資源簡介

課題2
多聚酶鏈式反應擴增DNA片段
教學準備
1.??
教學目標
1、了解PCR技術的基本操作
2、理解PCR的原理
3、討論PCR的應用
2.??
教學重點/難點
教學重點：PCR的原理和PCR的基本操作
教學難點：PCR的原理
3.??
教學用具
教學課件
4.??
標簽
教學過程
（一）引入新課
回憶DNA分子的結構
1、組成元素：C、H、O、N、P
2、基本單位:
脫氧核苷酸
3、脫氧核苷酸結構
（二）、細胞內的DNA復制
1、概念：由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程
2、時期：有絲分裂間期減數第一次分裂前的間期
3、場所：細胞核（主）、線粒體、葉綠體
4、模板：DNA母鏈
5、原材料：脫氧核苷酸
6、基本條件:酶、ATP、原料、模板
7、復制過程:
①
DNA的解旋????
②
RNA引物的合成
③
DNA的生成????
④切掉引物生成岡崎片斷???
⑤
DNA片斷的連接
8、復制特點:
邊解旋邊復制(過程）、半保留復制（結果）
9、遵循原則：堿基互補配對原則
10、精確復制的原因：
①規則的雙螺旋結構為復制提供了精確的模板
②堿基互補配對能力保證了復制準確無誤的進行
（三）、聚合酶鏈式反應
PCR是由美國科學家穆利斯提出的一種體外簡化條件下模擬DNA體內復制的DNA快速擴增的方法，此技術獲得1993年諾貝爾化學獎。
1．PCR原理
PCR技術擴增DNA的過程，與細胞內DNA復制過程類似：
1．1細胞內DNA復制條件分析：
1．2細胞內DNA復制過程
（1）DNA的反向平行結構：（結合教材圖5－6）
核苷酸分子的結構與方向性：（分子結構模式圖）
由核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長鏈：（模式圖，體現方向性）。
DNA雙螺旋結構的反向平行結構：
（2）DNA的復制過程:
解旋：解旋酶、ATP，DNA兩條鏈打開，，形成兩條DNA單鏈。
引物結合：在DNA單鏈3’端與DNA反向配對結合，確保引物3’端與DNA單鏈準確配對。
DNA聚合酶結合：
子鏈合成：DNA聚合酶從引物3’端開始，將配對的脫氧核苷酸連接起來。
后續加工：DNA聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的DNA單鏈，再由DNA連接酶將不連續的DNA子鏈連接起來（半不連續合成。先導鏈，滯后鏈）
子鏈合成特點：不能從頭合成；合成方向為“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成，還具有校對功能。它在每引入一個核苷酸后都要復查一次，只有堿基配對無誤后才能繼續往下聚合，它不能從頭合成。RNA聚合酶沒有校對功能，因此RNA的合成不需要引物，而是從頭合成的，它的錯配可能性較大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去，代之以高保真的DNA鏈。
［思考］DNA分子能準確復制的原因有哪些？
DNA雙螺旋結構提供模板；堿基互補配對；DNA聚合酶的復查功能。
［思考］細胞內哪些物質是從頭合成的？RNA合成、蛋白質合成。
1．3?
DNA分子復制的人工控制
解開螺旋：在80～100℃時，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性。
恢復螺旋：在50℃左右時，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結構，稱為復性。
復制條件：緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩定DNA聚合酶,兩種引物。
反應場所：PCR儀（自動溫度周期性調節）。
［思考］緩沖液相當細胞內的什么成分？（核基質）
2．PCR的反應過程
變性：在95℃時DNA解旋
復性：在50℃時引物與DNA單鏈結合
延伸：在72℃時合成DNA子鏈（兩個引物間的序列）
3．實驗操作
3．1
PCR反應體系：
緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩定DNA聚合酶、兩種RNA引物，水
3．2
實驗操作步驟
3．3
按照PCR反應體系配方配制反應液；
（1）將PCR反應體系50μL用微量移液器轉移到微量離心管（0.5mL）中；
（2）將微量離心管放到PCR儀中；
（3）設置PCR儀的工作參數。
（4）DNA在PCR儀中大量擴增。
3．4
水浴法：將微型離心管依次在95℃、55℃、72℃的恒溫水浴鍋中循環處理相應時間。
4．實驗注意事項
（1）避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。
（2）緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。
（3）每添加一種反應成分，更換一個移液器的槍頭。
（4）混勻后離心處理，使反應液集中在離心管底部。
5．結果分析與評價
（1）反應液稀釋：取2?LPCR反應液，添加98?L蒸餾水；2．分光光度計調零：將100?L蒸餾水添加到比色杯中，在260nm處將分光光度計調整讀數為零。
（2）將100?L反應稀釋液倒入比色杯中，測定在260nm處的光吸收值。
（3）計算：DNA含量＝50×光吸收值×稀釋倍數
（四）、PCR產物鑒定：
瓊脂糖凝膠電泳技術
1、實驗原理
在外加電場的作用下，帶電粒子發生遷移的現象叫電泳。在電場中，帶電分子向著與其所帶電荷相反的電極移動。
在施以一定強度的電場中，帶負電荷的DNA在瓊脂糖凝膠中可以由電源的負極向正極泳動，泳動的速度與DNA片段的長度成負相關，與電壓強度成正比，利用這一性質可以分離不同長瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物：
（1）制膠???
（2）點樣???????
（3）電泳
（4）紫外投射分析儀觀察并照相
2、兩種染料：
6×上樣buffer：維持反應體系的pH不變，而且上樣buffer常以溴酚藍為指示劑，稀釋成1×后比重仍然較大，上樣時極易下沉，且顏色清晰可見。
DNA熒光染料：由于DNA不能直接觀察到，所以利用一種核酸的熒光染料與PCR的產物DNA結合后再電泳，電泳結束后，可用紫外透射分析儀觀察電泳結果。
3、可以用已知長度的DNA
“Marker”作為參照，對電泳圖譜進行比對，估算未知DNA分子的長度，同時根據帶的寬度，估算未知DNA分子的數目。
（五）、PCR的應用
PCR具有省時、操作簡便、特異性強、靈敏度高、效率高、應用范圍廣等特點。PCR技術在分子生物學、醫學和案件偵破等領域得到廣泛應用。
課堂小結
?PCR的技術，需要首先了解細胞內參與DNA復制的各種組成成分與反應條件。掌握PCR的基本步驟及每個步驟所發生的變化。這部分內容的應以讀圖識圖為主。在現代生物技術中，DNA技術可謂是尖端技術。人類基因組計劃、基因工程、基因診斷、基因檢測、古生物鑒定等都離不開對DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序列，就需要一定量的DNA片段。今天我們來學習研究了DNA分子的擴增技術――PCR技術。希望大家能夠掌握和理解。
板書
專題五???
第2節??
多聚酶鏈式反應擴增DNA片段
一、細胞內的DNA復制
二、聚合酶鏈式反應
1、PCR擴增的原理
2、PCR擴增的過程
三、PCR產物鑒定
瓊脂糖凝膠電泳技術
四、PCR的應用

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