資源簡介

實驗1：大腸桿菌的培養和分離
一、教學要求
基本要求
1．進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養基進行細菌培養的操作2．進行大腸桿菌的分離，用固體平面培養基本進行細菌的劃線培養。
發展要求
說明大腸桿菌培養的條件和實驗原理。
說明
二、基本內容
1．培養基的種類和化學成份
培養基的種類有很多劃分標準，按物理性質分：固體培養基和液體培養基（加入瓊脂多少）。液體培養基用于擴大培養和工業生產，固體培養基用于菌種分離，鑒定，計數（菌落數量）。
培養基的化學成分包括
水
、
無機鹽
、
碳源
、
氮源
、生長因子等。按照微生物的同化作用類型是自養還是異養，碳源不同，自養微生物為無機碳源，如硝化細菌是二氧化碳或碳酸鹽，異養微生物為有機碳源，如大腸桿菌是葡萄糖等有機物。
2．常見微生物類群
原核生物（如細菌大腸桿菌――二分裂、革蘭氏陰性、異養兼性厭氧性腸道桿菌、藍藻、支原體、衣原體、放線菌等）、原生生物（草履蟲、變形蟲等）、真菌（酵母菌――出芽生殖.異養兼性厭氧性微生物、霉菌、食用菌）、病毒等。
細菌是單細胞的原核生物，有細胞壁（肽聚糖）、細胞膜、細胞質，無成型的細胞核，只有一環狀DNA分子（擬核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性菌（革蘭氏染液染色后，再脫色處理，細菌仍保留染色液的顏色）和革蘭氏陰性菌兩大類，區別在細胞壁的成分不同。大腸桿菌是革蘭氏陰性（細胞壁薄，有莢膜）、兼性厭氧的腸道桿菌。
3．無菌技術
對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；將培養器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌；為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近旁進行；避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。
比較
理化因素的作用強度
消滅微生物的數量
芽孢和孢子能否被消滅
消毒
較為溫和
部分生活狀態的微生物
不能
滅菌
強烈
全部微生物
能
滅菌方法：
①接種環、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法。
②玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱。
③培養基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋。
④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。
4．培養基的配制原則
目的要明確：根據培養的微生物種類、培養的目的等確定培養基的類型和配制量。
營養要協調：培養基中各種營養物質的濃度和比例要適宜。
pH要適宜：細菌培養基pH中性或偏堿性，霉菌培養基呈酸性。
5．實驗操作步驟
（1）配制培養基：計算→稱量→溶化→調pH→分裝→加棉塞→滅菌→倒平板（形成斜面是為增大接種面積）。
我們一般用LB液體培養基來擴大培養大腸桿菌，培養后可在LB固體培養基上劃線分離。以下為本實驗中培養基配置步驟：
①稱量：準確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。配置LB固體培養基時還需加1g瓊脂。
②溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50mL。配置LB固體培養基時還需加瓊脂，整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。
③調pH：用1mol/L
NaOH溶液調節pH至偏堿性。
④滅菌：在兩個250ml的三角瓶中分別裝入50ml
LB液體培養基和50ml
LB固體培養基，加上棉塞。將培養皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內，1kg壓力滅菌15min。
⑤倒平板：滅菌后，待固體培養基冷卻至60℃左右時在酒精燈火焰附近操作進行。其過程是：①將滅過菌的培養皿放在火焰旁，右手拿裝有培養基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過火焰；③用左手將培養皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養基倒入培養皿，立刻蓋上皿蓋；④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。
倒過來放置的目的是防止培養基冷卻過程中形成的水滴落到培養基表面。向培養皿中轉移已滅菌的培養基時，也不要把培養基沾在皿壁上。否則，空氣中雜菌會在這些粘附培養基上繁殖，并污染皿內培養基。
（2）接種
微生物接種的最常用方法是平板劃線法和稀釋涂布法。
平板劃線法（方法簡單，考試的主要考查點）：通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面（也是分離純化的方法）。在第一次劃線后都從上次劃線末端開始的目的是獲得由單個細菌形成的標準菌落。
稀釋涂布平板法（操作復雜，單菌落更易分開）：將菌液進行一系列梯度稀釋，并將不同稀釋度菌液分別涂布到瓊脂固體培養基上進行培養。當稀釋倍數足夠高時，即可獲得單個細菌形成的標準菌落。
1．劃線分離法：用接種環蘸菌液后在含有固體培養基的培養皿平板上劃線，在劃線過程中菌液逐漸減少，細菌也逐漸減少。劃線到最后，可使細菌間的距離加大。在培養10～20h后，可由一個細菌產生單菌落，菌落不會重疊。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是由一個細菌產生的后代。
其操作步驟是：將培養皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態，在火焰旁將培養皿稍微打開。在此同時，用環狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養皿內，在平板培養基的一邊，作第1次平行劃線
3～5條，轉動培養皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。
劃線時，接種針應與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養皿邊緣，也不要將培養基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養。
取菌種前灼燒接種環的目的是消滅接種環上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環的目的是消滅接種環上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環冷卻后進行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環的目的是防止細菌污染環境和操作者。
2．涂布分離法：先將培養的菌液稀釋，通常稀釋到10－5
～10－7之間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養皿的固體培養基上，用玻璃刮刀涂布在培養基平面上進行培養，在適當的稀釋度下，可產生相互分開的菌落。通常每個培養皿有20個以內的單菌落最為適合。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養后，再做功能性實驗。
（3）培養
平板倒置放在培養箱中培養是為了使水分蒸發形成的水蒸氣凝結成的水滴滴留在蓋上，同時防止水滴入培養基并擴散開，已形成的菌落隨水擴散，相互影響。
（4）觀察結果（菌落數量、特征等）并分析、評價
1.微生物是指結構簡單、形體微小的單細胞、多細胞或沒有細胞結構的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。細菌是單細胞的原核生物，有細胞壁（肽聚糖）、細胞膜、細胞質，無成型的細胞核，只有一環狀DNA分子（擬核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性菌（革蘭氏染液染色后，再脫色處理，細菌仍保留染色液的顏色）和革蘭氏陰性菌兩大類，區別在細胞壁的成分不同。大腸桿菌是革蘭氏陰性（細胞壁薄，有莢膜）、兼性厭氧的腸道桿菌。
2.細菌的分離方法有兩種：劃線分離法和涂布分離法。是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達量菌株的最簡便方法之一。劃線分離就是用接種環蘸菌液后在含有固體培養基的培養皿平板上劃線，在劃線的過程中菌液逐漸減少，細菌也逐漸減少，。劃線最后，可使細菌間的距離加大。將接種后的固體培養基培養10～20小時后，一個細菌細胞就會繁殖成許多細菌細胞，形成菌落，不會重疊。在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是有一個細菌產生的后代。用于基因工程的大腸桿菌的工程菌，可以用劃線分離法獲得產物表達能力高的菌株。由于工程菌的質粒中通常有抗性基因（如抗氨芐青霉素基因），如在培養基中加入一定量的氨芐青霉素，由于非工程菌的其他雜菌都沒有抗性基因，所以在劃線后只有存在抗性基因的工程菌能生存下來。
涂布分離時，需要先將培養的菌液稀釋，通常稀釋到10-5～10-7之間，然后去0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養皿的固體培養基上，用玻璃刮刀涂布在培養基平面上進行培養，在適當的稀釋度下，可產生相互分開的菌落。通常每個培養皿中有20個以內的單菌落為最合適。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養后，再做功能性實驗。
劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復雜。
3.在培養微生物時，必須進行無菌操作。其首要條件是各種器皿必須是無菌的，各種培養基也必須是無菌的，轉移培養基、倒平板、接種、平板劃線、平板稀釋涂布等操作中的每一步都要做到無菌（防止雜菌污染）。進行恒溫培養時，要將培養皿倒置，是因為培養基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發，倒放培養皿會使水蒸氣凝結成水滴后，落入培養基的表面并且擴散，菌落中的細菌也會隨水擴散，菌落見相互影響，很難在分成單菌落，達不到分離的目的。
4.細菌擴大培養要用LB液體培養基（通用培養基、常用于做生理學研究和發酵工業），劃線分離要用LB固體培養基（常用于微生物分離、鑒定、計數和菌種保存）。“細菌喜葷，霉菌喜素”，通常細菌培養基要用蛋白胨和酵母提取物來配制，還要加入一定的氯化鈉，以維持一定的滲透壓；霉菌培養基一般用無機物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。盡管培養基的配方各不相同，但其基本成分都一樣（五類）。
人及動物的營養物質：水、無機鹽、糖類、脂質、蛋白質、維生素六類；
植物的營養物質：礦質元素、水、二氧化碳等三類；
微生物的營養物質：水、無機鹽、碳源、氮源及生長因子等五類。
4.無菌技術
（1）獲得純凈培養物的關鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：
①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。
②將用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌。
③為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。
④實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。
（2）消毒與滅菌的區別
消毒指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，還有化學藥劑（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒、紅外線消毒。滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。
5.培養基
（1）培養基可分為液體培養基和固體培養基（按照物理性質）。在液體培養基中加入凝固劑瓊脂后，制成瓊脂固體培養基。微生物在固體培養基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據菌落的特征可以判斷是哪一種菌。
（2）各種培養基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽四種營養物質。滿足微生物生長還需要適宜的pH、氧氣的要求（根據微生物的需求提供有氧或無氧環境）、特殊營養物質等。
碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質。如CO2、NaHCO3等無機碳源；糖類、蛋白質、脂肪等有機碳源。異養微生物只能利用有機碳源。單質碳不能作為碳源。
氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質。如N2、NH3、NO3-、蛋白質、氨基酸等。只有固氮微生物才能利用N2。
（3）培養基配制的原則：目的要明確、PH值要適宜、營養要協調和要經濟節約。
實驗2
分離以尿素為氮源的微生物
尿素又稱脲,是蛋白質的降解產物,哺乳動物的尿液中含有,植物不能直接吸收尿素,因此,大量尿素的存在對環境造成污染.有些細菌可產生脲酶,以尿素為氮源,脲酶可將尿素分解為氨,被植物吸收.
實驗原理
用選擇培養基可分離出以尿素為氮源的微生物，這些微生物可產生脲酶，脲酶可將尿素分解為能被植物吸收的氨，因此這類微生物具有一定的生態學價值。稀釋涂布平板法統計土壤樣品中含有的這種微生物的數目
細菌
尿素
NH3
中性
堿性
酚紅顏色：
黃色
紫紅色
二、實驗目的:
1.使用以尿素為唯一氮源的培養基分離細菌(有脲酶)
2.通過指示劑（酚紅）顏色的變化檢知培養基pH的變化(脲酶催化的化學反應)
3.統計被檢測的土壤中含有的以尿素為氮源的微生物的數量
實驗中涉及到的一些問題：
哪些土壤中含有這種以尿素為氮源的微生物多？（選材的問題）
沒硬化，腐殖質豐富的土壤
(二)此實驗用到的選擇培養基必需含有哪些物質？
碳源、尿素、無機鹽、水、酚紅
可用什么指標認定不同土壤中選擇出的微生物對尿素分解能力的高低？
培養基紅色的深淺
（四）統計微生物的數量可用哪些方法？
稀釋涂布平板法，顯微鏡直接記數法
三、實驗中涉及到的一些問題：
（五）用稀釋涂布平板法計數時，菌落數在30-300（20以內）計數。
做一系列濃度梯度實驗，探究合適的稀釋度
在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性
（六）實驗設計要遵循的原則：
重復性原則
對照原則（排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗的可信度）
四、實驗用品和材料：
五、操作步驟：
１、制備無菌的ＬＢ固體培養基和尿素固體培養基
配制培養基
實驗組
對照組
倒平板：倒３個ＬＢ培養基，９個尿素固體培養基
制備一定濃度梯度的細菌懸液：１g土壤＋９９ml無菌水，振蕩，為１０２稀釋液，依次制備１０３、１０４、１０５的土壤稀釋液。
４、稀釋涂布分離法分離細菌：（無菌，0.1ml，玻璃刮刀）
５、培養觀察（倒置，３７度）
應從操作的各個細節保證“無菌”。例如，酒精燈與培養皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。
微
生
物
的
實
驗
室
培
養
培養基
無菌技術
分離、純化大腸桿菌
培養基的配制
配制培養基的原則
配制培養基的方法
計算→稱量→溶化→調pH→分裝→加棉塞→滅菌→倒平板
平板劃線法
稀釋涂布法
系列稀釋
平板涂布
LB培養基（1L）
蛋白胨：
10g
酵母粉：
5g
NaCl：
10g
瓊脂：
20g
尿素培養基（1L）
葡萄糖
10g
NaCl
4.8g
K2HPO4
4.8g
瓊脂
20g
酚紅
0.01g
尿素
80g

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