資源簡介

1164590012052300通過“PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定” 實驗
培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)思維和探究能力
一、使用教材及內(nèi)容分析
浙江科學(xué)技術(shù)出版社高中《生物學(xué)選修1生物技術(shù)實踐》第四部分實驗13《DNA片段的PCR擴增》，適用于高二年級。
2017版《高中生物學(xué)課程標準》中，要求學(xué)生“闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細胞和目的基因及其表達產(chǎn)物的檢測鑒定等步驟”。建議開展“利用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增DNA片段并完成電泳鑒定”的實驗活動。
本實驗有助于學(xué)生理解PCR反應(yīng)的原理，掌握PCR和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，認同現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用價值，培養(yǎng)學(xué)生運用數(shù)學(xué)方法探究生物學(xué)問題的能力，提高核心素養(yǎng)，因而是十分重要的內(nèi)容。
基于北京四中高中部的分子生物學(xué)實驗室，擁有PCR儀、凝膠電泳成像等先進教學(xué)設(shè)備；且本校的學(xué)生學(xué)習(xí)能力較強、求知欲高,對現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)非常感興趣，會以積極認真的態(tài)度參與實驗過程。因此，我校開設(shè)本實驗多年。
二、實驗器材
PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備（含梳子、膠盒、水平電泳槽和電泳儀電源）、微量移液器及槍頭、微量離心管、培養(yǎng)皿、三角瓶、封口膜、橡皮筋、冰盒、記號筆、三腳架、微波爐或水浴鍋（槍頭、微量離心管使用前需進行高壓蒸汽滅菌）。
材料：食用高活性干酵母（釀酒酵母）。
PCR相關(guān)試劑
（以下溶液在-20℃條件下冷凍保存，課前放于冰盒內(nèi)或冰塊上）
市售10×擴增緩沖液(含Mg2+)、市售 10 mmol/L 4種脫氧核苷三磷酸（dNTP）、市售 2 U/μL Taq DNA 聚合酶、10μmol/L引物A溶液：序列為5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’、10μmol/L引物B溶液：序列為5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’、無菌水。
電泳相關(guān)試劑
Tris-硼酸（TBE）電泳緩沖液：取20 mL市售50×電泳緩沖液,加蒸餾水980 mL、市售6×上樣緩沖液（loading buffer）、市售DNA標準溶液（Marker）。
染色相關(guān)試劑
0.1% 亞甲基藍溶液（稱取0.1 g 亞甲基藍溶于100 mL 蒸餾水中，避免接觸皮膚和眼睛,避光保存）、75% 乙醇、藏于4℃冰箱的蒸餾水。或使用0.002% 亞甲基藍溶液（將2 mL 的0.1% 亞甲基藍溶液加入10 mL電泳緩沖液中,再加88 mL蒸餾水，避光保存）。
其他資料準備：教師進行預(yù)實驗，錄制示范操作的特寫視頻并拍攝實驗操作和結(jié)果的照片，編寫并印發(fā)實驗講義。
三、實驗改進要點
本實驗選用的實驗材料是市售的λ噬菌體DNA或大腸桿菌，前者較為昂貴，后者需進行培養(yǎng)。該實驗流程約為3課時，其中的電泳和染色需安排2節(jié)課連堂，教師調(diào)課有困難。此外，課本對實驗數(shù)據(jù)的處理沒有具體要求，通過實驗培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)思維的預(yù)期目標也難以實現(xiàn)。
針對以上問題，筆者在近年來的教學(xué)實踐中逐步對該實驗進行了些許探索：以易于取得和培養(yǎng)的酵母菌為實驗材料，對其部分rDNA片段進行PCR擴增和凝膠電泳。縮短電泳及染色的時間，提供替換的染色方法，不僅能夠節(jié)約1課時，還能獲得理想的實驗效果。進一步運用數(shù)學(xué)方法分析實驗結(jié)果中蘊含的信息，實施STEM教學(xué)。將原本的驗證性實驗轉(zhuǎn)化為探究性實驗，從而培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維，達到預(yù)期教學(xué)效益。具體改進如下：
表1 實驗改進前后對比表
課本中實驗操作
嘗試性實驗探索
PCR
擴增λ噬菌體DNA片段或大腸桿菌的16S rDNA片段
改進1:PCR擴增酵母細胞的核糖體DNA部分片段
①以酵母菌為實驗材料
②采用新引物，擴增核糖體DNA部分片段
③設(shè)計PCR反應(yīng)體系
④摸索PCR反應(yīng)條件
凝膠電泳
電泳40 min
改進2:縮短凝膠電泳時間
電泳 25 min
染色
①用10 mL 0.1%亞甲基藍液覆蓋凝膠表面15~20 min；②加入5 mL 70%乙醇脫色1~2 min；③加入冷水，幾分鐘后看到條帶。
改進3:優(yōu)化染色方案
方案1：①加入0.1%亞甲基藍溶液沒過凝膠約5 mm，染色8 min；②加入75%乙醇沒過凝膠約5 mm，脫色1~1.5min；③加入冷蒸餾水脫色
方案2：倒入0.002% 亞甲基藍溶液沒過凝膠約5 mm，4℃冷藏過夜。
實驗結(jié)果
觀察DNA條帶的位置和寬度
改進4：運用數(shù)學(xué)方法深入分析實驗結(jié)果中蘊含的信息
①用直尺測量并記錄每個DNA條帶遷移距離
②借助半對數(shù)坐標紙?zhí)骄緿NA片段長度與遷移距離的關(guān)系，估計PCR產(chǎn)物大小
③使用條帶更多的Marker驗證上述實驗結(jié)果
④運用Excel繪制半對數(shù)曲線圖精確計算PCR產(chǎn)物大小并驗證DNA片段長度與遷移距離的關(guān)系
以上4項創(chuàng)新在教學(xué)過程中的具體應(yīng)用，以★在后文標出。
四、實驗原理
聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction），簡稱為PCR技術(shù)，是一種體外擴增特定基因或DNA序列的技術(shù)，經(jīng)過多次循環(huán)變性、退火、延伸三個步驟，可獲得大量的目的基因或DNA片段，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、法醫(yī)鑒定、古生物學(xué)研究等方面。
電泳是指帶電粒子在電場作用下，向與其攜帶電荷相反的電極遷移的過程，是分離、鑒定、純化核酸和蛋白質(zhì)的常用方法。本實驗以瓊脂糖凝膠為介質(zhì)進行電泳。核酸是帶有負電的生物大分子，在電場作用下會向正電極遷移。在電場強度一定時，核酸分子越大遷移速率越慢。DNA片段根據(jù)長度大小在凝膠上分開，形成不連續(xù)的條帶，每個條帶包含的DNA片段長度是相同的。
亞甲基藍（又名“亞甲藍”）可以將無色的DNA染成藍色，且基本無毒。通過使用亞甲基藍對瓊脂糖凝膠進行染色，再用75%的乙醇和蒸餾水進行脫色，就可以觀察到瓊脂糖凝膠中DNA條帶的具體位置。
五、實驗教學(xué)目標
（一）知識與技能：簡述PCR反應(yīng)、凝膠電泳鑒定的原理與應(yīng)用。嘗試獨立完成運用PCR技術(shù)擴增DNA片段并用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測的基本操作。
（二）過程與方法：運用已學(xué)的生物學(xué)知識，結(jié)合科學(xué)史材料，推理PCR實驗原理；獨立操作實驗并運用繪圖、建模、軟件分析等數(shù)學(xué)方法深入分析實驗結(jié)果，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維和探究能力。
（三）情感、態(tài)度、價值觀：認同由揭示科學(xué)概念到技術(shù)應(yīng)用，是很多科學(xué)家艱苦努力工作的結(jié)果；認同現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用價值。
六、實驗教學(xué)內(nèi)容
本實驗的教學(xué)內(nèi)容主要包括實驗原理的解析、實驗操作的組織和實驗結(jié)果分析。實驗原理主要包括PCR反應(yīng)原理、電泳和染色原理。實驗操作涵蓋了PCR擴增（實驗材料的準備、配制反應(yīng)體系、PCR擴增）、電泳（制備凝膠、制備樣品、加樣、跑電泳）、染色（亞甲基藍染色、脫色）的操作。實驗分析包括實驗現(xiàn)象的觀察與交流，運用數(shù)學(xué)方法深入分析實驗結(jié)果中蘊含的信息（測量DNA條帶遷移距離，繪圖探究DNA片段長度與遷移距離的關(guān)系并據(jù)此推測PCR產(chǎn)物長度，使用不同Marker相互驗證，運用Excel繪圖精確計算并驗證）。從而將STEM（科學(xué)、技術(shù)、工程和數(shù)學(xué)）教育與學(xué)科教學(xué)融合，引導(dǎo)學(xué)生解決來自社會、生產(chǎn)和生活的生物學(xué)問題。
七、實驗教學(xué)過程
本實驗安排２課時，非連堂。第1課時，課前指導(dǎo)學(xué)生課前準備實驗材料，課上解析實驗原理，組織PCR實驗操作。第2課時，課前指導(dǎo)學(xué)生制備凝膠，課上組織凝膠電泳和染色的操作，在等待的時間穿插進行實驗結(jié)果觀察和分析的教學(xué)。
圖1 教學(xué)流程圖
（圖中斜體字代表實驗創(chuàng)新的地方）
（一）解析實驗原理
1. 引導(dǎo)學(xué)生類比分析PCR反應(yīng)原理，并介紹其應(yīng)用
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)概念教學(xué)過程設(shè)計和教學(xué)模式選擇的思路大體如下：
圖2 PCR概念的教學(xué)過程和模式圖解
組織的學(xué)生活動如下：
① 展示犯罪現(xiàn)場的圖片，一把匕首上的血跡中DNA含量很少，不夠進行檢驗。引導(dǎo)學(xué)生思考如何獲得大量的DNA樣品呢？導(dǎo)入核心概念：體外DNA復(fù)制——PCR。
② 教師出示體內(nèi)DNA復(fù)制的圖片，促使學(xué)生在回憶細胞內(nèi)DNA復(fù)制條件的基礎(chǔ)上，類比推斷體外DNA復(fù)制所需的條件——模板、原料、能量、酶和引物等，進而教師加以認定并以表格形式落實板書如下（括號中的內(nèi)容在后續(xù)的課堂教學(xué)中逐步進行完善）
表2 體內(nèi)復(fù)制與體外復(fù)制條件對比表

體內(nèi)DNA復(fù)制
體外DNA復(fù)制
模板
DNA分子
√
原料
dNTP
√
酶
解旋酶
×

聚合酶
√（Taq酶）

連接酶
×

引發(fā)酶
×
引物
RNA引物
√（DNA引物）
③ 引導(dǎo)學(xué)生從科技史料中體驗PCR技術(shù)發(fā)展過程。 ⑴1957年科恩伯格因發(fā)現(xiàn)并提取大腸桿菌DNA聚合酶（最適溫度為37℃ ）時，曾探討用此酶在體外進行DNA復(fù)制的可能性，因此獲1959年諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎。⑵1968年科拉納因破譯遺傳密碼而獲諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎，期間引導(dǎo)學(xué)生體外合成短鏈DNA（引物）技術(shù)，1971年其實驗室研究員提出PCR技術(shù)的基本原理。
④ 簡略介紹穆利斯的生平。展示讓穆利斯得到靈感的夜間高速公路的照片，并描述當時情景：1983年的一個夜晚，穆利斯開車回家，加州公路上兩排路燈和相對行使的車輛讓他感到似曾相識。然后，啟發(fā)學(xué)生結(jié)合DNA復(fù)制方式與公路上下車道上車輛相對行駛的情景進行聯(lián)想：⑴兩排路燈猶如DNA的雙鏈；⑵反向行駛車輛像是DNA聚合酶，面對面地合成著單鏈DNA；⑶公路兩端在綠燈處起步的兩輛車恰似兩個引物。在學(xué)生聯(lián)想和小組討論的基礎(chǔ)上，教師繪制板圖向?qū)W生介紹穆利斯最初的PCR設(shè)想，以及簡要介紹蘭德爾?才木，亨利???厄利克，史蒂文?沙夫等人為PCR技術(shù)日趨成熟的貢獻。
⑤ 先引導(dǎo)學(xué)生思考：高溫使DNA雙鏈分開時，會破壞那種生物大分子？帶領(lǐng)學(xué)生分析出：從大腸桿菌中提取的DNA聚合酶在高溫下易失活，使得DNA每次復(fù)制都需要加入新酶。結(jié)果不僅操作復(fù)雜，而且價格非常昂貴。然后，教師展示黃石熱泉生態(tài)系統(tǒng)圖并講述Taq酶發(fā)現(xiàn)史：⑴1969年美國微生物學(xué)家托馬斯?布洛克就在黃石公園發(fā)現(xiàn)了生長于70-75℃ 的水生嗜熱菌。⑵1976，華裔女科學(xué)家錢嘉韻從Thermus Aquaticus成功分離出嗜熱DNA聚合酶。這種酶被命名為Taq DNA聚合酶,最適溫度為72℃。⑶1985年成功純化后，開始應(yīng)用于PCR。因其耐熱性強，特異性高，擴增片段長，使得PCR技術(shù)具有真正的實踐意義，標志著PCR技術(shù)的成功。
⑥啟發(fā)學(xué)生根據(jù)PCR技術(shù)史話，猜想PCR反應(yīng)過程的大體步驟，設(shè)定每步反應(yīng)的溫度。播放《PCR原理》錄像，或者教師可結(jié)合向?qū)W生闡述PCR技術(shù)原理的基本要點。最后，師生共同以板書形式概括PCR技術(shù)原理。
⑦教師介紹PCR在法醫(yī)、親子鑒定、分析遠古DNA、醫(yī)療上的應(yīng)用。使學(xué)生理解PCR定向擴增功能，為進一步學(xué)習(xí)“基因工程”獲取目的基因打下基礎(chǔ)，同時促使學(xué)生認同生物科學(xué)技術(shù)的價值。
⑧引導(dǎo)學(xué)生簡略回顧PCR技術(shù)原理，思考并討論：1993年，穆利斯因發(fā)明PCR獨享諾貝爾化學(xué)獎。PCR的原理很簡單，為什么穆利斯之前的科學(xué)家都沒有嘗試呢？從PCR概念生成到技術(shù)應(yīng)用，僅穆利斯一個人就能完成么？教師提供科學(xué)史資料并組織學(xué)生討論，學(xué)生通過討論達成共識：認同勇于思考、大膽嘗試對科學(xué)研究的重要意義；科學(xué)概念的提出到實際技術(shù)的應(yīng)用，是很多科學(xué)家艱苦努力工作的結(jié)果；科學(xué)技術(shù)的發(fā)展能夠極大地推動社會的生產(chǎn)力。
2. 講解凝膠電泳及染色觀察原理
教師結(jié)合模式圖，說明電泳的定義、瓊脂糖凝膠電泳的化學(xué)成分及其作用、和加樣孔等基本概念。引導(dǎo)學(xué)生思考：什么樣的DNA分子在凝膠中遷移得快？從而歸納總結(jié)出電泳的原理。并介紹凝膠電泳是分離、鑒定、純化核酸和蛋白質(zhì)的常用方法。然后，以Marker 2000和Marker 5000為例，講解DNA標準溶液（marker）的作用，為后續(xù)教學(xué)過程中使用這兩種marker進行探究埋下伏筆。
然后，向?qū)W生闡明亞甲基藍的染色原理以及優(yōu)點：無毒、結(jié)果肉眼可見、染色結(jié)果穩(wěn)定。

Trans2000 Trans5000
圖3 電泳原理示意圖 圖4 Marker電泳結(jié)果照片
(二)組織實驗操作
1. PCR擴增
①學(xué)生課前準備實驗材料。學(xué)生課前制備酵母細胞懸液，課上結(jié)合教師拍攝的示范視頻講解操作要點：稱取0.1 g 干酵母粉，放于盛有100 mL無菌水的三角瓶中，蓋上封口膜用皮筋綁好，搖勻后在溫暖環(huán)境下活化2小時即可。
②制備PCR反應(yīng)體系并擴增。每4位學(xué)生1組，共用1個冰盒，制備1個PCR反應(yīng)體系。在微量離心管上做好標記后，離心后放入PCR儀進行擴增。
教師提示學(xué)生以下操作要點：使用微量移液器將PCR反應(yīng)體系（見表3）各成分加入到0.2 mL已滅菌的微量離心管中。注意，不可加入過多酵母，否則細胞壁會影響PCR效果；且酵母細胞懸液需搖勻后再吸取。反復(fù)吹吸使反應(yīng)液混合均勻，以3000轉(zhuǎn)/min 的轉(zhuǎn)速離心30 s,使反應(yīng)液集中于微量離心管的底部。將微量離心管放入PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)條件如圖5。擴增后的PCR產(chǎn)物可貯存于-20℃冰箱中。
表3 改進后的PCR反應(yīng)體系配方

圖5 改進后的PCR反應(yīng)條件流程圖
★改進1：PCR擴增酵母細胞的核糖體DNA（rDNA）部分片段。
將實驗材料改為超市購買的食用高活性干酵母（釀酒酵母）。相較于噬菌體或大腸桿菌，酵母菌不僅更加便宜、安全、實驗準備過程也更加簡單。
酵母細胞中編碼核糖體18S rRNA、5.8S rRNA、25S rRNA的3個DNA序列，中間相隔2個內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer），簡稱ITS。成熟的核糖體RNA中不包括ITS序列，因此自然選擇壓力較小，能容忍更多變異。本實驗使用真菌通用ITS引物（ITS1引物和ITS4引物）擴增5.8S rDNA及其兩端的2個ITS的全部序列，以及相鄰的18S rDNA和25S rDNA的部分序列，總長度為841 bp。
選擇這段DNA進行教學(xué)是因為PCR擴增ITS序列，可以鑒定病原真菌，篩選釀酒的酵母菌株，還可以通過測序和比對不同物種的序列建立進化樹，體現(xiàn)了PCR技術(shù)在醫(yī)療、工業(yè)和進化研究上的應(yīng)用價值。ITS序列拷貝數(shù)高，長度多在1000 bp以內(nèi)，容易被PCR擴增出來。此外，筆者根據(jù)教學(xué)實際，經(jīng)過多次嘗試，設(shè)計了適于教學(xué)的PCR反應(yīng)體系和條件。
圖6 核糖體DNA部分片段示意圖
2. 電泳
①學(xué)生課前制備凝膠。指導(dǎo)學(xué)生課前制備凝膠，課上學(xué)生結(jié)合教師拍攝的制備凝膠的示范視頻講解操作要點：稱取瓊脂糖0.25 g加到盛有25 mL電泳緩沖液的三角瓶中。蓋上封口膜并用橡皮筋綁住；用微波爐加熱1 min，使瓊脂糖熔化呈透明；倒入膠盒。注意避免產(chǎn)生氣泡。待凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，將其從膠盒中取出，放入電泳槽內(nèi)，加樣孔一端朝向負極。向電泳槽中加入電泳緩沖液，并沒過凝膠。
②加樣。 教師展示加樣模式圖和特寫照片說明加樣孔位置，結(jié)合示范錄像講解制備樣品和加樣的操作要點：用微量移液器向50μL PCR產(chǎn)物中加入10μL 6×上樣緩沖液，并反復(fù)吹吸混合均勻，再吸取10μL樣品混合液緩慢加到加樣孔內(nèi)。注意，每加樣1次需更換1個槍頭。盡量避免使用最外側(cè)的加樣孔，其染色效果有時不理想。
教師在示范操作，在每塊凝膠上加樣10μL DNA marker。學(xué)生4人1組制備樣品，每個樣品混合液可供6人加樣，每人至少獨立完成加樣1次。全班學(xué)生分為2大組，同時在2塊凝膠上依次加樣。
③跑電泳。教師邊操作，邊向?qū)W生講解：蓋上電泳槽蓋，連接好電極插頭后再接通電源。將直流電泳儀電源的電壓設(shè)置成80 V，電泳25 min。注意觀察溴酚藍不要遷移出凝膠。
★改進2:縮短凝膠電泳時間。教材上是80V電壓下電泳40分鐘，現(xiàn)壓縮到25分鐘亦可看到PCR產(chǎn)物和Marker的條帶。
3. 染色
教師結(jié)合染色示范錄像的播放，講解染色要點。學(xué)生分2組，對2塊凝膠進行染色。
★改進3:優(yōu)化染色方案。
教材中的3步染色法，操作時間較長。筆者通過反復(fù)地實踐過程，提出兩種可行的染色方案，既確保實驗效果理想，又順應(yīng)教師的排課不同需求。
染色方案1：壓縮并改進3步染色法：將染色時間從“15～20 min”壓縮為“8 min”， 將“染液覆蓋凝膠”改為“沒過凝膠約5 mm”。從而，1課時完成電泳和染色，比原有方案減少了1課時，同時染色結(jié)果十分清晰。具體方法是：⑴將凝膠放入培養(yǎng)皿里，倒入0.1% 亞甲基藍溶液沒過凝膠約5 mm，染色8 min。輕輕晃動培養(yǎng)皿，讓染液進入凝膠下表面與培養(yǎng)皿之間，不要留有氣泡。染色后回收染液，染液需避光保存。⑵倒入75%乙醇沒過凝膠約5 mm，不斷晃動培養(yǎng)皿1 ～1.5 min。再倒去乙醇。⑶加入冷的蒸餾水進行脫色，當出現(xiàn)清晰的藍色區(qū)帶時，倒去蒸餾水終止脫色。此過程中可更換被染藍的蒸餾水。此外，凝膠在蒸餾水中不宜浸泡過久，否則條帶顏色變淡直至無色。
染色方案2：將染色步驟簡化為1步，染色效果仍很好。教師可利用剩余時間講解觀察實驗現(xiàn)象的時間和方法，由于亞甲基藍的染色效果較為穩(wěn)定，可組織學(xué)生利用次日的課余時間觀察實驗結(jié)果。具體方法是：向盛有凝膠的培養(yǎng)皿中倒入0.002% 亞甲基藍溶液，并沒過凝膠約5 mm。輕輕晃動培養(yǎng)皿，讓染液進入凝膠下表面與培養(yǎng)皿之間。蓋上培養(yǎng)皿蓋，4℃冷藏過夜。第二天觀察經(jīng)過染色處理的凝膠板，看到清晰的藍色區(qū)帶后，倒去染液，終止染色。

A. 使用Marker 2000 B.使用Marker 5000
圖7 改進后染色結(jié)果照片 圖8改進前染色結(jié)果照片
（三）引導(dǎo)觀察并分析實驗結(jié)果
為了有效利用課堂時間，教師利用等待電泳和染色的時間引導(dǎo)學(xué)生推測實驗結(jié)果，然后出示2塊課前準備的預(yù)實驗?zāi)z，驗證學(xué)生的推測。然后，將學(xué)生分為2組，分別觀察并分析這2塊使用不同Marker的凝膠，獲得的結(jié)論可互為驗證。學(xué)生課下再運用課上習(xí)得的分析方法分析自己的實驗結(jié)果。
1.觀察DNA條帶的位置和寬度
教師結(jié)合示范照片，講解觀察的要點：學(xué)生觀察凝膠板上呈現(xiàn)的DNA時，可先在桌上鋪1張白紙，在光下手持盛有凝膠的培養(yǎng)皿距白紙5 cm以上，找到較為清晰的區(qū)帶。再將凝膠置于平的透明玻璃板上，放在三腳架上面進行觀察和手機拍照。在觀察的同時，可在實驗報告單上繪制草圖，標出DNA藍色區(qū)帶的數(shù)目和位置。

圖9 手持培養(yǎng)皿進行觀察 圖10 將凝膠放在玻璃板上觀察
使用Marker 2000 使用Marker 5000
圖11 教師預(yù)實驗結(jié)果局部照片
本實驗中，染色凝膠板上呈現(xiàn)的清晰藍色條帶，即為DNA所在位置。PCR產(chǎn)物的長度介于800～1000 bp 之間。
2. 實驗結(jié)果分析 （★改進4：運用數(shù)學(xué)方法分析實驗結(jié)果中蘊含的數(shù)據(jù)）
在實驗教學(xué)活動中，引導(dǎo)學(xué)生通過分析實驗數(shù)據(jù)得出結(jié)論，是進行科學(xué)思維訓(xùn)練的最好方式。但以往教學(xué)過程中，僅提示學(xué)生通過對比Marker條帶估出PCR產(chǎn)物的大致長度，卻忽略了3個問題：PCR產(chǎn)物條帶位于2條Marker條帶之間，應(yīng)該如何科學(xué)地估值？估測PCR產(chǎn)物長度只用到了Marker的1個或2個條帶，丟棄了Marker其它條帶中所蘊含的寶貴信息，應(yīng)如何科學(xué)地分析實驗數(shù)據(jù)？DNA片段長度的對數(shù)與遷移距離呈反比，應(yīng)如何處理與對數(shù)相關(guān)的實驗數(shù)據(jù)？在學(xué)科教研活動中老師們普遍認為，這節(jié)實驗課獲得的數(shù)據(jù)是培養(yǎng)學(xué)生理性思維的極好素材。理性思維是基于論證和邏輯推理的思維過程和方式，引導(dǎo)學(xué)生解決以上問題的過程就是對學(xué)生進行邏輯思維訓(xùn)練的過程，因此筆者在本實驗活動中又進行了如下嘗試：
①用直尺測量凝膠電泳后不同DNA片段遷移距離（圖12），即凝膠板上每條DNA條帶中央與加樣孔之間的距離，記錄于表4。

Marker 2000 Marker 5000
圖12 測量DNA條帶的遷移距離照片
②借助半對數(shù)坐標紙分析對數(shù)數(shù)據(jù)。如圖13所示，遷移距離所在的x軸是分度均勻的普通坐標軸；DNA片段長度所在的Y軸是分度不均勻的對數(shù)坐標軸，在此軸上某點與0點的實際距離為該點對應(yīng)數(shù)（即DNA片段長度）的對數(shù)值，但是在該點標出的值是DNA片段長度原數(shù)值。實際應(yīng)用時，往往根據(jù)需要使用半對數(shù)坐標紙的一部分，如下圖縱軸的起點就是100而不是0。將Marker 2000清晰的4個條帶的數(shù)據(jù)標到圖上，可見所有的點在一條直線上。從而推斷“DNA片段長度的對數(shù)與遷移距離呈反比”，繪制趨勢線（直線）作為標準曲線。據(jù)此標準曲線和PCR產(chǎn)物條帶的遷移距離，可據(jù)圖推斷出PCR產(chǎn)物的大小約為840 bp。本次估值建立在Marker全部條帶信息的基礎(chǔ)上，更為科學(xué)。半對數(shù)曲線圖的繪制易于教師展開教學(xué)；學(xué)生也習(xí)得了處理對數(shù)的簡便方法，繪圖和分析圖表的能力得到了提升；數(shù)據(jù)的獲取和分析更為深入。
③使用條帶更多的Marker 5000驗證上述實驗結(jié)果的正確性。將Marker 5000的8個條帶的數(shù)據(jù)標記在半對數(shù)坐標紙上，8個點也位于一條直線上，其趨勢線與Marker 2000很接近，且基本平行。根據(jù)Marker 5000實驗結(jié)果中PCR產(chǎn)物的遷移距離和趨勢線，推斷出PCR產(chǎn)物大小也約為840 bp，從而證明之前實驗分析方法和結(jié)論的正確性。為了更好地比較兩條趨勢線，本文中使用Marker 2000的凝膠實際電泳時間為23.5 min，比另一組短1.5 min，從而避免兩條線過于重合導(dǎo)致繪圖、分析的困難。
④運用Excel繪制半對數(shù)曲線圖精確計算PCR產(chǎn)物大小。為了獲得精確的實驗結(jié)果，教師指導(dǎo)學(xué)生使用Excel匯總并分析全班數(shù)據(jù)：將表3中Marker條帶的信息輸入到Excel中，選擇繪制“散點圖”，將縱坐標軸設(shè)置成“對數(shù)坐標”。添加趨勢線時選擇“指數(shù)”類型，并顯示公式及R2值，從而獲得半對數(shù)曲線圖。可見兩條直線接近且基本平行，0.99的R2值說明趨勢線與數(shù)據(jù)的擬合度很好，精確證明了DNA條帶的遷移距離與片段長度的對數(shù)呈反比。將PCR產(chǎn)物2次實驗的遷移距離分別帶入公式，計算出其長度約為846 bp及841 bp，與實際長度841 bp很接近。運用軟件分析實驗結(jié)果是信息技術(shù)與現(xiàn)代生物技術(shù)的結(jié)合，不僅實驗分析更為精確，也激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，有力地提高了他們的理性思維水平。
表4 DNA片段長度與遷移距離記錄表
Marker 5000
PCR產(chǎn)物
DNA片段長度（bp）
5000
3000
2000
1500
1000
800
500
300
估算為846
遷移距離（cm）
1.20
1.46
1.70
1.85
2.08
2.21
2.45
2.65
2.15
Marker 2000
PCR產(chǎn)物
DNA片段長度（bp）
2000
1000
750
500
估算為841
遷移距離（cm）
1.60
1.95
2.10
2.27
2.03

利用半對數(shù)坐標紙繪制 運用Excel軟件繪制
圖13 DNA片段長度與遷移距離曲線圖
八、實驗效果評價
改進后的實驗，實驗材料改為酵母菌，更加安全、便宜、準備過程簡單。由原來的3課時縮減為2課時，同時也保證了實驗效果。
引導(dǎo)學(xué)生分析科學(xué)史、了解PCR反應(yīng)在社會實踐中的應(yīng)用、全程參與現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的操作和分析過程，嘗試運用傳統(tǒng)數(shù)學(xué)方法及現(xiàn)代信息技術(shù)處理生物大數(shù)據(jù)的過程。激發(fā)了學(xué)生學(xué)習(xí)生物學(xué)的興趣，認同由揭示科學(xué)概念到技術(shù)應(yīng)用，是很多科學(xué)家艱苦努力工作的結(jié)果，認同PCR技術(shù)廣泛地應(yīng)用于法醫(yī)，醫(yī)療等多個方面，推動了社會進步。同時，提高學(xué)生的科學(xué)思維和探究能力。
教師通過學(xué)生課上的實驗操作、課堂表現(xiàn)和實驗報告對學(xué)生的學(xué)習(xí)效果進行評價。學(xué)生通過展示和交流而相互評價。
本實驗的數(shù)據(jù)分析使亮點。半對數(shù)曲線圖的引入，使原本的驗證性實驗轉(zhuǎn)變?yōu)樘骄啃詫嶒灐Ｒ龑?dǎo)學(xué)生用數(shù)學(xué)模型法分析實驗數(shù)據(jù)，實施STEM教學(xué)，其論證過程嚴謹，邏輯推理結(jié)論可信，從而將發(fā)展學(xué)生的生物核心素養(yǎng)落到實處。

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