資源簡介

DNA的粗提取與鑒定
【課堂活動】
［基礎回顧］
一、實驗原理
1．DNA的溶解性
DNA和蛋白質等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點，選擇適當的鹽濃度（如2mol/L）就能使DNA充分溶解，而使雜質沉淀，或者相反(DNA在濃度為0.14mol/L的NaCl溶液中，溶解度最小)，以達到分離目的。
此外，DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質進一步的分離。
2．DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性
蛋白酶能水解蛋白質，但是對DNA沒有影響。大多數蛋白質不能忍受60—80oC的高溫，而DNA在80oC以上才會變性。洗滌劑能夠瓦解細胞膜，但對DNA沒有影響。
3．DNA的鑒定
在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色，因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。
二、實驗材料的選取
凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是使用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大，如雞血（原因：DNA含量豐富，材料易得，雞血細胞吸水易脹破）。若用動物組織如豬肝，則需研磨。
三、過程
1．破碎細胞，獲取含DNA的濾液
動物細胞的破碎比較容易，以雞血細胞為例，在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。如果實驗材料是植物細胞，需要先用洗滌劑溶解細胞膜。例如，提取洋蔥的DNA時，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。
注意：
①為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？
蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。
②加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？
洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
③如果研磨不充分，會對實驗結果產生怎樣的影響?
研磨不充分會使細胞核內的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實驗結果，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。
④此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細胞成分？
可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質。
去除濾液中的雜質
方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質，不分解DNA；方案三的原理是蛋白質和DNA的變性溫度不同。
注意：
①為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質？
用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質。
②方案二與方案三的原理有什么不同？
方案二是利用蛋白酶分解雜質蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質分開；方案三利用的是DNA和蛋白質對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質變性，與DNA分離（60～75℃的恒溫水浴保溫10～15min）。
DNA的析出與鑒定
將處理后的溶液過濾，加入與濾液體積相等、冷卻的酒精溶液，靜置2～3min，溶液中會出現白色絲狀物，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。
取兩支20ml的試管，各加入物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變藍。
四、注意事項
1．以血液為實驗材料時，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉防止血液凝固。
2．加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產生大量的泡沫，不利于后續步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
3．二苯胺試劑要現配現用，否則會影響鑒定的效果。
4．DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的關系：
當NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低；當NaCl溶液濃度高于0.14mol/L時，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。
5．盛放雞血細胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于細胞內DNA的含量本來就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會更少。因此，實驗過程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過程的DNA的損失。
［診斷檢測］
1.下列圖示中能反映DNA溶解度與NaCl溶液濃度之間關系的是：
2.在DNA粗提取的實驗過程中，得到的絲狀物主要成分就是DNA，
依據是
A．絲狀物易溶于2mol／L的氯化鈉溶液中
B．絲狀物溶解后，遇二苯胺(沸水浴)變藍色
C．絲狀物能在約為O．14mol／L氯化鈉溶液中析出
D．加酒精可使溶解的絲狀物再被析出
3.在“DNA的粗提取與鑒定”實驗中，向5mL血細胞液中加入20mL蒸餾水的目的是
A.使血細胞破裂
B.防止血液凝固
C.析出DNA
D.使蛋白質與DNA分離
4.在NaCl溶液中反復溶解、析出并過濾，就能除去DNA溶液中的雜質的理由不包括
(
)
A．用高濃度鹽溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質
B．用低濃度鹽溶液使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質
C．反復操作就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質
D．反復操作就能夠使各種雜質變性而沉淀析出
[典例引路]
在采用雞血為材料對DNA進行粗提取的實驗中，如果需要進一步提取雜質較少的DNA，可以依據的原理是(
)
A.在物質的量濃度為0.14
mol/L的氯化鈉溶液中DNA的溶解度最小
B.DNA遇二苯胺在沸水浴的條件下會變成藍色
C.DNA不溶于酒精而細胞中的一些物質易溶于酒精
D.質量濃度為0.1
g/mL的檸檬酸鈉溶液具有抗凝血作用
有關DNA粗提取的操作，錯誤的是
A．向溶解DNA的燒杯中加蒸餾水的目的是漂洗DNA
B．DNA和雜質分子在95%的冷酒精中溶解度存在差異
C．提取植物細胞DNA時需在研缽中加入洗滌劑和氯化鈉等試劑
D．提取動物細胞DNA時可用雞血與蒸餾水混合后用玻璃棒攪拌
[歸納總結]
1.雞血細胞的DNA提取
5.評價：觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多；二苯胺鑒定出現藍色說明實驗基本成功，如果不呈現藍色，可能所提取的DNA含量低，或是實驗操作中出現錯誤，需要重新制備
本實驗提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質
6.酒精的使用
①觀察花生種子子葉細胞脂肪顆粒時，用體積分數為50％的酒精洗去浮色
②葉綠體色素的提取和分離實驗中，用無水酒精作有機溶劑提取色素
③制作洋蔥根尖細胞裝片時，用鹽酸和酒精的混和液對根尖進行解離
④DNA粗提取過程中，用體積分數為95％的冷卻酒精可以進一步純化DNA
⑤70%的酒精用于消毒，如果酒的制作
[變式訓練]
（多選）下列DNA粗提取的實驗操作中，經離心或過濾后取上清液或濾液的有
A．在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉，混合均勻后離心
B．在盛有血細胞的塑料燒杯中加蒸餾水，快速攪拌后過濾
C．在2mol／L的氯化鈉溶液中放入絲狀物，輕輕攪拌后過濾
D．在溶有DNA的氯化鈉溶液中緩緩加入蒸餾水，輕輕攪拌后過濾
[當堂反饋]
1.下列關于
DNA
粗提取與鑒定的說法中，正確的是
A.析出
DNA
時要緩慢地加蒸餾水，當析出黏稠物時即不再加水
B.在探究洗滌劑對植物細胞
DNA
提取的影響實驗中，自變量是洗滌劑和食鹽
C.提取的
DNA
溶解后加入二苯胺試劑即可染成藍色
D.將含有
DNA
的濾液放在
60℃～75℃的恒溫水浴箱中保溫后過濾，能去除蛋白質雜質
2.（多）“DNA粗提取與鑒定”實驗中，將含有一定雜質的DNA絲狀物分別放入體積為2mL
的四種溶液中，經攪拌后過濾，獲得4種濾液，含DNA較少的是
1
蒸餾水中
攪拌后過濾
濾液E
2
2mol／L的NaCl溶液
攪拌后過濾
濾液F
3
O．14mol／L的NaCl溶液中
攪拌后過濾
濾液G
4
冷卻的95％的酒精溶液中
攪拌后過濾
濾液H
A．濾液E
B．濾液F
C．濾液G
D．濾液H
3.在DNA的粗提取與鑒定試驗中，有兩次DNA的沉淀析出，其依據的原理是
①DNA在NaCl的物質的量的濃度為O.1
4mol／L時，溶解度最低
②DNA在冷卻的體積分數為95％的酒精中能沉淀析出
A．兩次都是①
B．兩次都是②
C．第一次是①，第二次是②
D．第一次是②，第二次是①
4.（多選）有關DNA粗提取的操作，正確的是
A．盛放雞血細胞液的容器最好是塑料容器
B．將雞血細胞液與蒸餾水混合，用玻璃棒沿一個方向快速攪拌，釋放DNA
C．向溶解DNA的燒杯中加蒸餾水的目的是漂洗DNA
D．用漏斗和濾紙過濾析出的DNA，得到DNA粘稠物
5.在《DNA粗提取》實驗中，為得到含DNA的黏稠物，某同學進行了如下操作：
①在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉，經離心后，除去血漿留下血細胞備用。
②取5—10mL血細胞放入50mL的塑料燒杯中，并立即注入20mid．015mol／L的氯化鈉溶液，快速攪拌5min后經濾紙過濾，取得其濾液。
③濾液中加人40mL2mol／L的氯化鈉溶液，并用玻璃棒一個方向快速攪拌lmin。
④上述溶液中緩緩加人蒸餾水，同時用玻璃棒沿一個方向不停地輕輕攪拌，同時加蒸餾水，直到溶液中出現絲狀物為止，再進行過濾而得到含DNA的黏稠物。
實驗結果是：所得含DNA的黏稠物極少，導致下一步實驗無法進行。
請指出并改正該同學的實驗操作上的三個錯誤：(3分)
，
，
。
(2)按正確操作提取和過濾黏稠物后，再溶解黏稠物所用的溶劑為
(標明濃度)；提取含雜質較少的DNA的方法是
。
(3)鑒定DNA的試劑是
試劑，DNA鑒定時對照實驗的設置方法為
。(2分)
(4)采用牛或羊的血液做實驗，取材方便，但即使正確操作也無法提取到DNA，而用動物的肝臟組織作為實驗材料，實驗結果良好，原因是
，實驗中最好增加一步驟為
。
（10分）（1）0.015mol/L的氯化鈉溶液應改為蒸餾水；濾紙應改為紗布；直到溶液中出現絲狀物為止應改為直到溶液中絲狀物不再增加為止（每項1分）
（2）2mol/L的NaCl溶液
加入冷卻的、體積分數為95%的酒精
（3）二苯胺
向試管中只加0.015mol/L的NaCl溶液和二苯胺試劑，不加DNA，沸水浴
（4）哺乳動物成熟的紅細胞沒有細胞核
研磨
①提取雞血細胞的細胞核物質
將制備好的雞血細胞液5
mL～10mL，注入到50
mL燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水20
mL，同時用玻璃棒充分攪拌5
min，使血細胞加速破裂。然后，用放有紗布的漏斗將血細胞液過濾至500mL。取其濾液。
②溶解細胞核內的DNA
將氯化鈉的物質的量濃度為
2
mol/L
40mL加入到濾液中，并用玻璃棒沿一個方向攪拌1min，使其混合均勻，這時DNA在溶液中呈溶解狀態
③析出含DNA的粘稠物
沿燒杯內壁緩緩加入蒸餾水，同時用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時燒杯中有絲狀物出現，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續加入蒸餾水，溶液中出現的粘稠物會越來越多。當粘稠物不再增加時停止加入蒸餾水（這時溶液中氯化鈉的物質的量濃度相當于0.14
mol／L）
④濾取含DNA的粘稠物
用放有多層紗布的漏斗，過濾步驟3中的溶液至
500mL的燒杯中，含
DNA的粘稠物被留在紗布上
⑤將DNA的粘稠物再溶解
取
1個
50
mL燒杯，向燒杯內注入氯化鈉的物質的量濃度為
2
mol／L的溶液
20mL。用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃擇不停地攪拌，使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中
⑥過濾含有DNA的氯化鈉溶液
取1個100
mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過濾步驟5中的溶液。取其濾液，DNA溶于濾液中
⑦提取含雜質較少的DNA
在上述濾過的溶液中，加入冷卻的、酒精的體積分數為
95％的溶液
50mL（使用冷卻的酒精，對DNA的凝集效果較佳），并用玻璃棒攪拌，溶液中會出現含雜質較少的絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA
⑧
DNA的鑒定
2.實驗關鍵
(1)
取材不用哺乳動物的血細胞(
由于成熟紅細胞無細胞核)。
(2)獲取
DNA
時要向雞血細胞液加入足量的蒸餾水，以便使細胞膜和核膜破裂，把核內物質釋放出來。
(3)實驗中的攪拌，除最后一次攪拌外，其余攪拌均要朝一個方向。并且，在析出
DNA、DNA
再溶解和提取中，各步驟攪拌都要輕緩，玻璃棒不要直插燒杯底部，防止
DNA
分子斷裂。
3.此實驗過程中有幾次使用蒸餾水？幾次過濾，幾次析出，幾次攪拌？
答：整個實驗共“兩次蒸餾水，三次過濾，兩次析出”
①兩次蒸餾水
第一次：細胞吸水脹破
第二次：使
DNA黏稠物析出
②三次過濾
第一次：
DNA存在于濾液里
第二次：
DNA被留在紗布上
第三次：
DNA存在于濾液里
過濾時使用的紗布層數與需用濾液或黏稠物有關，第二次要用其濾出的黏稠物有關，所以要使用多層紗布，第一次和第三次均要用其濾液，使用的紗布為1－2層
③兩次析出
第一次：用0.14
mol／L
的NaCl溶液,含雜質多
第二次：用冷卻的95％的酒精
4.預冷的酒精溶液具有的優點
①抑制核酸水解酶活性，防止
DNA
降解。
②降低分子運動易于形成沉淀析出。
③低溫有利于增加
DNA
分子柔韌性，減少斷裂。

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