資源簡介

課　　題
2.1微生物的實驗室培養
備課時間
上課時間
總課時數
課程目標
知識與技能
了解有關培養基的基礎知識；掌握培養基的制備、高壓蒸汽滅菌和平板劃線法等基本操作技術
過程與方法
分析實驗思路的確定和形成的原因，分析實驗流程，對比前面的實驗設計，歸納共性，分析差異，增加印象
情感態度與價值觀
形成勇于實踐、嚴謹求實的科學態度和科學精神
教學重點
無菌技術的操作
教學難點
無菌技術的操作
教學過程
一、情境導入在傳統發酵技術的應用中，都利用了微生物的發酵作用，其中的微生物來自于制作過程中的自然感染。而在工業化生產中，為了提高發酵的質量，需要獲得優良菌種，并保持發酵菌種的純度。這就要涉及到微生物的培養、分離、鑒別等基本技術。現在我們開始學習微生物的培養和應用專題。二、授新課1．基礎知識1．1
培養基的種類包括
固體
培養基和
液體
培養基等。〖思考1〗瓊脂是從紅藻中提取的
多糖
，在配制培養基中用作為
凝固劑
。【補充】培養基的類型及其應用：1．2
培養基的化學成分包括
水
、
無機鹽
、
碳源
、
氮源
四類營養成分。〖思考2〗從細胞的化學元素組成來看，培養基中為什么都含有這些營養成分？C、H、O、N、P、S是構成細胞原生質的基本元素，約占原生質總量的97％以上。【補充】碳源：如CO2、糖類、脂肪酸等有機物，構成微生物的結構物質和分泌物，并提供能量。氮源：如N2、氨鹽、硝酸鹽、牛肉膏、蛋白胨等，主要用來合成蛋白質、核酸及含氮代謝物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作為碳源，又可以作為氮源，如氨基酸等。1．3
培養基除滿足微生物生長的
pH
、
特殊營養物質
和
氧氣
等要求。【補充】生長因子：某些微生物正常生長代謝過程中必須從培養基中吸收的微量有機小分子，如某些氨基酸、堿基、維生素等。〖思考3〗牛肉膏和蛋白胨主要為微生物提供
糖
、
維生素
和
有機氮
等營養物質。〖思考4〗培養乳酸桿菌時需要添加
維生素
，培養霉菌時需要將培養基pH調節為
酸性
，培養細菌時需要將pH調節為
中性或微堿性
。活動2：閱讀“無菌技術”，討論回答下列問題：1．4
獲得純凈培養物的關鍵是
防止外來雜菌的入侵
。1．5
無菌技術包括：（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行
清潔和消毒
；（2）將培養器皿、接種用具和培養基等器具進行
滅菌
；（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應在
酒精燈火焰附近
旁進行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與
周圍物品
相接觸。1．6
比較消毒和滅菌（填表）〖思考5〗無菌技術除了防止培養物被污染外，還具有的目的是
防止感染實驗操作者
。1．7
消毒方法：（1）日常生活經常用到的是
煮沸
消毒法；（2）對一些不耐高溫的液體，則使用
巴氏
消毒法（作簡要介紹）；（3）對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑
石炭酸或煤酚皂
等溶液以增強消毒效果，然后使用
紫外線
進行物理消毒。（4）實驗操作者的雙手使用
酒精
進行消毒；（5）飲水水源用
氯氣
進行消毒。1．8滅菌方法：（1）接種環、接種針、試管口等使用
灼燒
滅菌法；（2）玻璃器皿、金屬用具等使用
干熱
滅菌法，所用器械是
干熱滅菌箱
；（3）培養基、無菌水等使用
高壓蒸汽
滅菌法，所用器械是
高壓蒸汽滅菌鍋
。（4）表面滅菌和空氣滅菌等使用
紫外線
滅菌法，所用器械是
紫外燈
。〖思考6〗對接種環滅菌時要用酒精燈的
充分燃燒
層火焰灼燒可能伸入試管或培養皿的部位。〖思考7〗利用干熱滅菌箱對玻璃器皿滅菌時物品不能擺得太擠，目的是避免妨礙熱空氣流通。〖思考8〗物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開排氣閥，煮沸并排除鍋內冷空氣，其目的是
有利于鍋內溫度升高
；隨后關閉排氣閥繼續加熱，氣壓升至
100k
Pa，溫度為
121℃
，并維持
15～30
min；最后切斷熱源，使溫度自然降溫，氣壓務必降至
零
時打開鍋蓋，其目的是防止
容器中的液體暴沸
。【補充】培養基的配制原則：①目的要明確：根據培養的微生物種類、培養的目的等確定培養基的類型和配制量。②營養要協調：培養基中各種營養物質的濃度和比例要適宜。例如：碳氮比4∶1時，谷氨酸棒狀桿菌大量繁殖而產生谷氨酸少；碳氮比為3∶1時，菌體繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。③pH要適宜：細菌培養基pH中性或偏堿性，霉菌培養基呈酸性。2．實驗操作2．1
計算：根據配方比例，計算100mL培養基各成分用量。2．2
稱量：準確稱取各成分。稱取牛肉膏和蛋白胨時動作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空氣中水分。2．3
溶化：①加水加熱熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化鈉繼續加熱；③加入瓊脂；④用蒸餾水定容到100mL。整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。2．4
調pH：用1mol/LNaOH溶液調節pH至偏堿性。2．5
滅菌：將配制好的培養基轉移到錐形瓶中，加塞包扎后用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌；所用培養皿用報紙包扎后用干熱滅菌箱滅菌。2．6
倒平板：待培養基冷卻至50℃左右時在酒精燈火焰附近操作進行。其過程是：①在火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞；②右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰；③左手將培養皿打開一條縫隙，右手將培養基倒入培養皿，立刻蓋上皿蓋。④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。〖思考1〗錐形瓶的瓶口通過火焰的目的是消滅瓶口的雜菌，防止雜菌感染培養基。〖思考2〗倒平板的目的是防止培養基冷卻過程中形成的水滴落到培養基表面。〖思考3〗若皿蓋和皿底之間粘有培養基，則該平板能否培養微生物？為什么？不能。空氣中雜菌會在這些粘附培養基上繁殖，并污染皿內培養基。〖思考4〗配制斜面培養基中，試管要加塞棉塞的目的是保持通氣并防止雜菌感染。〖思考5〗試管培養基形成斜面的作用是增大接種面積。2．7
接種2．7．1微生物接種的最常用方法是平板劃線法和稀釋涂布法，另外還有穿刺接種和斜面接種等。2．7．2平板劃線法：通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。其操作步驟是：①將接種環在酒精燈火焰上灼燒直至燒紅。②在酒精燈火焰旁冷卻接種環，并打開大腸桿菌的菌種試管的棉塞。③將菌種試管口通過火焰達到消滅試管口雜菌的目的。④將冷卻的接種環伸入到菌液中取出一環菌種。⑤將菌種試管口再次通過火焰后塞上棉塞。⑥將皿蓋打開一條縫隙，把接種環伸入平板內劃3～5條平行線，蓋上皿蓋，不要劃破培養基。⑦灼燒接種環，冷卻后從第一區劃線末端開始向第二區域內劃線。重復上述過程，完成三、四、五區域內劃線。注意不要將第五區的劃線與第一區劃線相連。⑧將平板倒置放在培養箱中培養。〖思考6〗取菌種前灼燒接種環的目的是消滅接種環上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環的目的是消滅接種環上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環冷卻后進行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環的目的是防止細菌污染環境和操作者。〖思考7〗在第1次劃線后都從上次劃線末端開始的目的是獲得由單個細菌形成的標準菌落。2．7．3　稀釋涂布平板法：將菌液進行一系列梯度稀釋，并將不同稀釋度菌液分別涂布到瓊脂固體培養基上進行培養。當稀釋倍數足夠高時，即可獲得單個細菌形成的標準菌落。2．7．4　系列稀釋操作：①取盛有9mL水的無菌試管6支，編號101、102、103、104、105、106。②用灼燒冷卻的移液管吸取1mL菌液注入編號為101試管中，并吹打3次，使之混勻。③從101倍液中吸取1mL菌液注入到編號為102試管內吹打均勻，獲得102倍液。依此類推。〖思考8〗操作中試管口和移液管應在離火焰1～2cm處。整個操作過程中使用了1支移液管。3．結果分析與評價3．1　培養未接種培養基的作用是對照，若有菌落形成，說明培養基滅菌不徹底。3．2　在肉湯培養基上，大腸桿菌菌落呈白色，為圓形，光滑有光澤，邊緣整齊。3．3　培養12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是時間越長，菌落中細菌繁殖越多，菌落體積越大；菌落的位置不動，但菌落數增多。〖思考9〗在某培養基上出現了3種特征不同的菌落，原因有培養基滅菌不徹底或雜菌感染等。〖思考10〗頻繁使用的菌種利用臨時保藏法保存，長期保存菌種的方法是甘油管藏法。前者利用固體斜面培養基培養后，保存在4℃冰箱中，每3～6個月轉種培養一次，缺點是保存時間較短，容易發生污染和變異；后者將菌種與無菌體積等量混合后保存在－20℃冷凍箱中。
碳源；NaHC
O3，可作為自養型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面對發酵工程中滅菌的理解不正確的是A.防止雜菌污染
B.消滅雜菌C.培養基和發酵設備都必須滅菌
D.滅菌必須在接種前解析：滅菌是微生物發酵過程的一個重要環節。A說的是滅菌的目的，因為發酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為與發酵有關的所有設備和物質都要滅菌；發酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。答案：B四、課堂小結教學后記：本節課可以通過生產實例導入，使學生認識在微生物的培養過程中，保持培養物純凈的重要性。在課堂上可以跳出教材，充分發揮學生的主動性，讓學生收集列舉更多的生產生活中的實例，從中體會培養物純凈的重要性。當時由于微生物的微觀性和危害性，一定要教育學生培養良好的衛生習慣。
標準
培養基類型
配制特點
主要應用
物理性質
固體培養基
加入瓊脂較多
菌種分離,鑒定,計數
半固體培養基
加入瓊脂較少
菌種保存
液體培養基
不加入瓊脂
工業生產，連續培養
化學組成
合成培養基
由已知成分配制而成，培養基成分明確
菌種分類、鑒定
天然培養基
由天然成分配制而成，培養基成分不明確
工業生，產降低成本
目的用途
鑒別培養基
添加某種指示劑或化學藥劑
菌種的鑒別
選擇培養基
添加（或缺少）某種化學成分
菌種的分離
比較項
理化因素的作用強度
消滅微生物的數量
芽孢和孢子能否被消滅
消毒
較為溫和
部分生活狀態的微生物
不能
滅菌
強烈
全部微生物
能
微生物的實驗室培養
培養基
無菌技術
純化大腸桿菌
培養基的配制
配制培養基的原則
配制培養基的方法
計算→稱量→溶化→調pH→分裝→加棉塞→滅菌→倒平板
平板劃線法
稀釋涂布法
系列稀釋
平板涂布
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