-DNA上沒有所用限制酶的酶切位點)，對該實驗的分析錯誤的是(　　)
A．檢測結果時使用了放射性標記的T-DNA片段做探針
B．不同酶切顯示的雜交帶位置不同，說明T-DNA有不同的插入位置
C．實驗結果證明該突變體核DNA中插入了T-DNA
D．若野生型也出現雜交帶，則實驗樣本可能被污染，檢測結果不準確
B　[圖示結果突變體中出現放射性，說明使用了放射性標記的T-DNA片段做探針對目的基因進行檢測，A正確；不同酶切雜交帶位置不同，說明不同酶切后帶有T-DNA的片段長度不同(即不同的酶切位點距離T-DNA的遠近不同)，B錯誤；該突變體產生的根本原因是T-DNA攜帶目的基因插入水稻細胞的染色體DNA上，C正確；由圖所示放射性檢測結果可知，野生型無放射性雜交帶，若野生型也出現雜交帶，則實驗樣本可能被污染，檢測結果不準確，D正確。]
5．(2024·四川綿陽期中)巢式PCR是指先后用外、內引物擴增獲得目的基因的方法。其原理為先以比目的基因大的DNA片段為模板，用外引物(F1，R1)進行擴增，獲得大量含目的基因的中間產物，再以擴增后的中間產物為模板，用內引物(F2，R2)擴增目的基因，如圖所示。下列說法錯誤的是(　　)
A．兩對引物的堿基序列不相同，但均應為單鏈DNA片段
B．第二輪PCR反應能否進行，是對第一輪PCR反應正確性的鑒定
C．由于和兩套引物都互補的靶序列較少，該技術可大大提高擴增的特異性
D．如果兩套引物一起加入反應體系中，外引物的復性溫度應顯著低于內引物
D　[兩對引物的堿基序列不相同，但均應為單鏈DNA片段，以便與模板互補配對，A正確；第二輪PCR使內側引物以第一輪PCR產物為模板進行再次擴增，第二輪PCR反應能否進行，是對第一輪PCR反應正確性的鑒定，B正確；由于和兩套引物同時都互補的靶序列較少，該技術可大大提高擴增的特異性 ，將需要的目的基因擴增出來，C正確；如果兩套引物一起加入反應體系中，外引物復性溫度要明顯高于內引物，使外引物先進行反應，D錯誤。]
6．(2024·福建漳州一模)基因定點突變的目的是通過定向改變基因內一個或少數幾個堿基來改變多肽鏈上一個或幾個氨基酸。大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR反應即可獲得，第一輪加誘變引物和側翼引物，第一輪產物作為第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
A．第一輪PCR過程中復性所用的溫度應低于第二輪PCR復性的溫度
B．PCR擴增的定點誘變產物需具備啟動子、終止子等結構才能進行轉錄和翻譯
C．第一輪PCR的產物的兩條DNA鏈作為第二輪PCR所用的引物
D．將某蛋白第21位的組氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，屬于蛋白質工程
C　[為了使兩輪PCR反應在同一支試管中進行，引物設計時應考慮不同的復性溫度，第一輪PCR過程中復性所用的溫度應低于第二輪PCR復性的溫度，A正確；若要使得目的基因可以表達出蛋白質，則需要在產物上具備啟動子和終止子，誘導基因轉錄和翻譯，B正確；據圖分析可知，除第一輪產物作為第二輪PCR擴增的大引物外，第二輪PCR仍需加入的引物是另一種側翼引物，以便進行另一條鏈的延伸，C錯誤；將某蛋白質第21位的組氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)的過程屬于蛋白質工程，D正確。]
7．(2024·山東德州二模)CRISPR/Cas9基因編輯技術能對基因進行定點編輯，其原理如圖1所示。科研人員根據豬的細胞表面抗原基因RAG1的啟動子設計了SgRNA1和SgRNA2，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得了兩種基因敲除豬，檢測基因敲除豬體內的RAG1基因表達情況如圖2所示。下列說法錯誤的是(　　)
A．CRISPR/Cas9識別目標DNA序列主要與SgRNA序列的特異性相關
B．基因敲除豬的細胞表面抗原減少，器官移植過程中免疫排斥作用減弱
C．兩種SgRNA都可引導Cas9在轉錄水平上減弱RAG1基因的表達
D．據圖2可知，用SgRNA2制備的基因敲除豬用于器官移植效果更好
D　[CRISPR/Cas9識別目標DNA序列主要與SgRNA編碼序列有關，即主要與SgRNA序列的特異性相關，A正確；豬的細胞表面抗原會導致器官移植時發生免疫排斥，基因敲除豬的細胞表面抗原減少，器官移植過程中免疫排斥作用減弱，提高器官移植的成功率，B正確；兩種SgRNA都可引導Cas9在轉錄水平上減弱RAG1基因的表達，C正確；據圖2可知，與對照組相比，用SgRNA1制備的基因敲除豬RAG1基因表達量更低，說明用SgRNA1制備的基因敲除豬用于器官移植效果更好，D錯誤。]
8．(2024·山東濟寧模擬)干擾素是在病毒感染后機體免疫細胞產生的一種具有干擾病毒復制作用的糖蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤等作用。科研人員利用大腸桿菌構建干擾素工程菌，下圖是部分單鏈DNA序列，回答下列問題：
(1)從相應細胞中提取mRNA后，在________酶的作用下獲得cDNA。也可以直接從細胞中粗提取DNA，DNA不溶于酒精，但溶于________mol/L的NaCl溶液。
(2)通過PCR技術擴增干擾素基因時，所需引物序列的前9個核苷酸為______________和______________，所需的酶為________________。
(3)構建基因表達載體時，需要選擇合適的啟動子，其作用是__________________
__________________________。若目的基因以圖中單鏈為轉錄模板鏈，啟動子應該與目的基因的________(填“左側”或“右側”)連接。
(4)使用一種限制酶切割目的基因和載體后，會存在目的基因的正向或反向兩種連接產物，________(填“可以”或“不可以”)通過電泳來區分兩種產物，在凝膠中DNA分子的遷移速率與________________________________(列舉兩點)等有關。
[解析]　(1)mRNA在逆轉錄酶的作用下獲得cDNA；DNA溶于2 mol/L的NaCl溶液。(2)由于子鏈合成的方向是由子鏈的5′端向3′端延伸，引物選擇如箭頭所示
根據堿基互補配對原則，引物為5′-GGTCAACAA-3′和5′-TAAACTTCA-3′。PCR需要耐高溫的DNA聚合酶。(3)啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段，能被RNA聚合酶識別并結合，驅動基因轉錄。若目的基因以圖中單鏈為轉錄模板鏈，且轉錄時mRNA自身的延伸方向為5′→3′，即轉錄是從DNA鏈的3′端開始，故啟動子應該與目的基因的右側連接。(4)瓊脂糖凝膠電泳可對DNA分子大小進行鑒定，凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關，目的基因的正向或反向兩種連接產物分子大小一致，無法通過電泳區分。
[答案]　(1)逆轉錄　2　(2)5′-GGTCAACAA-3′　5′-TAAACTTCA-3′　耐高溫的DNA聚合酶　(3)RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄　右側　(4)不可以　凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象
9．(2023·江蘇卷)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術構建質粒，如圖1所示。請回答下列問題：
(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有____________，擴增程序中最主要的不同是________。
(2)有關基因序列如圖2。引物F2-F、F1-R應在下列選項中選用________。
A．ATGGTG……CAACCA
B．TGGTTG……CACCAT
C．GACGAG……CTGCAG
D．CTGCAG……CTCGTC
(3)將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環化質粒，直接用于轉化細菌。這一過程與傳統重組質粒構建過程相比，無需使用的酶主要有______________________。
(4)轉化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養基篩選，下列敘述錯誤的有________。
A．稀釋涂布平板需控制每個平板30～300個菌落
B．抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養基溫度太高
C．抗性平板上常常會出現大量雜菌形成的菌落
D．抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化
(5)為了驗證平板上菌落中的質粒是否符合設計，用不同菌落的質粒為模板，用引物F1-F和F2-R進行了PCR擴增，質粒P1～P4的擴增產物電泳結果如圖3。根據圖中結果判斷，可以舍棄的質粒有________。
(6)對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認，原因是_______________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)PCR反應進行的條件：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2+)。分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時， 配制的兩個反應體系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。擴增程序中依據不同引物設置不同的復性溫度是最重要的環節，恰當地選擇復性溫度，盡量避免引物與模板的非特異性結合，以保證目的產物的有效擴增。
(2)由圖1可知，引物F2-F用于擴增F2片段，引物F1-R用于擴增F1片段，C選項中5′-GACGAG-3′能與EGFP基因中的右側部分堿基相同，5′-CTGCAG-3′與AnB1基因中的左側部分堿基相同，因此引物F2-F選用C。D選項中5′-CTGCAG-3′能與AnB1基因中的左側部分序列進行堿基互補配對，因此引物F1-R選用D。(3)傳統重組質粒構建需要使用限制酶切割質粒使其具有與目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA連接酶將目的基因和質粒連接成重組質粒。將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，由于PCR產物片段和線性質粒載體具有同源序列，可通過重組酶形成環化質粒。不需要使用限制酶和DNA連接酶。(4)轉化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養基篩選，用稀釋涂布平板法篩選時，菌落數可能低于30，A錯誤；培養基冷卻后才能接種，抗性平板上未長出菌落，一般不是培養基溫度太高所致，B錯誤；轉化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養基篩選，一般含有重組質粒的大腸桿菌才能發展為菌落，故不會出現大量雜菌形成的菌落，C錯誤；稀釋涂布平板和平板劃線法均為分離純化細菌的方法，用稀釋涂布平板法在抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化，D正確。故選ABC。(5)EGFP基因為720 bp，AnB1基因為390 bp，二者的總大小為720 bp＋390 bp＝1 110 bp，用引物F1-F和F2-R進行了PCR擴增，其大小接近于P1、P2，根據圖中結果判斷，可以舍棄的質粒有P3、P4。(6)瓊脂糖凝膠電泳技術僅能用于分析待檢測DNA分子的大小，無法確定待檢測DNA分子的堿基序列，因此對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認。
[答案]　(1)模板(片段F1、片段F2)專題(十三)　基因工程
1．基因工程的基本工具
提醒：兩種不同的限制酶切割不同的DNA片段，產生相同的黏性末端，這兩種限制酶稱為同尾酶。
2．基因工程的基本操作程序
提醒：①目的基因的插入位點不是隨意的，基因表達需要啟動子與終止子的調控，所以目的基因應插入在啟動子與終止子之間。當需要目的基因在特定細胞中表達時，需要利用特定的啟動子，如目的基因要在乳腺細胞中表達時，啟動子要換成乳腺蛋白基因的啟動子。②鑒定目的基因的插入與轉錄，可使用PCR技術或分子雜交技術。
3．蛋白質工程
4．DNA的粗提取與鑒定
5．PCR技術
6．DNA片段的電泳鑒定
提醒：DNA電泳鑒定中的“兩液兩劑”
①電泳緩沖液維持整個電泳體系的pH穩定，提供導電介質，影響物質的電泳遷移率。②凝膠載樣緩沖液(內含指示劑)主要用于樣品的稀釋和保護，同時通過指示劑指示樣品在凝膠中的位置，有助于判斷電泳是否完成，以及何時停止電泳。③核酸染料是用來染色DNA分子的一種化學物質，以便在紫外燈下觀察和檢測核酸條帶。
1．(2024·湖南卷)某同學將質粒DNA進行限制酶酶切時，發現DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是(　　)
A．限制酶失活，更換新的限制酶
B．酶切條件不合適，調整反應條件如溫度和酶的用量等
C．質粒DNA突變導致酶識別位點缺失，更換正常質粒DNA
D．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶
2．(2024·江西卷)γ-氨基丁酸在醫藥等領域有重要的應用價值。利用L-谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脫羧是高效生產γ-氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導入生產菌株E．coliA，構建了以L-谷氨酸鈉為底物高效生產γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列敘述正確的是(　　)
A．上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB
B．E．coliB發酵生產γ-氨基丁酸時，L-谷氨酸鈉的作用是供能
C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質粒
3．(2024·山東卷)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是(　　)
A．整個提取過程中可以不使用離心機
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后，應充分搖勻再倒入燒杯中
C．鑒定過程中DNA雙螺旋結構不發生改變
D．僅設置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾
判斷與表達
(1)PCR技術中，提高復性的溫度能有效減少反應非特異條帶的產生。(2021·湖北卷T16) (　　)
(2)基因工程中常用噬菌體轉化植物細胞。(2021·遼寧卷T3) (　　)
(3)利用蛋白質工程技術在N0(腈水合酶)的α和β亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩定的融合型腈水合酶(N1)，加入連接肽需要通過改造基因實現。(2021·遼寧卷T14) (　　)
(4)粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液中加入與濾液體積相等的、體積分數為95%的冷卻的酒精后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物。(2021·山東卷T13) (　　)
(5)粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后顯藍色。(2023·江蘇卷T9) (　　)
(6)為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是_____________________________________________
_____________________________________________________________________。
為使PCR產物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。(2022·山東卷T25)
(7)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。如圖所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是________。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中擴增出了400 bp片段，原因是______________________。(2019·江蘇卷T33)
(8)基因遞送是植物遺傳改良的重要技術之一，農桿菌侵染植物細胞時，可將外源基因遞送到植物細胞中的原因是農桿菌細胞內含有Ti質粒，__________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2023·海南卷T20)
基因工程及其應用
1．(2024·湖北八市聯考)HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。雞卵清蛋白是由輸卵管上皮細胞中卵清蛋白基因特異性表達后分泌至輸卵管內，參與構成雞蛋清的蛋白質。下圖是利用基因工程技術制備HA蛋白雞輸卵管生物反應器的過程。幾種可供選擇的限制酶識別序列如下，下列說法錯誤的是(　　)
A．①為逆轉錄過程，該過程需要逆轉錄酶、4種游離的脫氧核苷酸等組分
B．目的基因與雞卵清蛋白基因啟動子拼接前應先在目的基因兩端分別引入HindⅢ和EcoRⅠ的識別序列
C．利用PCR技術擴增目的基因時，復性溫度偏低、引物特異性差均可導致產物中出現部分非目標序列
D．基因表達載體導入受精雞胚的胚盤可以使用顯微注射法
2．(2024·安徽合肥三模)AK、DHDPS是玉米中合成賴氨酸的兩種關鍵酶，賴氨酸達到一定濃度就會與兩種酶結合抑制它們的活性，如圖所示，因此玉米中賴氨酸含量比較低。將AK中第352位蘇氨酸變成異亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺變成異亮氨酸，該變化影響了其與賴氨酸的結合，使玉米葉片和種子內游離的賴氨酸分別提高5倍和2倍。下列有關分析錯誤的是(　　)
A．玉米中賴氨酸含量比較低與負反饋調節密切相關
B．要替換AK、DHDPS中的氨基酸需要通過改造相應基因來實現
C．改造后的AK和DHDPS與賴氨酸的結合能力增強
D．改造后的AK和DHDPS的空間結構發生改變
3．(2024·湖南長沙一模)研究人員從分解纖維素的細菌(A菌)中提取出一種纖維素酶基因(CBHⅡ)并進行PCR擴增，然后與高效表達載體pUT質粒(圖1)連接構建成重組質粒并導入A菌，從而獲得分解纖維素能力更強的工程菌(B菌)。請回答下列問題：
限制酶 識別序列及酶切位點
BglⅡ 5′-ATCT-3′
BstEⅡ 5′-TNACC-3′ (N為任意堿基)
SacⅠ 5′-GCTC-3′
MspⅠ 5′-GG-3′
BamHⅠ 5′-ATCC-3′
幾種限制酶識別序列及酶切位點
(1)構建成重組質粒時，應選擇限制酶________________對pUT質粒進行酶切，經酶切后形成了兩個DNA片段(X和Y)，X兩端的黏性末端分別為-CTAG和-CAATG，則Y兩端的黏性末端分別為-CTAG和________。
(2)CBHⅡ基因中無上述限制酶的酶切位點，兩端需添加相關酶切位點才能在酶切后與pUT質粒連接，因此在擴增CBHⅡ基因時，需要在兩種引物的________(填“5′”或“3′”)端分別添加相應限制酶的識別序列。
(3)為鑒定重組質粒是否構建成功以及是否成功導入A菌，將其接種在含抗生素________(填“M”或“N”)的培養基上培養，將3個不同菌落擴大培養后提取質粒分別進行雙酶切并進行電泳，結果如圖3所示(片段過小時檢測不到條帶)。據圖分析，菌落________中成功導入了重組質粒。
(4)為檢測B菌的纖維素分解能力，將含有20%纖維素的培養基分為三組，進行不同處理后，在相同條件下培養一段時間，測定培養基內纖維素含量，結果如圖4所示，對照組2的處理為接種________，說明______________________________
_____________________________________________________________________。
基因工程相關的實驗
4．(2024·河北衡水模擬)現用新鮮的加入抗凝劑的雞血來進行DNA的粗提取和鑒定實驗，其過程如圖所示。下列說法錯誤的是(　　)
A．在實驗材料的選擇上，雞血細胞比菜花細胞更容易吸水漲破
B．圖①和圖③中均用到了攪拌，但攪拌的力度和速度均不同
C．圖③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精的原理粗提取DNA
D．圖④甲試管中加入的是清水和二苯胺試劑，沸水浴后不會出現顏色變化
5．(2023·山東濰坊三模)下列關于DNA片段的擴增及電泳鑒定實驗的說法，錯誤的是(　　)
A．放入PCR儀前，需要對離心管進行離心，使反應液集中在底部
B．配置瓊脂糖溶液時，需要根據DNA片段的大小調節瓊脂糖濃度
C．電泳時需要的兩種緩沖液分別含有核酸染料和指示劑
D．電泳時，需要根據電泳槽陽極至陰極之間的距離設定電壓
熱點拓展一　同尾酶
1．同尾酶定義
同尾酶，即能切割產生相同末端的限制酶，一般是指能產生相同黏性末端的限制酶。所有平末端酶產生的末端均是相同的，但一般不把它作為同尾酶來研究。同尾酶是不同的酶，它們只是切割DNA產生的末端相同，同尾酶之間的識別序列可以相同也可以不同，但基因工程中識別序列不同的同尾酶的應用性最大。在構建基因表達載體的過程中，若選擇的某種限制酶會破壞目的基因或質粒的重要片段時，可嘗試使用該酶的同尾酶進行切割。
2．同尾酶作用特點
同尾酶產生的黏性末端雖然可以像完全親和的黏性末端那樣進行連接，但是它與完全親和的黏性末端連接不同的是，連接后的產物往往失去原有的限制性內切核酸酶的切點，但是，少數情況下，也有能被某一種同尾酶識別并切割。例如，由BamHⅠ和Sau3AⅠ識別和切割序列分別是5′-ATCC-3′和5′ATC-3′，切割重組后，不能被BamHⅠ識別和切割，但仍能被Sau3AⅠ識別和切割。
這樣用同尾酶進行體外重組時，在限制酶切割反應之后不必將原有的限制酶失活，就可直接進行重組連接。由于連接體系中原有的限制酶的存在，從而保證了載體同外源DNA的連接。所以在這種連接反應中不必用堿性磷酸酶進行載體的脫磷酸反應而得到最高的連接效率，即不需要將5′端突出的磷酸基團消化掉，使質粒載體自身不能形成閉合的環狀結構。
(2024·湖南雅禮中學模擬)像BclⅠ(-ATCA-)、BglⅡ(-ATCT-)、MboⅠ(ATC-)這樣，識別序列不同，但能產生相同的黏性末端的一類限制酶被稱為同尾酶。如圖表示目的基因及質粒上的酶切位點。選用不同的限制酶對質粒和目的基因進行切割，并用DNA連接酶進行連接。下列分析錯誤的是(　　)
選項 切割質粒 切割目的 基因 結果分析
A BclⅠ和 BglⅡ BclⅠ和 BglⅡ 形成的重組質粒的堿基排列順序不一定相同
B BclⅠ和 BglⅡ MboⅠ 切割后的質粒不可自我環化，切割后的目的基因可以自我環化
C MboⅠ BclⅠ和 BglⅡ 形成的重組質粒可被MboⅠ 再次切開，但可能無法被BclⅠ和BglⅡ再次切開
D MboⅠ MboⅠ 切割后的質粒可以自我環化，切割后的目的基因也可以自我環化
熱點拓展二　啟動子與轉錄調控
1．啟動子的類型
啟動子是RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特異性結合和轉錄起始所需的保守序列，多數位于結構基因轉錄起始點的上游，啟動子本身不被轉錄。
啟動子對轉錄起始有調節和控制作用，決定著基因表達過程的起始以及在什么條件下開始。
參照轉錄調控模式，啟動子又可以分：
(1)組成型啟動子，該類啟動子能夠調控結構基因的表達基本恒定在一定程度上，在不同部位或組織表達水平差異不明顯。
(2)組織特異型啟動子，該類啟動子的調控作用使得基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，且表現出發育調節的特性。如構建乳腺生物反應器使用的即為乳腺細胞中特異表達基因的啟動子。
(3)誘導型啟動子，即在某些特定的物理或化學信號刺激后，基因轉錄水平在該類型啟動子調控下大幅度地提升。目前已經分離了眾多啟動子如熱誘導表達基因、光誘導表達基因、創傷誘導表達基因、真菌誘導表達基因和共生細菌誘導表達基因啟動子等。
2．啟動子位置及轉錄模板鏈的判斷
基于圖1中的信息能否判斷啟動子位置及轉錄模板鏈？答案是否定的，若要對轉錄情況做出準確判斷，必須要明確以下三個要素：
(1)鏈方向
(2)鏈性質(編碼鏈或模板鏈)
(3)功能區域(啟動子或終止子)
確定其中2個要素即可確定第3個要素。
舉例分析如下：
①基于圖2中模板鏈①及其方向，判斷啟動子的位置。
由于轉錄產生的RNA新鏈的合成方向為5′→3′，轉錄過程的發生是從啟動子到終止子，則推導出非編碼區2為啟動子。
②基于圖3中啟動子位置及DNA鏈的方向，判斷模板鏈位置。
轉錄過程的發生是從啟動子到終止子，轉錄產生的RNA新鏈的合成方向為5′→3′，且與模板鏈反向平行，推導出②為該基因的模板鏈。
③基于圖4中的模板鏈(①)及啟動子位置，判斷DNA鏈的方向。
轉錄過程的發生是從啟動子到終止子，轉錄出來的mRNA的5′端位于左側，3′端位于右側，由于①為模板鏈，其與轉錄產生的mRNA互補，且反向平行，所以①的方向從左至右為3′→5′，②的方向從左至右為5′→3′。
(2023·山東卷)科研人員構建了可表達J-V5融合蛋白的重組質粒并進行了檢測，該質粒的部分結構如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。
(1)與圖甲中啟動子結合的酶是____________。除圖甲中標出的結構外，作為載體，質粒還需具備的結構有_________________________________________________
_____________________________________________________________________(答出2個結構即可)。
(2)構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅
用一對引物，應選擇圖甲中的引物________。已知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的________(填“a鏈”或“b鏈”)相應部分的序列相同。
(3)重組質粒在受體細胞內正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應蛋白是否表達以及表達水平，結果如圖乙所示。其中，出現條帶1證明細胞內表達了____________________，條帶2所檢出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重組質粒上的J基因表達的。
熱點拓展三　Southern印跡雜交
Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的方法。其原理為利用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈 DNA片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上，經干烤或者紫外線照射固定，再與相對應結構的放射性同位素標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。Southern印跡雜交實驗可以幫助研究人員檢測特定DNA序列的存在和數量，可應用于基因表達研究、基因組學、醫學診斷等領域。
實驗操作步驟如下：
一、DNA樣品準備：從組織或細胞中提取基因組DNA，使用一種或多種限制酶對基因組DNA進行切割，將其消化成大小不同的片段。
二、DNA電泳分離：制備瓊脂糖凝膠，在恒定電壓下，將切割后的DNA片段上樣至瓊脂糖凝膠中，進行電泳分離。電泳時間根據DNA片段的大小和凝膠濃度而定，以確保DNA片段按分子量大小在凝膠中形成清晰的條帶。
三、DNA變性和轉膜：將電泳后的凝膠浸泡在變性溶液中(如0.25 mol/L HCl和堿性溶液)，使DNA變性并斷裂成單鏈片段。將變性后的凝膠上的DNA片段轉移到固相支持物上，如硝酸纖維素膜或尼龍膜。在轉膜過程中，需要保持DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置一致。
四、DNA固定：將載有DNA片段的膜進行固定處理，以防止DNA在后續步驟中脫落。常用的固定方法有紫外線照射或干烤等。
五、探針標記與雜交：使用同位素(如放射性同位素)或非同位素(如地高辛)標記方法制備特異性探針。將固定好的膜置于預雜交液中，將標記好的探針加入預雜交液中，與膜上的DNA片段進行雜交反應。
六、洗膜與檢測：洗去未與DNA片段結合的游離探針。根據探針的標記方法選擇合適的檢測方法。對于放射性同位素標記的探針，通常采用放射自顯影進行檢測；對于非同位素標記的探針，則可以使用相應的顯色系統(如地高辛特異抗體檢測系統)進行檢測。
(2024·湖南常德模擬)Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。其基本方法是利用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至硝酸纖維素膜上并固定，再與放射性標記的探針進行雜交，利用放射自顯影檢測特定DNA分子。根據信息判斷，下列說法中錯誤的是(　　)
A．限制酶消化DNA片段時破壞了相鄰兩個核苷酸分子之間的磷酸二酯鍵
B．轉移至硝酸纖維素膜上的DNA片段中有2個游離的磷酸基團
C．標記探針與硝酸纖維素膜上的DNA分子部分堿基序列互補
D．可用Southern印跡雜交法從基因組文庫中獲取目的基因
熱點拓展四　PCR技術拓展
1．實時熒光定量RT-PCR技術檢測病毒核酸
病毒感染的常規檢測方法是通過實時熒光PCR鑒定。實時熒光PCR擴增目的基因，需額外添加熒光標記探針(一小段單鏈DNA，可與目的基因中部序列特異性結合)。當探針完整時，不產生熒光。在PCR過程中，與目的基因結合的探針被耐高溫的DNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發出的熒光可被檢測到(如圖甲)，通過實時熒光PCR檢測某冠狀病毒感染時，檢測到的熒光強度變化如圖乙，熒光到達預先設定閾值的循環數(Ct值)越小，說明病毒核酸濃度越高。
2．PCR定點突變——重疊延伸PCR技術
重疊延伸PCR技術其主要設計思路是用具有互補配對片段的引物(圖中的引物2和3，突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點)，分別進行PCR，獲得有重疊鏈的兩種DNA片段，再在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因。如某科研團隊運用重疊延伸PCR技術在水蛭素基因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖：
3．PCR定點突變——大引物PCR技術
大引物PCR需要用到三條引物進行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規上游引物和常規下游引物。第一輪PCR利用突變上游引物和常規下游引物進行擴增，得到不完整的含有突變位點的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴增產物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規上游引物一起擴增得到完整的含有突變位點的DNA片段。原理如圖。
4．反向PCR擴增已知序列兩側的未知序列
當DNA的某些序列已知，而需要擴增已知序列兩端的未知序列時，可采用反向PCR技術。原理：用限制酶消化該DNA，隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產物環化，這樣就獲得了已知序列兩側攜帶有未知序列的環狀DNA分子。以該已知序列為模板設計一對相反方向的特異性引物，該引物對已知序列反向，但對未知序列卻是相向的，從而得以擴增出未知序列。原理如圖。
5．巢式PCR
首先將目標的DNA模板與第一套引物(外引物)結合。第一套引物也可能結合到其他具有相似結合位點的片段上并擴增多種產物。但只有一種產物是目的片段(圖中未顯示可能的多種產物)。然后使用第二套引物(內引物)對第一輪PCR擴增的產物進行第二輪PCR擴增。由于第二套引物位于第一輪PCR產物內部，而非目的片段包含兩套引物結合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片段。這種巢式PCR擴增確保第二輪PCR產物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。原理如圖。
1．(2024·黑龍江大慶模擬)常規PCR只能擴增兩引物間的DNA區段，要擴增已知DNA序列兩側的未知DNA序列，可用反向PCR技術。反向PCR技術擴增的原理如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A．酶切階段，L中不能含有酶切時所選限制酶的識別序列
B．環化階段，可選E．coli DNA連接酶而不能選T4 DNA連接酶
C．應選擇引物2和引物3進行PCR，且二者之間不能互補配對
D．PCR擴增，每輪循環前應加入限制酶將環狀DNA切割成線狀
2．(2024·廣東湛江二模)研究發現，若將第52位的脯氨酸(密碼子為CCA)替換成蘇氨酸(密碼子為ACA)，則可增強抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分堿基序列及可供選擇的引物如圖1所示，箭頭下方的數字代表堿基序號。現利用重疊延伸PCR技術對抗菌肽基因進行改造以獲得抑菌性更強的抗菌肽，過程如圖2所示，其中Ⅰ為轉錄模板鏈，引物上的“”代表突變位點。改造過程中PCR2所使用的引物組合為(　　)
A．引物1和引物4　　　 B．引物2和引物6
C．引物2和引物4 D．引物3和引物5
熱點拓展五　基因組編輯技術
1．寡核苷酸介導的定點突變
寡核苷酸是一類只有20個以下堿基的短鏈核苷酸的總稱，利用寡核苷酸可以實現不依賴PCR的定點突變。
(1)首先人工合成一段含有特定突變位點的單鏈寡核苷酸片段(除突變位點外，該片段的其他部分可以與目的基因互補配對)。
(2)然后將該寡核苷酸片段與帶有目的基因的單鏈載體(通常由M13噬菌體衍生而來，內有一個環狀單鏈DNA分子)進行雜交。
(3)繼而在DNA聚合酶和DNA連接酶的作用下分別進行DNA鏈的合成和連接反應，得到含有突變位點的雙鏈載體。
(4)最后將雙鏈載體引入宿主細胞復制，并進行篩選和鑒定。
2．CRISPR/Cas9系統
CRISPR/Cas系統是細菌和古菌在長期演化過程中形成的一種免疫系統，用來抵抗外源遺傳物質的入侵，為它們提供獲得性免疫。CRISPR/Cas系統可以識別出外源DNA，并將它們切斷，沉默外源基因的表達。正是由于這種精確的靶向功能，CRISPR/Cas系統已被開發成一種高效的基因組編輯工具。其中最常見的是CRISPR/Cas9基因編輯技術。
(1)系統構成：向導RNA＋限制性內切核酸酶Cas9。由具有內切核酸酶功能的Cas9蛋白和一條人為重組的一段目的基因的單鏈向導RNA(SgRNA)組成，向導RNA可以指導Cas9蛋白對靶基因進行敲除、插入和突變修飾。
(2)編輯原理：向導RNA能與基因組DNA中特定堿基序列通過堿基互補配對結合在一起，引導Cas9到特定的基因位點進行切割；通過設計向導RNA中的20個堿基的識別序列，可人為選擇DNA上的目標位點進行切割。根據CRISPR/Cas9精準攻擊外源DNA的工作原理，就可以實現基因敲除。如果在此基礎上為細胞引入一個修復的模板質粒(供體DNA分子)，就可以實現基因的定點突變。
3．重疊延伸PCR技術、大引物PCR技術(見熱點拓展四)
1．定點突變技術是按照預定設計，對某個已知基因的特定堿基進行定點增刪或轉換，最終改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構。其中一種方法是利用寡核苷酸鏈介導的定點突變，過程如圖所示。下列關于利用寡核苷酸鏈介導的定點突變技術的敘述，錯誤的是(　　)
A．該技術的原理是基因發生堿基對的替換
B．過程①需要模板、原料、能量、酶等基本條件
C．過程②以寡核苷酸鏈延伸后的單鏈為模板
D．過程①②均遵循堿基互補配對原則
2．(2021·海南卷)CRISPR/Cas9是一種高效的基因編輯技術，Cas9基因表達的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在單鏈向導RNA(SgRNA)引導下，切割DNA雙鏈以敲除目標基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因編輯技術的工作原理如圖所示。
回答下列問題。
(1)過程①中，為構建CRISPR/Cas9重組質粒，需對含有特定SgRNA編碼序列的DNA進行酶切處理，然后將其插入經相同酶切處理過的質粒上，插入時所需要的酶是________________________________________。
(2)過程②中，將重組質粒導入大腸桿菌細胞的方法是_______________________。
(3)過程③～⑤中，SgRNA與Cas9蛋白形成復合體，該復合體中的SgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結合，二者結合所遵循的原則是_________________
_______。隨后，Cas9蛋白可切割________序列。
(4)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除一個長度為1 200 bp的基因，在DNA水平上判斷基因敲除是否成功所采用的方法是________________，基因敲除成功的判斷依據是_________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人員將該蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9質粒中獲得重組質粒，隨后將其導入大腸桿菌細胞，通過基因編輯把該蛋白酶基因插入基因組DNA中，構建得到能大量分泌該蛋白酶的工程菌。據圖簡述CRISPR/Cas9重組質粒在受體細胞內，將該蛋白酶基因插入基因組DNA的編輯過程：____________________________________________________
__________________________________________________________________________________________________________________________________________。
1 / 1核心整合練(十三)　基因工程[B卷]
1．(2023·廣東卷)“DNA的粗提取與鑒定”實驗的基本過程是：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是(　　)
A．裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質
B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質等
C．沉淀：可反復多次以提高DNA的純度
D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現藍色
2．(2024·浙江杭州模擬)某二倍體動物種群有100個個體，其常染色體上某基因有A1、A2、A3三個等位基因。對這些個體的基因A1、A2、A3進行PCR擴增，凝膠電泳及統計結果如圖所示。該種群中A3的基因頻率是(　　)
A．52%　　 B．27%　　
C．32%　　 D．2%
3．(2024·湖北武漢一模)人乳鐵蛋白(hLF)是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結合糖蛋白，具有抑菌、抗腫瘤等多種生理功能，被認為是一種極具開發潛力的食品添加劑。某科研團隊將人乳鐵蛋白(hLF)基因轉入到山羊體內，從山羊的乳汁中獲得hLF，可以解決天然乳鐵蛋白資源短缺的問題，下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．可用PCR直接擴增人乳鐵蛋白的基因轉錄產物
B．重組載體中人乳鐵蛋白基因的啟動子是山羊乳腺蛋白基因啟動子
C．將目的基因導入山羊受精卵中一般應用的技術是顯微注射法
D．檢測人乳鐵蛋白基因是否成功翻譯常采用抗原—抗體雜交技術
4．(2024·廣東廣州模擬)紫色西紅柿經基因編輯后可產生比普通西紅柿多9倍的花青素(紫色)。紫色花青素能降低人類患心臟病、糖尿病的風險。如圖是花青素基因(S)的cDNA(某種生物發育某個時期的mRNA經逆轉錄產生的互補DNA)和Ti質粒圖。下列敘述錯誤的是(　　)
A．由圖可知，最好選用XbaⅠ、Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti質粒
B．在用農桿菌侵染時，常要使用一些抗生素，其目的一是抑制農桿菌生長，二是篩選轉化細胞
C．用于擴增 S基因的引物需滿足的條件是兩種引物分別與兩條模板鏈 3′端的堿基序列互補配對
D．若檢測出標記基因所表達的性狀，則說明重組質粒已經成功導入西紅柿細胞
5．(2024·湖北黃石一模)如圖所示，研究人員將雪花蓮凝集素基因(GNA)和尾穗莧凝集素基因(ACA)與載體(pBI121)結合，然后導入棉花細胞。下列操作不符合實驗目的是(　　)
A．用PCR技術可檢測GNA和ACA基因是否導入棉花細胞中
B．將棉花細胞接種在含氨芐青霉素的培養基上可篩選出轉基因細胞
C．用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA-ACA融合基因
D．與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉錄方向正確
6．(2024·北京昌平期末)科研人員在常規PCR基礎上發展出同時檢測多種病原體的多重PCR技術，檢測原理(a、b)及結果(c)如下圖。下列敘述錯誤的是(　　)
A．需要針對不同病原體設計特異性引物和熒光探針
B．圖中b是PCR反應的復性過程
C．多重PCR同時完成對4種病原體的檢測
D．由結果推測該檢測樣品中有A病原體的核酸
7．(2023·遼寧卷)天然β-淀粉酶大多耐熱性差，不利于工業化應用。我國學者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并將改造的基因與pLN23質粒重組后導入大腸桿菌，最終獲得耐高溫的β-淀粉酶。回答下列問題：
(1)上述過程屬于________工程。
(2)PCR中使用的聚合酶屬于________(填寫編號)。
①以DNA為模板的RNA聚合酶
②以RNA為模板的RNA聚合酶
③以DNA為模板的DNA聚合酶
④以RNA為模板的DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484個氨基酸構成，研究發現，將該酶第476位天冬氨酸替換為天冬酰胺，耐熱性明顯提升。在圖1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替換堿基的引物是________(填寫編號)。
(4)為了使上述改造后的基因能在大腸桿菌中高效表達，由圖2所示的pLN23質粒構建得到基因表達載體。除圖示信息外，基因表達載體中還應該有目的基因(即改造后的基因)和________。
(5)目的基因(不含EcoRⅠ酶切位點)全長為1.5 kb，將其插入BamHⅠ位點。用EcoRⅠ酶切來自不同大腸桿菌菌落的質粒DNA，經瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段長度，這一操作的目的是__________________________。正確連接的基因表達載體被EcoRⅠ酶切后長度為________kb。
(6)采用PCR還能在分子水平上確定目的基因是否轉錄，根據中心法則，可通過________反應獲得PCR的模板。
8．(2024·廣東佛山二模)瘦素是一種由脂肪組織合成和分泌的肽類激素。P載體含有的綠色熒光蛋白(GFP)基因能在真核細胞中表達GFP。將目的基因插入GFP基因后，能表達出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根據熒光的強弱，可確定目的基因在細胞內的表達情況。為研究瘦素的功能，科學家構建了瘦素基因真核表達載體，檢測瘦素基因在小鼠成纖維細胞中的表達情況。瘦素基因及P載體的結構如圖所示。回答下列問題。
(1)PCR擴增瘦素基因時，與引物1互補的a鏈左側是脫氧核苷酸鏈的________(填“5′”或“3′”)端。據圖推測，構建該基因表達載體時，P載體上應有啟動子、終止子、標記基因、復制原點、________________________，以便與酶切后的瘦素基因正確連接。
(2)已知Hind Ⅲ和BamHⅠ在P載體上的切割位點非常接近。為確定重組質粒是否構建成功，用Hind Ⅲ、BamHⅠ分別對瘦素基因PCR產物、P載體和重組質粒雙酶切，再進行電泳，結果如圖所示。若重組質粒構建成功，請在圖中將酶切結果對應位置的條帶涂黑。
(3)Kanr/Neor是一種抗性基因，在真核細胞中表達具有新霉素抗性，而在原核細胞中表達具有卡那霉素抗性。同種基因在真核、原核細胞中表達結果不同，可能的原因是_____________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
本實驗中為篩選轉化的細胞，應在培養基中添加________。
(4)為檢測瘦素基因是否成功表達，可用的鑒定方法是_____________________(答出2種)。為進一步獲得更多能表達融合蛋白的細胞，還需要進行______________。
9．(2024·湖北宜昌一模)科研人員構建了可表達WRK10-MYC 融合蛋白的重組農桿菌Ti質粒并成功轉化植物細胞得到轉基因植株，該質粒的部分結構如圖1所示，其中Kan為卡那霉素抗性基因，Hyg為潮霉素抗性基因，MYC標簽序列編碼標簽短肽MYC，WRK10蛋白為轉錄因子，可與圖2中PIF4基因啟動子某區段結合并激活該基因的轉錄。
(1)將重組農桿菌Ti質粒導入農桿菌時，需用Ca2+處理農桿菌，其目的是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)將農桿菌浸泡過的植物愈傷組織進行植物組織培養，培養基中需加入________________(填“潮霉素”“卡那霉素”或“潮霉素和卡那霉素”)進行篩選。
(3)已知利用LP和RP擴增結果為大帶，BP和RP擴增結果為小帶。可用圖中三種引物進行兩次PCR擴增和________________方法鑒定轉基因植物后代中的純合轉基因植株，PCR擴增時加入dNTP的目的是________________，其中BP引物和________鏈對應堿基序列相似。T-DNA插入植物染色體DNA 分子后會抑制原插入位點兩側引物的擴增產物的出現，則純合轉基因植株PCR產物的檢測結果為__________(填“大帶”“小帶”或“大帶和小帶”)。
(4)為了探究WRK10蛋白與PIF4基因啟動子結合的具體區段(如圖2所示)，科研工作者利用短肽MYC抗體處理了對應的基因表達產物，后經一系列過程，得到圖3所示的結果，由此推測轉基因植株體內WRK10蛋白激活PIF4基因的表達的機制是___________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
MYC標簽序列編碼的標簽短肽MYC的作用是____________________________
_____________________________________________________________________。
1 / 1熱點拓展練(十三)　基因工程
1．(2024·山東煙臺期中)同尾酶是指一組識別序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。下圖為EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅠ和MboⅠ四種限制酶的識別序列及酶切位點。下列說法正確的是(　　)
A．BamHⅠ、BglⅠ、MboⅠ屬于同尾酶，它們的識別序列相同
B．使用同尾酶構建基因表達載體時，切割位點的選擇范圍擴大
C．選用兩種不同的限制酶切割目的基因，可以防止目的基因自身的環化
D．用DNA連接酶將BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端連接后，可被二者重新切開
2．(2024·浙江杭州二模)某研究小組構建了能表達ACTA1-GFP融合蛋白的重組質粒，該重組質粒的部分結構如下圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物。
A．RNA聚合酶與啟動子結合，調控ACTA1基因和GFP基因的表達
B．僅用F2和R1一對引物，即可確定ACTA1基因插入方向是否正確
C．ACTA1基因轉錄的模板鏈是a鏈，引物F1與a鏈的部分序列相同
D．若用引物F2和R2進行PCR，能更好地區分ACTA1-GFP基因純合子和雜合子
3．(2024·江蘇鹽城模擬)常見的啟動子可分為三類：組成型啟動子，驅動基因在所有細胞、組織和器官中持續表達；組織特異型啟動子，調控基因只在某些特定的部位中表達；誘導型啟動子，通常在光、鹽等信號作用下，使目的基因的轉錄水平有所提高。下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．細胞分化與組織特異型啟動子的調控和組成型啟動子均有關
B．膀胱生物反應器的構建需要將目的基因連接在誘導型啟動子的下游
C．真核生物細胞中，一般一個啟動子只能啟動一個基因的轉錄
D．強啟動子可使基因高水平表達，啟動子的強弱主要取決于其與RNA聚合酶的親和性
4．(2024·四川綿陽期中)研究人員利用農桿菌侵染水稻葉片，經植物組織培養、篩選最終獲得了一株水稻突變體，現欲檢測該突變體是否由T-DNA 插入所致。如圖是利用不同的限制酶處理突變體的總DNA，經電泳、核酸分子雜交的放射性自顯影結果，并與野生型和Ti質粒做對比(注：T-DNA上沒有所用限制酶的酶切位點)，對該實驗的分析錯誤的是(　　)
A．檢測結果時使用了放射性標記的T-DNA片段做探針
B．不同酶切顯示的雜交帶位置不同，說明T-DNA 有不同的插入位置
C．實驗結果證明該突變體核DNA中插入了T-DNA
D．若野生型也出現雜交帶，則實驗樣本可能被污染，檢測結果不準確
5．(2024·四川綿陽期中)巢式PCR是指先后用外、內引物擴增獲得目的基因的方法。其原理為先以比目的基因大的DNA片段為模板，用外引物(F1，R1)進行擴增，獲得大量含目的基因的中間產物，再以擴增后的中間產物為模板，用內引物(F2，R2)擴增目的基因，如圖所示。下列說法錯誤的是(　　)
A．兩對引物的堿基序列不相同，但均應為單鏈DNA片段
B．第二輪PCR反應能否進行，是對第一輪PCR反應正確性的鑒定
C．由于和兩套引物都互補的靶序列較少，該技術可大大提高擴增的特異性
D．如果兩套引物一起加入反應體系中，外引物的復性溫度應顯著低于內引物
6．(2024·福建漳州一模)基因定點突變的目的是通過定向改變基因內一個或少數幾個堿基來改變多肽鏈上一個或幾個氨基酸。大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR反應即可獲得，第一輪加誘變引物和側翼引物，第一輪產物作為第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
A．第一輪PCR過程中復性所用的溫度應低于第二輪PCR復性的溫度
B．PCR擴增的定點誘變產物需具備啟動子、終止子等結構才能進行轉錄和翻譯
C．第一輪PCR的產物的兩條DNA鏈作為第二輪PCR所用的引物
D．將某蛋白第21位的組氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，屬于蛋白質工程
7．(2024·山東德州二模)CRISPR/Cas9基因編輯技術能對基因進行定點編輯，其原理如圖1所示。科研人員根據豬的細胞表面抗原基因RAG1的啟動子設計了SgRNA1和SgRNA2，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得了兩種基因敲除豬，檢測基因敲除豬體內的RAG1基因表達情況如圖2所示。下列說法錯誤的是(　　)
A．CRISPR/Cas9識別目標DNA序列主要與SgRNA序列的特異性相關
B．基因敲除豬的細胞表面抗原減少，器官移植過程中免疫排斥作用減弱
C．兩種SgRNA都可引導Cas9在轉錄水平上減弱RAG1基因的表達
D．據圖2可知，用SgRNA2制備的基因敲除豬用于器官移植效果更好
8．(2024·山東濟寧模擬)干擾素是在病毒感染后機體免疫細胞產生的一種具有干擾病毒復制作用的糖蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤等作用。科研人員利用大腸桿菌構建干擾素工程菌，下圖是部分單鏈DNA序列，回答下列問題：
(1)從相應細胞中提取mRNA后，在________酶的作用下獲得cDNA。也可以直接從細胞中粗提取DNA，DNA不溶于酒精，但溶于______mol/L的NaCl溶液。
(2)通過PCR技術擴增干擾素基因時，所需引物序列的前9個核苷酸為______________和____________，所需的酶為________________。
(3)構建基因表達載體時，需要選擇合適的啟動子，其作用是__________________
_______________________。若目的基因以圖中單鏈為轉錄模板鏈，啟動子應該與目的基因的________(填“左側”或“右側”)連接。
(4)使用一種限制酶切割目的基因和載體后，會存在目的基因的正向或反向兩種連接產物，________(填“可以”或“不可以”)通過電泳來區分兩種產物，在凝膠中DNA分子的遷移速率與________________________________(列舉兩點)等有關。
9．(2023·江蘇卷)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術構建質粒，如圖1所示。請回答下列問題：
(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有__________，擴增程序中最主要的不同是________。
(2)有關基因序列如圖2。引物F2-F、F1-R應在下列選項中選用________。
A．ATGGTG……CAACCA
B．TGGTTG……CACCAT
C．GACGAG……CTGCAG
D．CTGCAG……CTCGTC
(3)將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環化質粒，直接用于轉化細菌。這一過程與傳統重組質粒構建過程相比，無需使用的酶主要有___________________________________________________________________。
(4)轉化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養基篩選，下列敘述錯誤的有________。
A．稀釋涂布平板需控制每個平板30～300個菌落
B．抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養基溫度太高
C．抗性平板上常常會出現大量雜菌形成的菌落
D．抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化
(5)為了驗證平板上菌落中的質粒是否符合設計，用不同菌落的質粒為模板，用引物F1-F和F2-R進行了PCR擴增，質粒P1～P4的擴增產物電泳結果如圖3。根據圖中結果判斷，可以舍棄的質粒有________。
(6)對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認，原因是_______________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
1 / 1核心整合練(十三)　基因工程[A卷]
1．(2023·湖北卷)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環素抗性基因(TetR)作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體(重組質粒)，并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是(　　)
A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否
D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養基中能形成菌落
2．(2024·安徽合肥三模)科研人員將寒帶地區海魚中的抗凍基因轉入千禧果細胞中，成功培育出抗凍千禧果。下圖為培育過程中使用的Ti質粒示意圖，其中Vir區的基因活化能促進T-DNA的加工和轉移，下列敘述正確的是(　　)
A．構建基因表達載體時，最好選擇限制酶Ⅱ和Ⅲ來切割質粒
B．利用PCR技術擴增抗凍基因，需提前檢測抗凍基因的全部堿基序列
C．Vir區的基因活化可促進抗凍基因整合到千禧果細胞的染色體DNA上
D．利用含卡那霉素的培養基可篩選出成功導入抗凍基因的千禧果細胞
3．(2024·河北衡水模擬)翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)是在翻譯水平受到抑制的腫瘤相關蛋白，是一個高度保守且和細胞生長、死亡等功能有關的蛋白。現從果蠅基因組DNA中擴增果蠅dTCTP基因，經限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，插入表達質粒pGEX-4T-2上構建基因表達載體，最終表達有活性的dTCTP融合蛋白。關于該基因表達載體的構建，下列敘述錯誤的是(　　)
A．表達質粒pGEX-4T-2可以用限制酶BamHⅠ和EcoR Ⅰ進行雙酶切
B．dTCTP基因是該項研究中的目的基因
C．除了目的基因和標記基因外，該基因表達載體還必須有啟動子和終止子
D．將dTCTP基因插入表達質粒pGEX-4T-2上時，需要用到DNA聚合酶
4．(2024·遼寧丹東二模)利用AI(人工智能)破解蛋白質結構和功能之謎，建立蛋白質數據庫，并在此基礎上進行蛋白質結構設計和優化，會給未來蛋白質工程的發展帶來翻天覆地的變化。關于該技術的實施下列說法錯誤的是(　　)
A．用AI預測新型蛋白質的基因結構應依據中心法則原理
B．可以通過改造或合成基因來獲得AI設計的蛋白質
C．根據設計的某種蛋白質的氨基酸序列推理的基因序列中包含啟動子和終止子
D．用蛋白質的氨基酸序列推測的RNA編碼序列有多種可能，原因是密碼子的簡并
5．(2024·安徽卷)下列關于“DNA 粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是(　　)
A．實驗中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低
B．利用DNA和蛋白質在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA
C．DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物
D．將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應，可檢測溶液中是否含有蛋白質雜質
6．(2024·遼寧沈陽模擬)某實驗小組設計了快速檢測餐飲食品中金黃色葡萄球菌的方法，主要包括無菌采樣、培養基預增菌、煮沸法提取DNA 和實時熒光 PCR技術特異性檢測四個步驟。下列敘述錯誤的是(　　)
A．培養基預增菌可以通過保持營養的穩定供給使所提取的菌株均能正常生長
B．提取DNA時需將金黃色葡萄球菌的培養液放入離心機中離心后采集上清液
C．可根據金黃色葡萄球菌基因組的保守序列設計兩種引物，兩引物的序列不互補
D．為滿足PCR反應的需求，需控制復性溫度及添加 Mg2+以保證DNA的穩定增長
7．(2024·廣東卷)駒形桿菌可合成細菌纖維素(BC)并將其分泌到胞外組裝成膜。作為一種性能優異的生物材料，BC膜應用廣泛。研究者設計了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表達載體，將其轉入駒形桿菌后構建出一株能合成BC膜并可實現光控染色的工程菌株，為新型紡織原料的綠色制造及印染工藝升級提供了新思路(圖一)。
回答下列問題：
(1)研究者優化了培養基的________________(答兩點)等營養條件，并控制環境條件，大規模培養工程菌株后可在氣液界面處獲得BC菌膜(菌體和 BC膜的復合物)。
(2)研究者利用T7噬菌體來源的RNA聚合酶(T7RNAP)及藍光光敏蛋白標簽，構建了一種可被藍光調控的基因表達載體(光控原理見圖二a，載體的部分結構見圖二b)。構建載體時，選用了通用型啟動子PBAD(被工程菌RNA聚合酶識別)和特異型啟動子PT7(僅被T7RNAP識別)。為實現藍光控制染色，啟動子①②及③依次為________________，理由是______________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)光控表達載體攜帶大觀霉素(抗生素)抗性基因。長時間培養時在培養液中加入大觀霉素，其作用為___________________________________________________
_____________________________________________________________________(答兩點)。
(4)根據預設的圖案用藍光照射已長出的BC菌膜并繼續培養一段時間，隨后將其轉至染色池處理，發現只有經藍光照射的區域被染成黑色，其原因是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(5)有企業希望生產其他顏色圖案的BC膜。按照上述菌株的構建模式提出一個簡單思路：___________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
8．(2024·河北卷)新城疫病毒可引起家禽急性敗血性傳染病，我國科學家將該病毒相關基因改造為r2HN，使其在水稻胚乳特異表達，制備獲得r2HN疫苗，并對其免疫效果進行了檢測。
回答下列問題：
(1)實驗所用載體的部分結構及其限制酶識別位點如圖1所示。其中GtP為啟動子，若使r2HN僅在水稻胚乳表達，GtP應為________________啟動子。Nos為終止子，其作用為______________________。r2HN基因內部不含載體的限制酶識別位點。因此，可選擇限制酶________和________對r2HN基因與載體進行酶切，用于表達載體的構建。
(2)利用________方法將r2HN基因導入水稻愈傷組織。為檢測r2HN表達情況，可通過PCR技術檢測______________，通過________技術檢測是否翻譯出r2HN蛋白。
(3)獲得轉基因植株后，通常選擇單一位點插入目的基因的植株進行研究。此類植株自交一代后，r2HN純合體植株的占比為________。選擇純合體進行后續研究的原因是___________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)制備r2HN疫苗后，為研究其免疫效果，對實驗組雞進行接種，對照組注射疫苗溶劑。檢測兩組雞體內抗新城疫病毒抗體水平和特異應答的CD8＋T細胞(細胞毒性T細胞)水平，結果如圖2所示。據此分析，獲得的r2HN疫苗能夠成功激活雞的________免疫和________免疫。
(5)利用水稻作為生物反應器生產r2HN疫苗的優點是_______________________
____________________________________________________________________________________________________________________________。(答出兩點即可)
9．(2024·湖北荊州三模)磷脂酸(PA)是調節植物生長發育和逆境響應的重要信使物質。為了解植物細胞中PA的動態變化，研究人員用無縫克隆技術將高度專一的PA結合蛋白(PABD)基因與綠色熒光蛋白(GFP)基因融合，構建有效監測細胞PA變化的熒光探針，并測定擬南芥細胞內PA含量。無縫克隆技術連接DNA片段的機理和構建熒光探針表達載體的過程如下圖。請回答下列問題：
注：bar為草胺膦抗性基因；Kanr為卡那霉素抗性基因。
(1)無縫克隆時，T5核酸外切酶沿__________(填“5′→3′”或“3′→5′”)的方向水解DNA，形成黏性末端。T5核酸外切酶催化的最適溫度為37 ℃，而過程①選擇的溫度為50 ℃，目的是_____________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)過程②兩個片段復性后存在“缺口”，因此過程③所需的酶有_____________________________________________________________________。
(3)PCR技術中通常要設計引物，引物的作用是_____________________________
_______________________，有時需要在引物的一端增加限制酶的酶切位點，目的通常是______________________________。PCR擴增PABD基因時需依據PABD基因一端的核苷酸序列和載體一端的核苷酸序列設計引物R1。據圖分析擴增目的基因片段時，所用的引物F1和R2可對應下表中的________(填序號)。
① 5′-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3′
② 5′-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTA- ACTAGTCTTAGTGGCGTC-3′
③ 5′-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATG- GTGAGCAAGGGCGA-3′
④ 5′-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTG- TACAGCTCGTCCA-3′
(4)利用農桿菌花序侵染法轉化擬南芥，將獲得的種子進行表面消毒，均勻鋪在含__________的MS培養基上進行篩選和鑒定，將篩選得到的種子種植，可得到轉基因擬南芥，通過觀測轉基因擬南芥根尖細胞中__________________，了解PA的分布和含量。
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