資源簡介

(共96張PPT)
　第3章　基
因
工
程
第1節　重組DNA技術的基本工具
必備知識·素養奠基
一、基因工程的誕生和發展
判一判:基于基因工程相關基礎理論的突破和技術的創新,判斷下列說法的正
誤。
1.1953年,沃森和克里克建立了DNA分子雙螺旋結構模型,并用實驗證明了DNA分
子的半保留復制。
(
)
提示:DNA分子半保留復制是梅塞爾森和斯塔爾用實驗證明的。
2.1970年,在細菌體內發現了第一個限制酶,后來又發現了多種限制酶、DNA連
接酶等。
(
)
×
√
3.1972年,伯格首先在體外進行DNA改造,并構建了第一個體外重組DNA分子。
(
)
4.1983年,科學家采用花粉管通道法培育了世界上第一例轉基因煙草。
(
)
提示:第一例轉基因煙草是用農桿菌轉化法培育的。
5.1984年,我國科學家朱作言領導的團隊培育了世界上第一條轉基因魚。
(
)
6.基因工程是在生物化學、分子生物學和微生物學等學科的基礎上發展起來
的。
(
)
√
×
√
√
二、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”
1.來源:主要來自_________。
2.特點:具有_____性。
(1)識別DNA分子的_______________。
(2)切割特定部位的兩個核苷酸之間的_________鍵。
原核生物
專一
特定核苷酸序列
磷酸二酯
3.結果:
【激疑】限制酶來源于原核生物,為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA?
提示:細菌DNA缺乏特定的核苷酸序列,限制酶無法識別這些DNA,故不能剪切。
三、DNA連接酶——“分子縫合針”
1.作用:將____________“縫合”起來,恢復被_______切開的兩個核苷酸之間的
___________。
2.種類:
種　類
來　源
特　點
_____
DNA連接酶
_________
只能“縫合”具有_____________的雙鏈DNA片段
T4DNA
連接酶
T4噬菌體
既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的
_________,又可以“縫合”雙鏈DNA
片段的_______
雙鏈DNA片段
限制酶
磷酸二酯鍵
大腸桿菌
互補黏性末端
黏性末端
平末端
E.coli
四、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
1.種類:質粒、_______、動植物病毒等。
2.常用載體——質粒
(1)本質:質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞
________之外,并具有自我復制能力的____________分子。
(2)作為載體的三個條件。
①質粒DNA分子上有一個或多個___________位點。
②能在細胞內自我復制,或整合到________上,隨受體DNA同步復制。
③含有特殊的_____基因。
噬菌體
擬核DNA
環狀雙鏈DNA
限制酶切割
受體DNA
標記
五、DNA的粗提取與鑒定
1.實驗原理:
(1)DNA、RNA、蛋白質和脂質等在_______________方面有差異,選用適當的物
理或化學方法對它們進行提取。
①DNA不溶于酒精,某些蛋白質溶于_____,分離DNA和蛋白質。
②DNA能溶于__mol/L的NaCl溶液。
(2)DNA遇_______試劑會呈現藍色。
物理和化學性質
酒精
2
二苯胺
2.方法步驟:
(1)研磨:取30g洋蔥切碎,倒入10
mL研磨液研磨。
(2)除雜:漏斗中墊上紗布過濾后,在4
℃冰箱靜置后取_______,1
500
r/min的
轉速下離心后取_______。
(3)提取:加入體積相等、體積分數95%酒精,溶液出現白色的絲狀物是____。
方法一:用玻璃杯按_____(填“一個”或“兩個”)方向攪拌,卷起絲狀物,用濾
紙吸去上面的水分。
方法二:10
000
r/min的轉速下離心5
min,取_______晾干。
上清液
上清液
DNA
一個
沉淀物
(4)鑒定:
項目
A
B
2
mol/L的NaCl溶液
5
mL
絲狀物或沉淀物
不加
加入
_______試劑4
mL
_______加熱5
min
現象
無色
_____
二苯胺
沸水中
藍色
【激疑】
DNA的鑒定和還原糖的鑒定都需要加熱,它們有什么不同?
提示:還原糖加斐林試劑后,置于55～65
℃熱水中加熱;而DNA加二苯胺試劑后,置于沸水中加熱。
關鍵能力·素養形成
知識點一　基因工程中的工具酶
1.限制酶:
(1)限制酶的作用。
限制酶具有特殊的識別和切割功能,在基因工程中,一方面被用于切割含目的
基因的DNA分子,以獲取目的基因;另一方面用于切割載體。
(2)識別序列的特點:呈現堿基互補對稱,無論是奇數個堿基,還是偶數個堿基,
都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排
列的。如
以中心線為軸,兩側堿基互補對稱;
以
為軸,
兩側堿基互補對稱。
(3)限制酶切割方式:
①上下交錯切割:限制酶在DNA雙鏈的不同位置切割DNA(即在識別序列的中軸線兩側切割),產生的DNA片段的末端兩條鏈一長一短,不是平齊的,即黏性末端,
如圖:
②上下對稱切割:限制酶在DNA雙鏈的相同位置切割DNA(即沿著識別序列的中軸線切割),這樣產生的末端兩條鏈平齊,即平末端,如圖:
2.DNA連接酶:
(1)作用:
將具有相同或互補黏性末端以及具有平末端的DNA片段“縫合”成新的DNA分子。
(2)連接方式:
DNA連接酶可把黏性末端和平末端之間的縫隙“縫合”起來,相當于把梯子兩邊的扶手的斷口連接起來,形成兩個磷酸二酯鍵。DNA連接酶與堿基之間的氫鍵形成無關。
3.與DNA相關的五種酶的比較:
名稱
作用部位
作用結果
限制酶
磷酸二酯鍵
將DNA切成兩個片段
DNA
連接酶
磷酸二酯鍵
將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
DNA
聚合酶
磷酸二酯鍵
將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端
DNA
(水
解)酶
磷酸二酯鍵
將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
解旋酶
堿基對之
間的氫鍵
將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈,形成兩條長鏈
【特別提醒】限制酶和DNA連接酶
(1)同一種限制酶一定能切出相同的黏性末端,相同的黏性末端不一定來自同一種限制酶的切割,但同樣能相互連接。
(2)限制酶和DNA連接酶作用部位相同,但作用正好相反,都作用于特定部位的磷酸二酯鍵,前者是“切割”,后者是“縫合”。
(3)DNA連接酶種類少:DNA連接酶無識別的特異性,對于相同或互補的黏性末端以及平末端都能連接。所以,限制酶種類多,DNA連接酶種類少。
　
【素養案例】
如表所示為4種限制酶的識別序列及其切割位點,請回答下列問題:
(1)從表中4種酶的切割位點看,可以切出平末端的酶是____________。?
(2)限制酶切割的DNA片段的縫合依靠的是______________酶,它的作用是形成磷酸二酯鍵;兩條鏈間的堿基對通過____________連接起來。?
(3)圖1中的質粒分子可被表中限制酶____________切割。?
(4)在相關酶的作用下,圖1中的甲與圖2中的乙________(填“能”或“不能”)拼接起來。請說明理由:____________________________________。?
【解題導引】解答本題思維流程如下:
【解析】(1)由表中4種限制酶的切割位點可知,SmaⅠ可切出平末端。(2)限制酶切割的DNA片段縫合時用DNA連接酶進行連接,形成磷酸二酯鍵;兩條鏈之間的堿基依據堿基互補配對原則形成氫鍵。(3)根據質粒的堿基序列可知,質粒分子可被限制酶EcoRⅠ切割,切割后形成鏈狀DNA。(4)由圖可知,甲和乙的黏性末端相同,在DNA連接酶的作用下可以拼接起來。
答案:(1)SmaⅠ　
(2)DNA連接　氫鍵　(3)EcoRⅠ　
(4)能　二者具有相同的黏性末端
【素養·探究——母題追問】
　(1)科學思維——模型與建模
如圖是某同學畫出的限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割產生的黏性末端,判斷他的寫法是否正確?如果不正確,請改正。
提示:限制酶BamHⅠ切割產生的黏性末端不正確,限制酶HindⅢ切割產生的黏性末端正確。
限制酶BamHⅠ產生的黏性末端為
-G　　　　　GATCC-
-CCTAG　　　　　G-
(2)科學思維——批判性思維
某同學認為同一限制酶切割產生相同的黏性末端,DNA連接酶可以連接相同的黏性末端,因此基因工程必須使用同一種限制酶處理后的黏性末端才能用DNA連接酶連接,這個同學的說法正確嗎?說明你的理由。
提示:不對。不同的限制酶也可能產生相同的黏性末端,因此基因工程中也可使用不同的限制酶處理獲得相同的黏性末端。
【素養·遷移】
　下列所示的末端至少是由幾種限制酶作用產生的
(　　)
A.1種　　　B.2種　　　C.3種　　　D.4種
【解析】選C。圖中③④為相同的平末端,可能由同一種限制酶切割所得,所以圖示四種末端至少是由3種限制酶作用產生的。
　【補償訓練】
　　在基因工程中用來修飾改造生物基因的工具是
(　　)
A.限制酶和DNA連接酶
B.限制酶和水解酶
C.限制酶和載體
D.DNA連接酶和載體
【解析】選A。基因工程中的操作工具有3種,即“分子手術刀”“分子縫合針”“分子運輸車”。限制酶的作用是通過識別和切割從DNA分子上獲取目的基因,而DNA連接酶是將目的基因連接到載體上,載體起運輸工具的作用,攜帶著目的基因進入受體細胞。顯然,對基因起修飾改造作用的是限制酶和DNA連接酶。
知識點二　基因工程中常用的載體
1.特點:質粒是一種裸露的、結構簡單、具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA分子。
2.本質:質粒是獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外的小型DNA分子,不是細胞器。
3.質粒作為載體所具備的條件:
條　件
分　析
穩定并能復制
目的基因穩定存在且數量可擴大
有一個至多個
限制酶切割位點
可攜帶多個
或多種外源基因
具有特殊的標記基因
便于重組DNA的鑒定和選擇
無毒害作用
避免受體細胞受到損傷
4.標記基因的篩選原理:
載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因,而未導入該基因的受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。
將含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞,抗性基因在受體細胞內表達,受體細胞對該抗生素產生抗性。在含有該抗生素的培養基上,能夠生存的是被導入了基因表達載體的受體細胞。如圖所示:
【特別提醒】
細胞膜上的載體與基因工程中的載體的兩個“不同”
(1)化學本質不同:
①細胞膜上的載體化學成分是蛋白質。
②基因工程中的載體可能是物質,如質粒(DNA),也可能是生物,如噬菌體、動植物病毒等。
(2)功能不同:
①細胞膜上的載體功能是協助細胞膜控制物質進出細胞。
②基因工程中的載體是一種“分子運輸車”,把目的基因導入受體細胞。
　
【素養案例】
某細菌質粒如圖所示,通過標記基因可以推知外源基因插入的位置,圖示中的a、b、c是外源基因插入位置,請根據表中提供的細菌生長情況,推測①②③三種重組后細菌的外源基因插入點,正確的一組是
(　　)
細菌在含氨芐青霉素的培養基上的生長狀況
細菌在含四環素的培養基上的生長狀況
①
能生長
能生長
②
能生長
不能生長
③
不能生長
能生長
A.①是c;②是b;③是a
B.①是a和b;②是a;③是b
C.①是a和b;②是b;③是a
D.①是c;②是a;③是b
　【解題導引】解答本題注意兩個方面:
(1)理解抗性基因:
抗四環素基因:使細菌能在含四環素的培養基上生長。
抗氨芐青霉素基因:使細菌能在含氨芐青霉素的培養基上生長。
(2)質粒上標記基因的作用:用于重組DNA分子的篩選。
【解析】選A。①細菌能在含氨芐青霉素和四環素的培養基上生長,說明抗氨芐青霉素基因和抗四環素基因沒有被破壞,所以插入點是c;②細菌能在含氨芐青霉素的培養基上生長,而不能在含四環素的培養基上生長,說明其抗氨芐青霉素基因正常而抗四環素基因被破壞,故插入點為b;③細菌不能在含氨芐青霉素的培養基上生長,能在含四環素的培養基上生長,說明其抗氨芐青霉素基因被插入而破壞,故插入點為a。
【素養·探究——母題追問】
(1)科學思維——演繹與推理
將外源基因插入質粒中需要借助哪些工具酶?
提示:限制酶和DNA連接酶。
(2)科學探究——結果的討論與交流
天然的質?？梢灾苯佑米骰蚬こ梯d體嗎?為什么?
提示:不能,自然存在的質粒DNA分子并不完全具備作為載體條件,都要進行人工改造后才能用作基因工程載體。
　【素養·遷移】
　限制酶MunⅠ和限制酶EcoR
Ⅰ的識別序列及切割位點分別是
和
。如圖表示四種質粒和目的基因,其中,質粒上箭頭所指部位為酶的識別位點,陰影部分表示標記基因。適于作為圖示目的基因載體的質粒是(　　)
【解題關鍵】作為載體的質粒必須與目的基因具有相同的限制酶切點,并且該切點不能破壞質粒的標記基因。
【解析】選A。用限制酶MunⅠ切割A質粒后,不會破壞標記基因,而且還能產生與目的基因兩側黏性末端相同的末端,適于作為目的基因的載體。B項中質粒沒有標記基因,不適于作為目的基因的載體。C、D質粒含有標記基因,但用限制酶切割后會被破壞,因此不適于作為目的基因的載體。
【課堂回眸】
課堂檢測·素養達標
【概念·診斷】　　　　　　　　　　　　　
1.“工欲善其事,必先利其器”基因工程對體外DNA分子“切割”“拼接”并導入受體細胞中至少需要三種工具,下列有關基因工程中的三種工具的描述合理的是________。?
①DNA重組技術的原理是基因突變
②限制酶和解旋酶的作用部位相同
③作為載體,必須要有標記基因等結構
④T4DNA連接酶既能連接黏性末端,又能連接平末端
⑤DNA連接酶能連接所有相同或互補的黏性末端,故該酶沒有專一性
【解析】選③④。DNA重組技術的原理是基因重組,①錯誤;限制酶作用于磷酸二酯鍵,解旋酶作用于氫鍵,②錯誤;作為載體,必須能進行自我復制、具有標記基因、有一個或多個限制酶切割位點等,③正確;T4DNA連接酶既能連接黏性末端,又能連接平末端,④正確;任何酶都具有專一性。酶的專一性是指一種酶只能催化一種或一類化學反應,黏性末端相連接屬于一類合成反應,⑤錯誤。
2.下列關于基因工程工具酶的說法,正確的是
(　　)
A.E.coli
DNA連接酶既能夠連接平末端,也可以連接黏性末端
B.每種限制酶只能識別特定的核苷酸序列,并在特定位點進行切割,體現了酶的專一性
C.DNA連接酶連接的是堿基間的氫鍵
D.限制酶、DNA連接酶和質粒是基因工程常用的工具酶
【解析】選B。E.coli
DNA連接酶只能連接黏性末端,不能連接平末端,A項錯誤;每種限制酶只能識別特定的核苷酸序列,并在特定的位點上切割DNA分子,體現了酶的專一性,B項正確;DNA連接酶連接的是兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵,C項錯誤;限制酶和DNA連接酶是基因工程常用的工具酶,但質粒是載體,不是工具酶,D項錯誤。
3.如圖表示限制酶切割某DNA的過程,從圖中可知,該限制酶能識別的堿基序列及切點是
(　　)
A.CTTAAG,切點在C和T之間
B.CTTAAG,切點在G和A之間
C.GAATTC,切點在G和A之間
D.CTTAAC,切點在C和T之間
【解析】選C。據圖分析可知,識別的序列為GAATTC,切割的位點在GA之間。
4.如圖為DNA分子的某一片段,其中①②③分別表示某種酶的作用部位,則相應的酶依次是
(　　)
A.DNA連接酶、限制酶、解旋酶
B.限制酶、解旋酶、DNA連接酶
C.限制酶、DNA連接酶、解旋酶
D.解旋酶、限制酶、DNA連接酶
【解析】選D。①是氫鍵,是解旋酶的作用位點;②是磷酸二酯鍵,限制酶可將其斷裂;③是DNA連接酶,可將DNA片段之間的磷酸二酯鍵連接起來。
5.作為目的基因的運輸工具——質粒,必須具備的條件之一及理由是(　　)
A.能夠在受體細胞中穩定地保存下來并大量復制,以便提供大量的目的基因
B.具有多個限制酶切割位點,以便于目的基因的表達
C.具有某些標記基因,以便為目的基因的表達提供條件
D.能夠在受體細胞中復制并穩定保存,以便于進行篩選
【解析】選A。作為載體要攜帶目的基因進入受體細胞并使之表達,必須能夠在受體細胞內穩定地保存并大量復制,以便通過復制提供大量目的基因。同時要具有某些標記基因,是為了通過標記基因是否表達來判斷目的基因是否進入了受體細胞,從而進行篩選受體細胞。載體要具有多個限制酶切割位點,則是為了便于與外源基因連接。
【思維·躍遷】
6.(2016·全國卷Ⅰ)某一質粒載體如圖所示,外源DNA插入Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因,Tetr表示四環素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamHⅠ酶切后,與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合,加入DNA連接酶進行連接反應,用得到的混合物直接轉化大腸桿菌,結果大腸桿菌有的未被轉化,有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種,分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}:
(1)質粒載體作為基因工程的工具,應具備的基本條件有______________
(答出兩點即可)。而作為基因表達載體,除滿足上述基本條件外,還需具有啟動子和終止子。?
(2)如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選,在上述四種大腸桿菌細胞中,未被轉化的和僅含環狀目的基因的細胞是不能區分的,其原因是___________;?
并且____________和________________________的細胞也是不能區分的,其原因是________________________________________________。在上述篩選的基礎上,若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落,還需使用含有________________的固體培養基。?
(3)基因工程中,某些噬菌體經改造后可以作為載體,其DNA復制所需的原料來自____________。?
【解題關鍵】解答本題的關鍵有兩點:
(1)理解基因工程中載體的特點。
(2)熟悉導入重組質粒的微生物的篩選方法。
　
　【解析】本題考查基因工程的相關知識。
(1)質粒被選用為基因工程的載體是因為:具有一個或多個限制酶切割位點;具有自我復制能力;帶有標記基因;對受體細胞無害。
(2)未轉化的和僅含環狀目的基因的細胞都不能在含有氨芐青霉素的培養基上生長,故這兩種不可區分。含有質粒載體和含有插入了目的基因的重組質粒的細胞在含有氨芐青霉素的培養基上都能生長,這兩種也不可區分。因目的基因
插入位點在四環素抗性基因上,四環素抗性基因被破壞,在獲得的單個菌落中各挑取少許分別接種到含有四環素的培養基上,不能生長的為要篩選的菌落,即含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。
(3)噬菌體營寄生生活,能利用宿主細胞內的原料和場所進行自身DNA的復制和蛋白質的合成。
答案:(1)能自我復制、具有標記基因
(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因,在該培養基上均不生長　含有質粒載體　含有插入了目的基因的重組質粒(或含有重組質粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因,在該培養基上均能生長　四環素　(3)受體細胞
【拓展·探究】
7.如圖表示兩種限制酶識別DNA分子的特定序列,并在特定位點對DNA分子進行切割的示意圖,請回答以下問題:
(1)關于限制酶的描述,錯誤的是
(　　)
A.EcoRⅠ識別的序列為GAATTC,在GA之間切割
B.HpaⅠ識別的序列為GTTAAC,在AT之間切割
C.EcoRⅠ切割后產生的為黏性末端,可用T4DNA連接酶連接
D.HpaⅠ切割后產生的為平末端,可用E.coli
DNA連接酶連接
(2)由圖解可以看出,限制酶的作用特點是____________________________
______________________________________。?
(3)如果甲中G堿基發生基因突變,EcoRⅠ還可以識別該片段嗎?為什么?
【解析】
(1)EcoRⅠ識別的序列為GAATTC,切點在G、A之間,A正確;HpaⅠ識別的序列為GTTAAC,切點在A、T之間,B正確;EcoRⅠ切口在識別序列中軸線兩側,形成黏性末端,T4DNA連接酶既能連接黏性末端也可連接平末端,C正確;HpaⅠ切口在識別序列中軸線處,形成平末端,E.coli
DNA連接酶只能連接黏性末端不能連接平末端,D錯誤。(2)(3)限制酶能識別DNA分子的特定核苷酸序列,并從特定位點切割DNA分子。當特定核苷酸序列變化后,就不能被相應限制酶識別。
答案:(1)D
(2)能識別雙鏈DNA分子的特定脫氧核苷酸序列,并從特定的位點將DNA分子切開(或特異性)
(3)不能。因為限制酶具有特異性,每種限制酶只能識別特定的核苷酸序列,并在特定位點切割。
課時素養評價
十二　重組DNA技術的基本工具
【基礎達標】
(20分鐘·70分)
一、選擇題(共7小題,每小題5分,共35分)
1.下列說法中不正確的有
(　　)
①限制酶主要是從原核生物中分離純化出來的
②DNA連接酶都是從原核生物中分離得到的
③所有限制酶識別的核苷酸序列均由6個核苷酸組成
④有的質粒是單鏈DNA
A.①②③
B.①②④
C.②③④
D.①③④
【解析】選C。限制酶主要是從原核生物中分離純化出來的,也有少數來自真核生物——酵母菌,①正確;T4
DNA連接酶來源于T4噬菌體(一種病毒),②錯誤;EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶識別的序列均為6個核苷酸,也有少數限制酶的識別序列由4、5或8個核苷酸組成,③錯誤;所有的質粒都是雙鏈的環狀DNA分子,④錯誤。
2.如圖是基因工程主要技術環節的一個基本步驟,這一步驟需用到的工具酶是
(　　)
A.DNA連接酶和解旋酶
B.DNA聚合酶和限制性內切核酸酶
C.限制性內切核酸酶和DNA連接酶
D.DNA聚合酶和RNA聚合酶
【解析】選C。目的基因和載體結合需“分子手術刀”——限制性內切核酸酶和“分子縫合針”——DNA連接酶。此過程不涉及DNA復制,不需要DNA聚合酶和解旋酶。
3.據圖分析下列有關基因工程的工具酶功能的敘述,不正確的是
(　　)
A.切斷a處的酶為限制性內切核酸酶
B.連接a處的酶為DNA連接酶
C.切斷b處的酶為解旋酶
D.切斷b處的酶為限制性內切核酸酶
【解析】選D。a為磷酸二酯鍵,可被限制性內切核酸酶切斷,A正確;a為磷酸二酯鍵,可被DNA連接酶連接起來,B正確;b為氫鍵,可被解旋酶切斷,C正確;b為氫鍵,而限制性內切核酸酶切斷的是磷酸二酯鍵,D錯誤。
4.如圖為DNA分子在不同酶的作用下所發生的變化,圖中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是
(　　)
A.①②③④
B.①②④③
C.①④②③
D.①④③②
【解析】選C。限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂,形成黏性末端或平末端,因此①符合;DNA聚合酶用于DNA分子的復制,能在單鏈上將一個個脫氧核苷酸連接起來,因此④符合;DNA連接酶能在具有相同或互補堿基末端的兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,因此②符合;解旋酶能夠將DNA分子的雙螺旋解開,因此③符合。
5.下列有關如圖所示的黏性末端的說法,錯誤的是
(　　)
A.甲、乙、丙黏性末端分別是由不同的限制酶切割產生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端,可形成重組DNA分子,但甲、丙之間不能
C.DNA連接酶的作用位點是b處
D.切割產生甲的限制酶不能識別由甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子片段
【解析】選C。據圖可知,切割形成甲、乙、丙黏性末端的限制酶識別序列與切
割位點分別是—GAATTC—(在G與A之間切割)、—CAATTG—(在C與A之間切
割)、—CTTAAG—(在C與T之間切割),即甲、乙、丙是由不同的限制酶切割產
生的,A正確。甲、乙的黏性末端互補,所以甲、乙可以形成重組DNA分子;甲、
丙的黏性末端不互補,所以甲、丙無法形成重組DNA分子,B正確。DNA連接酶可
以恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵,而b處是氫鍵,C錯誤。甲、
乙黏性末端形成的重組DNA分子片段為
,其中沒有切割產生甲的限制
酶的識別序列及酶切位點,所以切割產生甲的限制酶不能識別由甲、乙黏性末
端形成的重組DNA分子片段,D正確。
6.下列關于E.coli
DNA連接酶的敘述正確的是
(　　)
①催化具有相同黏性末端的DNA片段之間的連接
②催化具有互補黏性末端的DNA片段之間的連接
③催化具有平末端的DNA片段之間的連接
④催化單個脫氧核苷酸之間磷酸二酯鍵的形成
A.①②
B.②④
C.②③
D.①④
【解析】選A。E.coli
DNA連接酶來源于大腸桿菌,可用于連接相同或互補的黏性末端,不能連接平末端。DNA連接酶不能連接單個的脫氧核苷酸,在DNA復制時,DNA聚合酶將一個一個的脫氧核苷酸聚合在一起。
7.基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和質粒,便于重組和篩選。已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—,限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—。根據下圖判斷下列操作正確的是
(　　)
A.目的基因和質粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和質粒均用限制酶Ⅰ切割
C.質粒用限制酶Ⅱ切割,目的基因用限制酶Ⅰ切割
D.質粒用限制酶Ⅰ切割,目的基因用限制酶Ⅱ切割
【解析】選D。解此題要明確目的基因要從DNA片段上切下,質粒只要切開。限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—,單獨使用時可以把目的基因和質粒都切斷;限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—,只能把它們切開,單獨使用時不能切斷,所以目的基因用限制酶Ⅱ切割,質粒用限制酶Ⅰ切割;因為用限制酶Ⅰ切割質粒時破壞了GeneⅡ,所以只能用GeneⅠ作為標記基因。
二、非選擇題(共2小題,共35分)
8.(17分)根據基因工程的有關知識,回答下列問題:
(1)限制酶切割DNA分子后產生的片段,其末端類型有_________和____。?
(2)質粒載體用限制酶X(識別的序列由6個核苷酸組成)切割后產生的片段如下:
AATTC……G
　　　　　
G……CTTAA
該酶識別的序列為________________________,切割的部位是__________。?
(3)為使切割后的載體與目的基因相連,含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外,還可用限制酶Y切割,原因是______________________________。?
(4)按其來源不同,基因工程中所使用的DNA連接酶有兩類,即____________DNA連接酶和____________DNA連接酶,其中后者只能連接一種末端。?
(5)基因工程中除質粒外,________________和________________也可作為載體。?
【解析】
(1)限制酶切割DNA分子后可產生兩種類型的末端,即平末端和黏性末端。(2)將圖中片段兩端的黏性末端對接后可以看出限制酶X識別的序列為6個核苷酸組成的—GAATTC—,互補鏈是—CTTAAG—,切割的位點為G和A之間的磷酸二酯鍵。(3)質粒載體可以用限制酶X切割,也可以用另一種限制酶切割,說明該酶與限制酶X切割產生的黏性末端相同或者互補。(4)基因工程使用的DNA連接酶,按來源可分為E.coliDNA連接酶和T4
DNA連接酶,其中只能連接黏性末端的是E.coliDNA連接酶。(5)基因工程的載體有質粒、噬菌體和動植物病毒。
答案:(1)黏性末端　平末端
(2)—GAATTC—或—CTTAAG—　G和A之間的磷酸二酯鍵　(3)兩種限制酶切割后形成的黏性末端相同或互補　(4)T4　E.coli　(5)噬菌體　動植物病毒
9.(18分)如圖為大腸桿菌及質粒載體的結構模式圖,據圖回答下列問題:
(1)a代表的物質和質粒的化學本質都是__________,二者還具有其他共同點,如①__________________,②________________________(寫出兩條即可)。?
(2)若質粒DNA分子的切割末端為
,則與之連接的目的基因切割末端應為______________;可使用　________________把質粒和目的基因連接在一起。?
(3)氨芐青霉素抗性基因在質粒DNA上被稱為__________________________,?
其作用是____________________________________________。?
(4)下列常在基因工程中用作載體的是
(　　)
A.蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因
B.土壤農桿菌中的RNA分子
C.大腸桿菌的質粒
D.動物細胞的染色體
【解析】(1)據圖可知,a是位于擬核部位的DNA分子,跟質粒的化學本質一樣。
作為DNA分子,二者都能自我復制,其上的基因能完成表達,即具有遺傳效應
等。
(2)與
具有相同或互補黏性末端的DNA片段都可與之連接,即
或
寫成
。DNA連接酶催化連接相同或互補的黏性末端。
(3)抗性基因常作為標記基因,供重組DNA的鑒定和篩選。
(4)大腸桿菌的質粒是基因工程中最常用的載體,載體的本質為DNA,RNA分子不
能用作載體?？瓜x基因屬于目的基因,不屬于載體。染色體的主要成分為DNA
和蛋白質,不能用作載體。
答案:(1)DNA　能夠自我復制　具有遺傳效應
(2)CGCG—
　　
—　　DNA連接酶
(3)標記基因　供重組DNA的鑒定和篩選　(4)C
【能力提升】(10分鐘·30分)
1.(6分)如圖為農桿菌Ti質粒的T-DNA區段結構示意圖。農桿菌附著植物細胞后,T-DNA首先在農桿菌中從右邊界到左邊界被剪切、復制,然后進入植物細胞并整合到染色體上,繼而誘發細胞異常生長和分裂,形成植物腫瘤。以下有關敘述不正確的是
(　　)
A.Ti質粒存在于農桿菌的擬核DNA之外
B.植物腫瘤的形成與A、B兩個基因的表達有關
C.清除植物腫瘤組織中的農桿菌后腫瘤不再生長
D.利用T-DNA進行轉基因時需保留LB、RB序列
【解析】選C。Ti質粒是環狀的DNA分子,存在于農桿菌的擬核DNA之外,A正確;A、B兩個基因導入受體細胞的染色體上,進行表達,繼而誘發細胞異常生長和分裂,形成植物腫瘤,B正確;農桿菌將自身Ti質粒的T-DNA整合到植物染色體上,誘發了植物腫瘤的形成,故清除腫瘤組織中的農桿菌后,腫瘤仍可繼續生長,C錯誤;只有T-DNA保留LB、RB序列,T-DNA才能在農桿菌中從右邊界到左邊界被剪切、復制,然后進入植物細胞并整合到染色體上,D正確。
2.(6分)(不定項)圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性核酸內切酶的酶切位點,ampr表示氨芐青霉素抗性基因,neo表示新霉素抗性基因。下列敘述不正確的是
(　　)
A.圖甲中的質粒用BamHⅠ切割后,含有4個游離的磷酸基團
B.在構建重組質粒時,可用PstⅠ和BamHⅠ切割質粒和外源DNA
C.用PstⅠ和Hind
Ⅲ切割,可以保證重組DNA序列的唯一性
D.導入目的基因的大腸桿菌可在含氨芐青霉素的培養基中生長
【解析】選A、B、D。甲中的質粒只有一個BamHⅠ切割位點,切割后形成一個直鏈DNA,含2個游離的磷酸基團,A錯誤;BamHⅠ切割位點在目的基因上,不能用該酶切割外源DNA,B錯誤;用PstⅠ和HindⅢ切割質粒切成兩個片段,用PstⅠ和Hind
Ⅲ能將外源DNA切開,只有含目的基因的片段通過DNA連接酶與質粒連接形成的重組質粒符合要求,從而保證重組DNA序列的唯一性,C正確;導入目的基因的大腸桿菌,其重組質粒是用PstⅠ和Hind
Ⅲ切割的,其中的ampr(氨芐青霉素抗性基因)已被破壞,D錯誤。
【實驗·探究】
3.(18分)啤酒酵母菌是啤酒生產上常用的典型的發酵酵母菌。除用于釀造啤酒及其他的飲料酒外,還可發酵面包。菌體維生素、蛋白質含量高,可食用、藥用和作飼料?？茖W家將大麥細胞的LTP1基因植入啤酒酵母菌中,獲得的啤酒酵母菌種可產生LTP1蛋白,并釀出泡沫豐富的啤酒?；镜牟僮鬟^程如圖:
(1)該技術定向改變了啤酒酵母菌的性狀,這在可遺傳變異的來源中屬于________。?
(2)為了將LTP1基因導入酵母菌細胞內,所用的載體是________。?
(3)題圖中C進入的啤酒酵母菌分別在含有青霉素、四環素的兩種選擇培養基上的生長情況是____________________________________________。
【解析】(1)由題圖可知該技術屬于基因工程,該變異屬于基因重組。(2)據題圖可以看出,載體來自大腸桿菌,一定是質粒。(3)由于質粒上抗四環素基因被破壞,所以含有C的酵母菌在含有青霉素的培養基上能存活,但在含有四環素的培養基上不能存活。
答案:(1)基因重組
(2)(大腸桿菌的)質粒
(3)在含有青霉素的培養基上能存活,但在含有四環素的培養基上不能存活第3章　基
因
工
程
第1節　重組DNA技術的基本工具　
必備知識·素養奠基
一、基因工程的誕生和發展
判一判:基于基因工程相關基礎理論的突破和技術的創新,判斷下列說法的正誤。
1.1953年,沃森和克里克建立了DNA分子雙螺旋結構模型,并用實驗證明了DNA分子的半保留復制。
(×)
提示:DNA分子半保留復制是梅塞爾森和斯塔爾用實驗證明的。
2.1970年,在細菌體內發現了第一個限制酶,后來又發現了多種限制酶、DNA連接酶等。
(√)
3.1972年,伯格首先在體外進行DNA改造,并構建了第一個體外重組DNA分子。
(√)
4.1983年,科學家采用花粉管通道法培育了世界上第一例轉基因煙草。
(×)
提示:第一例轉基因煙草是用農桿菌轉化法培育的。
5.1984年,我國科學家朱作言領導的團隊培育了世界上第一條轉基因魚。
(√)
6.基因工程是在生物化學、分子生物學和微生物學等學科的基礎上發展起來的。
(√)
二、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”
1.來源:主要來自原核生物。
2.特點:具有專一性。
(1)識別DNA分子的特定核苷酸序列。
(2)切割特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
3.結果:
限制酶來源于原核生物,為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA?
提示:細菌DNA缺乏特定的核苷酸序列,限制酶無法識別這些DNA,故不能剪切。
三、DNA連接酶——“分子縫合針”
1.作用:將雙鏈DNA片段“縫合”起來,恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
2.種類:
種　類
來　源
特　點
E.coliDNA連接酶
大腸桿菌
只能“縫合”具有互補黏性末端的雙鏈DNA片段
T4DNA連接酶
T4噬菌體
既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端,又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端
四、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
1.種類:質粒、噬菌體、動植物病毒等。
2.常用載體——質粒
(1)本質:質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外,并具有自我復制能力的環狀雙鏈DNA分子。
(2)作為載體的三個條件。
①質粒DNA分子上有一個或多個限制酶切割位點。
②能在細胞內自我復制,或整合到受體DNA上,隨受體DNA同步復制。
③含有特殊的標記基因。
五、DNA的粗提取與鑒定
1.實驗原理:
(1)DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面有差異,選用適當的物理或化學方法對它們進行提取。
①DNA不溶于酒精,某些蛋白質溶于酒精,分離DNA和蛋白質。
②DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液。
(2)DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色。
2.方法步驟:
(1)研磨:取30g洋蔥切碎,倒入10
mL研磨液研磨。
(2)除雜:漏斗中墊上紗布過濾后,在4
℃冰箱靜置后取上清液,1
500
r/min的轉速下離心后取上清液。
(3)提取:加入體積相等、體積分數95%酒精,溶液出現白色的絲狀物是DNA。
方法一:用玻璃杯按一個(填“一個”或“兩個”)方向攪拌,卷起絲狀物,用濾紙吸去上面的水分。
方法二:10
000
r/min的轉速下離心5
min,取沉淀物晾干。
(4)鑒定:
項目
A
B
2
mol/L的NaCl溶液
5
mL
絲狀物或沉淀物
不加
加入
二苯胺試劑4
mL
沸水中加熱5
min
現象
無色
藍色
DNA的鑒定和還原糖的鑒定都需要加熱,它們有什么不同?
提示:還原糖加斐林試劑后,置于55～65
℃熱水中加熱;而DNA加二苯胺試劑后,置于沸水中加熱。
關鍵能力·素養形成
知識點一　基因工程中的工具酶
1.限制酶:
(1)限制酶的作用。
限制酶具有特殊的識別和切割功能,在基因工程中,一方面被用于切割含目的基因的DNA分子,以獲取目的基因;另一方面用于切割載體。
(2)識別序列的特點:呈現堿基互補對稱,無論是奇數個堿基,還是偶數個堿基,都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的。如以中心線為軸,兩側堿基互補對稱;
以為軸,兩側堿基互補對稱。
(3)限制酶切割方式:
①上下交錯切割:限制酶在DNA雙鏈的不同位置切割DNA(即在識別序列的中軸線兩側切割),產生的DNA片段的末端兩條鏈一長一短,不是平齊的,即黏性末端,
如圖:
②上下對稱切割:限制酶在DNA雙鏈的相同位置切割DNA(即沿著識別序列的中軸線切割),這樣產生的末端兩條鏈平齊,即平末端,如圖:
2.DNA連接酶:
(1)作用:
將具有相同或互補黏性末端以及具有平末端的DNA片段“縫合”成新的DNA分子。
(2)連接方式:
DNA連接酶可把黏性末端和平末端之間的縫隙“縫合”起來,相當于把梯子兩邊的扶手的斷口連接起來,形成兩個磷酸二酯鍵。DNA連接酶與堿基之間的氫鍵形成無關。
3.與DNA相關的五種酶的比較:
名稱
作用部位
作用結果
限制酶
磷酸二酯鍵
將DNA切成兩個片段
DNA連接酶
磷酸二酯鍵
將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯鍵
將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端
DNA
(水解)酶
磷酸二酯鍵
將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
解旋酶
堿基對之間的氫鍵
將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈,形成兩條長鏈
【特別提醒】限制酶和DNA連接酶
(1)同一種限制酶一定能切出相同的黏性末端,相同的黏性末端不一定來自同一種限制酶的切割,但同樣能相互連接。
(2)限制酶和DNA連接酶作用部位相同,但作用正好相反,都作用于特定部位的磷酸二酯鍵,前者是“切割”,后者是“縫合”。
(3)DNA連接酶種類少:DNA連接酶無識別的特異性,對于相同或互補的黏性末端以及平末端都能連接。所以,限制酶種類多,DNA連接酶種類少。
　如表所示為4種限制酶的識別序列及其切割位點,請回答下列問題:
(1)從表中4種酶的切割位點看,可以切出平末端的酶是____________。?
(2)限制酶切割的DNA片段的縫合依靠的是______________酶,它的作用是形成磷酸二酯鍵;兩條鏈間的堿基對通過____________連接起來。?
(3)圖1中的質粒分子可被表中限制酶____________切割。?
(4)在相關酶的作用下,圖1中的甲與圖2中的乙________(填“能”或“不能”)拼接起來。請說明理由:____________________________________。?
【解題導引】解答本題思維流程如下:
　
【解析】(1)由表中4種限制酶的切割位點可知,SmaⅠ可切出平末端。(2)限制酶切割的DNA片段縫合時用DNA連接酶進行連接,形成磷酸二酯鍵;兩條鏈之間的堿基依據堿基互補配對原則形成氫鍵。(3)根據質粒的堿基序列可知,質粒分子可被限制酶EcoRⅠ切割,切割后形成鏈狀DNA。(4)由圖可知,甲和乙的黏性末端相同,在DNA連接酶的作用下可以拼接起來。
答案:(1)SmaⅠ　
(2)DNA連接　氫鍵　(3)EcoRⅠ　
(4)能　二者具有相同的黏性末端
【素養·探究——母題追問】
　(1)科學思維——模型與建模
如圖是某同學畫出的限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割產生的黏性末端,判斷他的寫法是否正確?如果不正確,請改正。
提示:限制酶BamHⅠ切割產生的黏性末端不正確,限制酶HindⅢ切割產生的黏性末端正確。
限制酶BamHⅠ產生的黏性末端為
(2)科學思維——批判性思維
某同學認為同一限制酶切割產生相同的黏性末端,DNA連接酶可以連接相同的黏性末端,因此基因工程必須使用同一種限制酶處理后的黏性末端才能用DNA連接酶連接,這個同學的說法正確嗎?說明你的理由。
提示:不對。不同的限制酶也可能產生相同的黏性末端,因此基因工程中也可使用不同的限制酶處理獲得相同的黏性末端。
【素養·遷移】
　下列所示的末端至少是由幾種限制酶作用產生的
(　　)
①AATTC-　　?、贏ATTG-　?、跜TA-　　④-TAG
　　　　G-　　　　　　　C-　　　GAT-　　　-ATC
A.1種　　　B.2種　　　C.3種　　　D.4種
【解析】選C。圖中③④為相同的平末端,可能由同一種限制酶切割所得,所以圖示四種末端至少是由3種限制酶作用產生的。
【補償訓練】
　　在基因工程中用來修飾改造生物基因的工具是
(　　)
A.限制酶和DNA連接酶
B.限制酶和水解酶
C.限制酶和載體
D.DNA連接酶和載體
【解析】選A?；蚬こ讨械牟僮鞴ぞ哂?種,即“分子手術刀”“分子縫合針”“分子運輸車”。限制酶的作用是通過識別和切割從DNA分子上獲取目的基因,而DNA連接酶是將目的基因連接到載體上,載體起運輸工具的作用,攜帶著目的基因進入受體細胞。顯然,對基因起修飾改造作用的是限制酶和DNA連接酶。
知識點二　基因工程中常用的載體
1.特點:質粒是一種裸露的、結構簡單、具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA分子。
2.本質:質粒是獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外的小型DNA分子,不是細胞器。
3.質粒作為載體所具備的條件:
條　件
分　析
穩定并能復制
目的基因穩定存在且數量可擴大
有一個至多個限制酶切割位點
可攜帶多個或多種外源基因
具有特殊的標記基因
便于重組DNA的鑒定和選擇
無毒害作用
避免受體細胞受到損傷
4.標記基因的篩選原理:
載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因,而未導入該基因的受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。
將含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞,抗性基因在受體細胞內表達,受體細胞對該抗生素產生抗性。在含有該抗生素的培養基上,能夠生存的是被導入了基因表達載體的受體細胞。如圖所示:
【特別提醒】
細胞膜上的載體與基因工程中的載體的兩個“不同”
(1)化學本質不同:
①細胞膜上的載體化學成分是蛋白質。
②基因工程中的載體可能是物質,如質粒(DNA),也可能是生物,如噬菌體、動植物病毒等。
(2)功能不同:
①細胞膜上的載體功能是協助細胞膜控制物質進出細胞。
②基因工程中的載體是一種“分子運輸車”,把目的基因導入受體細胞。
　某細菌質粒如圖所示,通過標記基因可以推知外源基因插入的位置,圖示中的a、b、c是外源基因插入位置,請根據表中提供的細菌生長情況,推測①②③三種重組后細菌的外源基因插入點,正確的一組是
(　　)
細菌在含氨芐青霉素的培養基上的生長狀況
細菌在含四環素的培養基上的生長狀況
①
能生長
能生長
②
能生長
不能生長
③
不能生長
能生長
A.①是c;②是b;③是a
B.①是a和b;②是a;③是b
C.①是a和b;②是b;③是a
D.①是c;②是a;③是b
【解題導引】解答本題注意兩個方面:
(1)理解抗性基因:
抗四環素基因:使細菌能在含四環素的培養基上生長。
抗氨芐青霉素基因:使細菌能在含氨芐青霉素的培養基上生長。
(2)質粒上標記基因的作用:用于重組DNA分子的篩選。
【解析】選A。①細菌能在含氨芐青霉素和四環素的培養基上生長,說明抗氨芐青霉素基因和抗四環素基因沒有被破壞,所以插入點是c;②細菌能在含氨芐青霉素的培養基上生長,而不能在含四環素的培養基上生長,說明其抗氨芐青霉素基因正常而抗四環素基因被破壞,故插入點為b;③細菌不能在含氨芐青霉素的培養基上生長,能在含四環素的培養基上生長,說明其抗氨芐青霉素基因被插入而破壞,故插入點為a。
【素養·探究——母題追問】
　(1)科學思維——演繹與推理
將外源基因插入質粒中需要借助哪些工具酶?
提示:限制酶和DNA連接酶。
(2)科學探究——結果的討論與交流
天然的質?？梢灾苯佑米骰蚬こ梯d體嗎?為什么?
提示:不能,自然存在的質粒DNA分子并不完全具備作為載體條件,都要進行人工改造后才能用作基因工程載體。
【素養·遷移】
　限制酶MunⅠ和限制酶EcoR
Ⅰ的識別序列及切割位點分別是和。如圖表示四種
質粒和目的基因,其中,質粒上箭頭所指部位為酶的識別位點,陰影部分表示標記基因。適于作為圖示目的基因載體的質粒是
(　　)
【解題關鍵】作為載體的質粒必須與目的基因具有相同的限制酶切點,并且該切點不能破壞質粒的標記基因。
【解析】選A。用限制酶MunⅠ切割A質粒后,不會破壞標記基因,而且還能產生與目的基因兩側黏性末端相同的末端,適于作為目的基因的載體。B項中質粒沒有標記基因,不適于作為目的基因的載體。C、D質粒含有標記基因,但用限制酶切割后會被破壞,因此不適于作為目的基因的載體。
課堂檢測·素養達標
【概念·診斷】　　　　　　　　　　　　
1.“工欲善其事,必先利其器”基因工程對體外DNA分子“切割”“拼接”并導入受體細胞中至少需要三種工具,下列有關基因工程中的三種工具的描述合理的是________。?
①DNA重組技術的原理是基因突變
②限制酶和解旋酶的作用部位相同
③作為載體,必須要有標記基因等結構
④T4DNA連接酶既能連接黏性末端,又能連接平末端
⑤DNA連接酶能連接所有相同或互補的黏性末端,故該酶沒有專一性
【解析】選③④。DNA重組技術的原理是基因重組,①錯誤;限制酶作用于磷酸二酯鍵,解旋酶作用于氫鍵,②錯誤;作為載體,必須能進行自我復制、具有標記基因、有一個或多個限制酶切割位點等,③正確;T4DNA連接酶既能連接黏性末端,又能連接平末端,④正確;任何酶都具有專一性。酶的專一性是指一種酶只能催化一種或一類化學反應,黏性末端相連接屬于一類合成反應,⑤錯誤。
2.下列關于基因工程工具酶的說法,正確的是
(　　)
A.E.coli
DNA連接酶既能夠連接平末端,也可以連接黏性末端
B.每種限制酶只能識別特定的核苷酸序列,并在特定位點進行切割,體現了酶的專一性
C.DNA連接酶連接的是堿基間的氫鍵
D.限制酶、DNA連接酶和質粒是基因工程常用的工具酶
【解析】選B。E.coli
DNA連接酶只能連接黏性末端,不能連接平末端,A項錯誤;每種限制酶只能識別特定的核苷酸序列,并在特定的位點上切割DNA分子,體現了酶的專一性,B項正確;DNA連接酶連接的是兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵,C項錯誤;限制酶和DNA連接酶是基因工程常用的工具酶,但質粒是載體,不是工具酶,D項錯誤。
3.如圖表示限制酶切割某DNA的過程,從圖中可知,該限制酶能識別的堿基序列及切點是
(　　)
A.CTTAAG,切點在C和T之間
B.CTTAAG,切點在G和A之間
C.GAATTC,切點在G和A之間
D.CTTAAC,切點在C和T之間
【解析】選C。據圖分析可知,識別的序列為GAATTC,切割的位點在GA之間。
4.如圖為DNA分子的某一片段,其中①②③分別表示某種酶的作用部位,則相應的酶依次是
(　　)
A.DNA連接酶、限制酶、解旋酶
B.限制酶、解旋酶、DNA連接酶
C.限制酶、DNA連接酶、解旋酶
D.解旋酶、限制酶、DNA連接酶
【解析】選D。①是氫鍵,是解旋酶的作用位點;②是磷酸二酯鍵,限制酶可將其斷裂;③是DNA連接酶,可將DNA片段之間的磷酸二酯鍵連接起來。
5.作為目的基因的運輸工具——質粒,必須具備的條件之一及理由是
(　　)
A.能夠在受體細胞中穩定地保存下來并大量復制,以便提供大量的目的基因
B.具有多個限制酶切割位點,以便于目的基因的表達
C.具有某些標記基因,以便為目的基因的表達提供條件
D.能夠在受體細胞中復制并穩定保存,以便于進行篩選
【解析】選A。作為載體要攜帶目的基因進入受體細胞并使之表達,必須能夠在受體細胞內穩定地保存并大量復制,以便通過復制提供大量目的基因。同時要具有某些標記基因,是為了通過標記基因是否表達來判斷目的基因是否進入了受體細胞,從而進行篩選受體細胞。載體要具有多個限制酶切割位點,則是為了便于與外源基因連接。
【思維·躍遷】
6.(2016·全國卷Ⅰ)某一質粒載體如圖所示,外源DNA插入Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因,Tetr表示四環素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamHⅠ酶切后,與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合,加入DNA連接酶進行連接反應,用得到的混合物直接轉化大腸桿菌,結果大腸桿菌有的未被轉化,有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種,分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}:
(1)質粒載體作為基因工程的工具,應具備的基本條件有______________
____________________________(答出兩點即可)。而作為基因表達載體,除滿足上述基本條件外,還需具有啟動子和終止子。?
(2)如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選,在上述四種大腸桿菌細胞中,未被轉化的和僅含環狀目的基因的細胞是不能區分的,其原因是____________
________________;?并且____________和________________________的細胞也是不能區分的,其原因是_____________________________________。在上述篩選的基礎上,若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落,還需使用含有________________的固體培養基。?
(3)基因工程中,某些噬菌體經改造后可以作為載體,其DNA復制所需的原料來自____________。?
【解題關鍵】解答本題的關鍵有兩點:
(1)理解基因工程中載體的特點。
(2)熟悉導入重組質粒的微生物的篩選方法。
【解析】本題考查基因工程的相關知識。
(1)質粒被選用為基因工程的載體是因為:具有一個或多個限制酶切割位點;具有自我復制能力;帶有標記基因;對受體細胞無害。
(2)未轉化的和僅含環狀目的基因的細胞都不能在含有氨芐青霉素的培養基上生長,故這兩種不可區分。含有質粒載體和含有插入了目的基因的重組質粒的細胞在含有氨芐青霉素的培養基上都能生長,這兩種也不可區分。因目的基因插入位點在四環素抗性基因上,四環素抗性基因被破壞,在獲得的單個菌落中各挑取少許分別接種到含有四環素的培養基上,不能生長的為要篩選的菌落,即含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。
(3)噬菌體營寄生生活,能利用宿主細胞內的原料和場所進行自身DNA的復制和蛋白質的合成。
答案:(1)能自我復制、具有標記基因
(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因,在該培養基上均不生長　含有質粒載體　含有插入了目的基因的重組質粒(或含有重組質粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因,在該培養基上均能生長　四環素　(3)受體細胞
【拓展·探究】
7.如圖表示兩種限制酶識別DNA分子的特定序列,并在特定位點對DNA分子進行切割的示意圖,請回答以下問題:
(1)關于限制酶的描述,錯誤的是
(　　)
A.EcoRⅠ識別的序列為GAATTC,在GA之間切割
B.HpaⅠ識別的序列為GTTAAC,在AT之間切割
C.EcoRⅠ切割后產生的為黏性末端,可用T4DNA連接酶連接
D.HpaⅠ切割后產生的為平末端,可用E.coli
DNA連接酶連接
(2)由圖解可以看出,限制酶的作用特點是____________________
______________________________________。?
(3)如果甲中G堿基發生基因突變,EcoRⅠ還可以識別該片段嗎?為什么?
【解析】
(1)EcoRⅠ識別的序列為GAATTC,切點在G、A之間,A正確;HpaⅠ識別的序列為GTTAAC,切點在A、T之間,B正確;EcoRⅠ切口在識別序列中軸線兩側,形成黏性末端,T4DNA連接酶既能連接黏性末端也可連接平末端,C正確;HpaⅠ切口在識別序列中軸線處,形成平末端,E.coli
DNA連接酶只能連接黏性末端不能連接平末端,D錯誤。(2)(3)限制酶能識別DNA分子的特定核苷酸序列,并從特定位點切割DNA分子。當特定核苷酸序列變化后,就不能被相應限制酶識別。
答案:(1)D
(2)能識別雙鏈DNA分子的特定脫氧核苷酸序列,并從特定的位點將DNA分子切開(或特異性)
(3)不能。因為限制酶具有特異性,每種限制酶只能識別特定的核苷酸序列,并在特定位點切割。
十二　重組DNA技術的基本工具　　　　　　
(20分鐘·70分)
一、選擇題(共7小題,每小題5分,共35分)
1.下列說法中不正確的有
(　　)
①限制酶主要是從原核生物中分離純化出來的
②DNA連接酶都是從原核生物中分離得到的
③所有限制酶識別的核苷酸序列均由6個核苷酸組成
④有的質粒是單鏈DNA
A.①②③
B.①②④
C.②③④
D.①③④
【解析】選C。限制酶主要是從原核生物中分離純化出來的,也有少數來自真核生物——酵母菌,①正確;T4
DNA連接酶來源于T4噬菌體(一種病毒),②錯誤;EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶識別的序列均為6個核苷酸,也有少數限制酶的識別序列由4、5或8個核苷酸組成,③錯誤;所有的質粒都是雙鏈的環狀DNA分子,④錯誤。
2.如圖是基因工程主要技術環節的一個基本步驟,這一步驟需用到的工具酶是
(　　)
A.DNA連接酶和解旋酶
B.DNA聚合酶和限制性內切核酸酶
C.限制性內切核酸酶和DNA連接酶
D.DNA聚合酶和RNA聚合酶
【解析】選C。目的基因和載體結合需“分子手術刀”——限制性內切核酸酶和“分子縫合針”——DNA連接酶。此過程不涉及DNA復制,不需要DNA聚合酶和解旋酶。
3.據圖分析下列有關基因工程的工具酶功能的敘述,不正確的是
(　　)
A.切斷a處的酶為限制性內切核酸酶
B.連接a處的酶為DNA連接酶
C.切斷b處的酶為解旋酶
D.切斷b處的酶為限制性內切核酸酶
【解析】選D。a為磷酸二酯鍵,可被限制性內切核酸酶切斷,A正確;a為磷酸二酯鍵,可被DNA連接酶連接起來,B正確;b為氫鍵,可被解旋酶切斷,C正確;b為氫鍵,而限制性內切核酸酶切斷的是磷酸二酯鍵,D錯誤。
4.如圖為DNA分子在不同酶的作用下所發生的變化,圖中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是
(　　)
A.①②③④
B.①②④③
C.①④②③
D.①④③②
【解析】選C。限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂,形成黏性末端或平末端,因此①符合;DNA聚合酶用于DNA分子的復制,能在單鏈上將一個個脫氧核苷酸連接起來,因此④符合;DNA連接酶能在具有相同或互補堿基末端的兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,因此②符合;解旋酶能夠將DNA分子的雙螺旋解開,因此③符合。
5.下列有關如圖所示的黏性末端的說法,錯誤的是
(　　)
A.甲、乙、丙黏性末端分別是由不同的限制酶切割產生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端,可形成重組DNA分子,但甲、丙之間不能
C.DNA連接酶的作用位點是b處
D.切割產生甲的限制酶不能識別由甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子片段
【解析】選C。據圖可知,切割形成甲、乙、丙黏性末端的限制酶識別序列與切割位點分別是—GAATTC—(在G與A之間切割)、—CAATTG—(在C與A之間切割)、—CTTAAG—(在C與T之間切割),即甲、乙、
丙是由不同的限制酶切割產生的,A正確。甲、乙的黏性末端互補,所以甲、乙可以形成重組DNA分子;甲、丙的黏性末端不互補,所以甲、丙無法形成重組DNA分子,B正確。DNA連接酶可以恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵,而b處是氫鍵,C錯誤。甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子片段為-CAATTC-GTTAAG,其中沒有切割產生甲的限制酶的識別序列及酶切位點,所以切割產生甲的限制酶不能識別由甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子片段,D正確。
6.下列關于E.coli
DNA連接酶的敘述正確的是
(　　)
①催化具有相同黏性末端的DNA片段之間的連接
②催化具有互補黏性末端的DNA片段之間的連接
③催化具有平末端的DNA片段之間的連接
④催化單個脫氧核苷酸之間磷酸二酯鍵的形成
A.①②
B.②④
C.②③
D.①④
【解析】選A。E.coli
DNA連接酶來源于大腸桿菌,可用于連接相同或互補的黏性末端,不能連接平末端。DNA連接酶不能連接單個的脫氧核苷酸,在DNA復制時,DNA聚合酶將一個一個的脫氧核苷酸聚合在一起。
7.基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和質粒,便于重組和篩選。已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—,限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—。根據下圖判斷下列操作正確的是
(　　)
A.目的基因和質粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和質粒均用限制酶Ⅰ切割
C.質粒用限制酶Ⅱ切割,目的基因用限制酶Ⅰ切割
D.質粒用限制酶Ⅰ切割,目的基因用限制酶Ⅱ切割
【解析】選D。解此題要明確目的基因要從DNA片段上切下,質粒只要切開。限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—,單獨使用時可以把目的基因和質粒都切斷;限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—,只能把它們切開,單獨使用時不能切斷,所以目的基因用限制酶Ⅱ切割,質粒用限制酶Ⅰ切割;因為用限制酶Ⅰ切割質粒時破壞了GeneⅡ,所以只能用GeneⅠ作為標記基因。
二、非選擇題(共2小題,共35分)
8.(17分)根據基因工程的有關知識,回答下列問題:
(1)限制酶切割DNA分子后產生的片段,其末端類型有____________和
________________。?
(2)質粒載體用限制酶X(識別的序列由6個核苷酸組成)切割后產生的片段如下:
AATTC……G
　　　　　
G……CTTAA
該酶識別的序列為________________________,切割的部位是____________
______________________。?
(3)為使切割后的載體與目的基因相連,含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外,還可用限制酶Y切割,原因是______________________________。?
(4)按其來源不同,基因工程中所使用的DNA連接酶有兩類,即____________DNA連接酶和____________DNA連接酶,其中后者只能連接一種末端。?
(5)基因工程中除質粒外,________________和________________也可作為載體。?
【解析】
(1)限制酶切割DNA分子后可產生兩種類型的末端,即平末端和黏性末端。(2)將圖中片段兩端的黏性末端對接后可以看出限制酶X識別的序列為6個核苷酸組成的—GAATTC—,互補鏈是—CTTAAG—,切割的位點為G和A之間的磷酸二酯鍵。(3)質粒載體可以用限制酶X切割,也可以用另一種限制酶切割,說明該酶與限制酶X切割產生的黏性末端相同或者互補。(4)基因工程使用的DNA連接酶,按來源可分為E.coliDNA連接酶和T4
DNA連接酶,其中只能連接黏性末端的是E.coliDNA連接酶。(5)基因工程的載體有質粒、噬菌體和動植物病毒。
答案:(1)黏性末端　平末端
(2)—GAATTC—或—CTTAAG—　G和A之間的磷酸二酯鍵　(3)兩種限制酶切割后形成的黏性末端相同或互補　(4)T4　E.coli　(5)噬菌體　動植物病毒
9.(18分)如圖為大腸桿菌及質粒載體的結構模式圖,據圖回答下列問題:
(1)a代表的物質和質粒的化學本質都是__________,二者還具有其他共同點,如①__________________,②________________________(寫出兩條即可)。?
(2)若質粒DNA分子的切割末端為
,則與之連接的目的基因切割末端應為　______________;可使用　________________把質粒和目的基因連接在一起。?
(3)氨芐青霉素抗性基因在質粒DNA上被稱為________________________,?
其作用是____________________________________________。?
(4)下列常在基因工程中用作載體的是
(　　)
A.蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因
B.土壤農桿菌中的RNA分子
C.大腸桿菌的質粒
D.動物細胞的染色體
【解析】(1)據圖可知,a是位于擬核部位的DNA分子,跟質粒的化學本質一樣。作為DNA分子,二者都能自我復制,其上的基因能完成表達,即具有遺傳效應等。
(2)與
具有相同或互補黏性末端的DNA片段都可與之連接,即
或寫成
。DNA連接酶催化連接相同或互補的黏性末端。
(3)抗性基因常作為標記基因,供重組DNA的鑒定和篩選。
(4)大腸桿菌的質粒是基因工程中最常用的載體,載體的本質為DNA,RNA分子不能用作載體?？瓜x基因屬于目的基因,不屬于載體。染色體的主要成分為DNA和蛋白質,不能用作載體。
答案:(1)DNA　能夠自我復制　具有遺傳效應
(2)CGCG—
　　
—　　DNA連接酶
(3)標記基因　供重組DNA的鑒定和篩選　(4)C
(10分鐘·30分)
1.(6分)如圖為農桿菌Ti質粒的T-DNA區段結構示意圖。農桿菌附著植物細胞后,T-DNA首先在農桿菌中從右邊界到左邊界被剪切、復制,然后進入植物細胞并整合到染色體上,繼而誘發細胞異常生長和分裂,形成植物腫瘤。以下有關敘述不正確的是
(　　)
A.Ti質粒存在于農桿菌的擬核DNA之外
B.植物腫瘤的形成與A、B兩個基因的表達有關
C.清除植物腫瘤組織中的農桿菌后腫瘤不再生長
D.利用T-DNA進行轉基因時需保留LB、RB序列
【解析】選C。Ti質粒是環狀的DNA分子,存在于農桿菌的擬核DNA之外,A正確;A、B兩個基因導入受體細胞的染色體上,進行表達,繼而誘發細胞異常生長和分裂,形成植物腫瘤,B正確;農桿菌將自身Ti質粒的T-DNA整合到植物染色體上,誘發了植物腫瘤的形成,故清除腫瘤組織中的農桿菌后,腫瘤仍可繼續生長,C錯誤;只有T-DNA保留LB、RB序列,T-DNA才能在農桿菌中從右邊界到左邊界被剪切、復制,然后進入植物細胞并整合到染色體上,D正確。
2.(6分)(不定項)圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性核酸內切酶的酶切位點,ampr表示氨芐青霉素抗性基因,neo表示新霉素抗性基因。下列敘述不正確的是
(　　)
A.圖甲中的質粒用BamHⅠ切割后,含有4個游離的磷酸基團
B.在構建重組質粒時,可用PstⅠ和BamHⅠ切割質粒和外源DNA
C.用PstⅠ和Hind
Ⅲ切割,可以保證重組DNA序列的唯一性
D.導入目的基因的大腸桿菌可在含氨芐青霉素的培養基中生長
【解析】選A、B、D。甲中的質粒只有一個BamHⅠ切割位點,切割后形成一個直鏈DNA,含2個游離的磷酸基團,A錯誤;BamHⅠ切割位點在目的基因上,不能用該酶切割外源DNA,B錯誤;用PstⅠ和HindⅢ切割質粒切成兩個片段,用PstⅠ和Hind
Ⅲ能將外源DNA切開,只有含目的基因的片段通過DNA連接酶與質粒連接形成的重組質粒符合要求,從而保證重組DNA序列的唯一性,C正確;導入目的基因的大腸桿菌,其重組質粒是用PstⅠ和Hind
Ⅲ切割的,其中的ampr(氨芐青霉素抗性基因)已被破壞,D錯誤。
【實驗·探究】
3.(18分)啤酒酵母菌是啤酒生產上常用的典型的發酵酵母菌。除用于釀造啤酒及其他的飲料酒外,還可發酵面包。菌體維生素、蛋白質含量高,可食用、藥用和作飼料?？茖W家將大麥細胞的LTP1基因植入啤酒酵母菌中,獲得的啤酒酵母菌種可產生LTP1蛋白,并釀出泡沫豐富的啤酒。基本的操作過程如圖:
(1)該技術定向改變了啤酒酵母菌的性狀,這在可遺傳變異的來源中屬于________。?
(2)為了將LTP1基因導入酵母菌細胞內,所用的載體是________。?
(3)題圖中C進入的啤酒酵母菌分別在含有青霉素、四環素的兩種選擇培養基上的生長情況是?____________________________________________________。?
【解析】(1)由題圖可知該技術屬于基因工程,該變異屬于基因重組。(2)據題圖可以看出,載體來自大腸桿菌,一定是質粒。(3)由于質粒上抗四環素基因被破壞,所以含有C的酵母菌在含有青霉素的培養基上能存活,但在含有四環素的培養基上不能存活。
答案:(1)基因重組
(2)(大腸桿菌的)質粒
(3)在含有青霉素的培養基上能存活,但在含有四環素的培養基上不能存活

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