資源簡(jiǎn)介

專題5.3 血紅蛋白的提取和分離
教學(xué)目標(biāo)：
1、了解提取、分離高純度的蛋白質(zhì)的重要性和必要性
2、理解色譜法分離蛋白質(zhì)的基本原理和用途
3、理解緩沖溶液的作用機(jī)理和組成、作用，熟悉其配置方法
4、了解電泳法等分離生物大分子的基本原理和種類
教學(xué)重點(diǎn)：
1、凝膠色譜法的原理和方法
2、緩沖溶液的作用機(jī)理和組成、作用
教學(xué)難點(diǎn)：
凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)
課時(shí)安排：
1課時(shí)
教學(xué)過(guò)程：
一、引入新課
師：在上一節(jié)課我們已經(jīng)學(xué)習(xí)完了果膠酶在果汁生產(chǎn)中的應(yīng)用相關(guān)內(nèi)容，通過(guò)學(xué)習(xí)我們了解到果膠酶能把果膠分解成半乳糖醛酸，那果膠酶的本質(zhì)是什么？通常得到果膠酶的方法有提取法、發(fā)酵法、化學(xué)合成。那我們可以怎樣提取果膠酶這種蛋白質(zhì)的？
這就涉及到新的生物學(xué)技術(shù)，蛋白質(zhì)技術(shù)。
從這一節(jié)課開(kāi)始，我們將進(jìn)入到第五章，DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)，根據(jù)安排，我們主要學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)技術(shù)。這就是第五章第三個(gè)課題：血紅蛋白的提取和分離
播放幻燈片：第二張
師：蛋白質(zhì)技術(shù)作為遺傳學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的重要手段，是非常重要的，為了更好的學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)技術(shù)，我們先了解一下蛋白質(zhì)研究的最新國(guó)際動(dòng)態(tài)：
播放幻燈片：蛋白質(zhì)研究最新進(jìn)展
1、轉(zhuǎn)基因水稻大規(guī)模生產(chǎn)重組人血清白蛋白
由武漢大學(xué)生命科學(xué)院教授、武漢禾元生物科技研發(fā)團(tuán)隊(duì)進(jìn)行的植物源替代血漿來(lái)源的醫(yī)藥蛋白的研究與開(kāi)發(fā)，現(xiàn)已取得突破性進(jìn)展并已跨入規(guī)模化生產(chǎn)的階段，填補(bǔ)了國(guó)際上此項(xiàng)技術(shù)空白。該研究表明由轉(zhuǎn)基因水稻種子生產(chǎn)的重組人血清白蛋白在生理生化性質(zhì)、物理結(jié)構(gòu)，生物學(xué)功能、免疫原性與血漿來(lái)源的人血清白蛋白一致；并建立了大規(guī)模生產(chǎn)重組人血清白蛋白的生產(chǎn)工藝，獲得了高純度和高產(chǎn)量重組人血清白蛋白產(chǎn)品。正如PNAS 審稿人對(duì)該文章的評(píng)價(jià)：“這篇文章解決了在科學(xué)上振奮人心、在經(jīng)濟(jì)上都非常重要的議題——即用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)血漿產(chǎn)品或其他蛋白產(chǎn)品的技術(shù)平臺(tái)，可代替其他基于發(fā)酵的表達(dá)技術(shù)，其重要性也不言而喻……”
目前，人血清白蛋白廣泛應(yīng)用于臨床治療和細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。常見(jiàn)的人血清白蛋白大多數(shù)從人的血漿中提取。盡管人血清白蛋白市場(chǎng)廣闊，但（提?。└呒兌戎亟M人血白蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)和質(zhì)量控制技術(shù)卻是世界性難題。武漢禾元?dú)v經(jīng)多年的技術(shù)攻關(guān)，利用水稻胚乳表達(dá)技術(shù)平臺(tái)，研發(fā)出國(guó)際先進(jìn)水平的重組人血白蛋白產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)重組人血白蛋白規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化，必將緩解我國(guó)人血清白蛋白日益緊張的局面。 （來(lái)自2011年10月31日pans）
師：怎么樣提取蛋白質(zhì)？為什么提取高純度蛋白質(zhì)是世界性難題？
2、確定 “疼痛接觸” 的蛋白質(zhì)
在2月19日的Nature上發(fā)表了兩篇具有里程碑意義的文章，斯克里普斯研究所的科學(xué)家報(bào)道他們已鑒定了能檢測(cè)“疼痛接觸”的一類蛋白質(zhì)。
已知我們皮膚里的感覺(jué)神經(jīng)能通過(guò)外層膜里某些專門(mén)蛋白來(lái)檢測(cè)壓力、疼痛、熱、冷和其他他刺激。但是他們也只是剛開(kāi)始鑒定和特征化參與每一種感覺(jué)傳導(dǎo)通路的專門(mén)蛋白。新研究中的實(shí)驗(yàn)在哺乳動(dòng)物感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的模型系統(tǒng)果蠅中開(kāi)展，壓力蛋白也在果蠅中表達(dá)，以及耳、腎、心和其他組織內(nèi)的某些類型細(xì)胞中表達(dá)。將來(lái)的研究將集中于壓力蛋白在傳感聲音、血壓及壓或拉伸細(xì)胞膜的相關(guān)刺激中的作用。（來(lái)源于2012年2月19日nature ）
師：“已鑒定這類蛋白質(zhì)”，可以通過(guò)什么途徑鑒定這類蛋白質(zhì)？ 你能想到什么辦法可以鑒定蛋白質(zhì)？
抽問(wèn)學(xué)生：
學(xué)生：雙縮脲試劑（紫色）、（化學(xué)上提過(guò)濃硝酸變黃色）
師：對(duì)，我們可以通過(guò)雙縮脲試劑鑒定蛋白質(zhì)，但是如果我們要鑒定蛋白質(zhì)的分子大小，性狀，還能用這個(gè)方法嗎？
現(xiàn)在擺在我們面前有2個(gè)問(wèn)題，一是如何提取蛋白質(zhì)？如何用其他方法鑒定蛋白質(zhì)？為了更好的思考這個(gè)問(wèn)題，我們先回憶必修中蛋白質(zhì)相關(guān)知識(shí)，爭(zhēng)取在從這里面尋找到我們的鑰匙：
二、蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識(shí)
師1：蛋白質(zhì)的基本單位是氨基酸
板書(shū)：
師2、氨基酸的結(jié)構(gòu)通式？
學(xué)生回答：在同一個(gè)C原子上同時(shí)連接著一個(gè)R基、氫基、氨基、羧基
板書(shū)：
師3、連接兩個(gè)氨基酸分子的化學(xué)鍵是什么？
抽問(wèn)學(xué)生：
板書(shū)：
師4、蛋白質(zhì)的功能？蛋白質(zhì)種類多樣性的原因？
抽問(wèn)學(xué)生：
學(xué)生回答：構(gòu)成細(xì)胞生物體的基本結(jié)構(gòu)如指甲，催化各種反應(yīng)如酶，運(yùn)輸載體如血紅蛋白，參與免疫如抗體，信息傳遞，調(diào)節(jié)生命活動(dòng)，如胰島素。因?yàn)闃?gòu)成不同蛋白質(zhì)的氨基酸種類、排列順序不同，而且不同蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)不同，造成了蛋白質(zhì)的多樣。
板書(shū)：
播放幻燈片：不同的蛋白質(zhì)圖片
師：除此以外，生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)存在分子量、電荷、溶解度、吸附性質(zhì)、和對(duì)其他分子的親和力等等也有差異，科學(xué)家根據(jù)這些差異性，就發(fā)明了不同的方法提取分離蛋白質(zhì)，下面我們就一起學(xué)習(xí)一下：
播放幻燈片：
（一）凝膠色譜法（分配色譜法）
師：原理：根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。
其中的凝膠是指：一些微小的多孔球體，這些球體大多是由多糖類化合物構(gòu)成的，在這些小球內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠的路程不同，而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。
常見(jiàn)的凝膠有：交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠
播放幻燈片圖片并解釋：圖5-13
播放動(dòng)畫(huà)凝膠色譜法動(dòng)畫(huà)
提問(wèn)學(xué)生：通過(guò)動(dòng)畫(huà)，你能看出大分子和小分子的路徑差異嗎？
師總結(jié)：從動(dòng)畫(huà)中我們可以看到，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)可以自由地進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動(dòng)的過(guò)程中，它們從凝膠顆粒的網(wǎng)孔擴(kuò)散到凝膠顆粒間的孔隙，再進(jìn)入另一凝膠顆粒的網(wǎng)孔，如此不斷地進(jìn)出，使流程增長(zhǎng)，而最后流出層析柱。而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著洗脫液流動(dòng)，流程較短，因此首先流出層析柱。分子量介于二者之間的物質(zhì)，雖然能夠進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，但比小分子難，因此進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔的幾率比小分子小，向下移動(dòng)的速度比小分子快，而比大分子慢。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。
師：我們看一下實(shí)驗(yàn)室的模式圖和實(shí)際操作圖。
播放幻燈片：
師：從這個(gè)圖片中，我們看到，在實(shí)驗(yàn)中，我們還需要一直用緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，那是為什么啊？
師提示：在本課題中我們研究的血紅蛋白的提取，血紅蛋白存在位置在哪？紅細(xì)胞生活的內(nèi)環(huán)境是？
學(xué)生統(tǒng)一回答：存在于紅細(xì)胞中，血漿
師：那同學(xué)們想想內(nèi)環(huán)境如何位置其理化性質(zhì)PH的穩(wěn)定？
學(xué)生：緩沖液
師：下面我們就學(xué)習(xí)一下緩沖溶液的知識(shí)：
播放幻燈片：
（二）緩沖液
師：定義：能抵抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋，而能保持其pH基本不變的作用叫緩沖作用，像這樣的溶液稱為緩沖溶液
師：你能說(shuō)出維持內(nèi)環(huán)境ph穩(wěn)定的緩沖液?jiǎn)幔?
生：H2CO3—NaHCO3 NaH2PO4—Na2HPO4
師：組成：緩沖液由足夠的共軛酸堿對(duì)組成，其中，能對(duì)抗外來(lái)強(qiáng)堿的稱為共軛酸，能對(duì)抗外來(lái)強(qiáng)酸的為共軛堿。這一對(duì)共軛酸堿通常稱為緩沖液。常見(jiàn)主要有三類：
播放幻燈片：
1、弱酸及其對(duì)應(yīng)的鹽：如H2CO3—NaHCO3
2、多元弱酸的酸式鹽及其對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽：如：NaHCo3—Na2Co3；NaH2PO4—Na2HPO4
3、弱堿及其對(duì)應(yīng)的鹽：如NH3·Ｈ２Ｏ—NH4Cl
師：緩沖液的原理是怎樣的？
幻燈片：
原理：以NaHCo3—Na2CO3為例。當(dāng)有少量酸進(jìn)入時(shí)，CO3 + H+ ? HCO3
當(dāng)有少量堿進(jìn)入時(shí)，OH +HCO3?H2O+CO32-
作用：維持反應(yīng)體系的PH值相對(duì)穩(wěn)定，為生化反應(yīng)提供適宜的酸堿環(huán)境其實(shí)，讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)（模擬細(xì)胞內(nèi)ph值），維持結(jié)構(gòu)和功能。
師：你能聯(lián)想到生活中的緩沖作用嗎？如運(yùn)動(dòng)鞋鞋底設(shè)計(jì)就具有緩沖功能，汽車車軸上面的緩沖，在生物體內(nèi)也有緩沖。
師：除了凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)外，我們還可以通過(guò)電泳的方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)分離。
播放幻燈片：
（三）電泳
師：定義：指帶點(diǎn)粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。
師：原理：蛋白質(zhì)、核酸分子的一些基團(tuán)在一定的pH下會(huì)發(fā)生水解或電離從而帶有電荷，在電場(chǎng)的作用下，帶電的分子會(huì)向著所帶電荷相反的方向移動(dòng)。由于樣品中各種分子凈電荷的量的差異以及分子本身的大小等因素，使有機(jī)分子產(chǎn)生不同的遷移速率，從而將樣品中各種有機(jī)分子分離開(kāi)。
常見(jiàn)電泳：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳
師：簡(jiǎn)單介紹電泳儀
師：還有第三種比較重要的電泳：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
在電泳時(shí)在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS（十二烷基硫酸鈉）進(jìn)行處理， SDS能使蛋白質(zhì)變性，并與各種蛋白質(zhì)結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于SDS本身帶有的電量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)的電量，可以掩蓋了蛋白質(zhì)的電荷差別，使電泳的移動(dòng)率完全取決于分子的大小。
師問(wèn)：如果要分別檢測(cè)檢測(cè)某樣品的帶電荷量和分子量，你選擇怎樣的電泳？
學(xué)生：電荷可以用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳等，分子量用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳
播放幻燈片：電泳動(dòng)畫(huà)：
即在電場(chǎng)條件下，分子量大的蛋白質(zhì)遷移率慢，離前沿較遠(yuǎn)，而分子量小的蛋白質(zhì)遷移快，離前沿較近。這樣，不同分子量大小的蛋白質(zhì)得到了分離。如果蛋白質(zhì)的純度高，遷移率一致，就會(huì)形成前沿整齊、清晰的條帶。
播放幻燈片：電泳區(qū)帶圖片
師：電泳后，我們會(huì)得到一個(gè)區(qū)帶，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)區(qū)帶對(duì)比，就能計(jì)算出蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，并進(jìn)行其他的分析。
在本課題中我們需要提取分離血紅蛋白，血紅蛋白存在于紅細(xì)胞中，為了更好的了解如何得到純度更高的血紅蛋白，我們需要回憶一下血液相關(guān)知識(shí)：
（四）血液
血液包括血細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板）和血漿（其中有蛋白質(zhì)、脂類、糖類、維生素、激素等等）。紅細(xì)胞內(nèi)90%是血紅蛋白、其他的有如_???è§?è?¨_、氧氣、二氧化碳等。血紅蛋白是使血液呈紅色的蛋白，血紅蛋白由四條鏈組成，兩條α鏈和兩條β鏈，每一條鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子的氧和一分子的二氧化碳，血紅蛋白因?yàn)檠t素而呈現(xiàn)紅色。
現(xiàn)在我們已經(jīng)知道血紅蛋白存在紅細(xì)胞內(nèi)，但是紅細(xì)胞有細(xì)胞膜會(huì)阻止血紅蛋白的滲出，那通過(guò)什么方法可以得到血紅蛋白？
這就涉及到實(shí)驗(yàn)的具體操作，下面簡(jiǎn)單的介紹一下實(shí)驗(yàn)操作的步驟：
蛋白質(zhì)提取分離的步驟一般分為四個(gè)：樣品處理（就是得到血紅蛋白）、粗分離（通過(guò)透析（滲透作用原理）分離小分子雜質(zhì)）、純化（凝膠色譜柱法）、純度鑒定（電泳）
對(duì)于如何制備得到樣品，如何進(jìn)行凝膠色譜過(guò)濾，我們?cè)谙乱还?jié)課中將繼續(xù)學(xué)習(xí)。
現(xiàn)在我們總結(jié)一下這節(jié)課的主要內(nèi)容：
一是蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)知識(shí)，二是提取、分離蛋白質(zhì)的方法，這些方法也可以用在分離核酸等物質(zhì)。
下面我們做幾道題目檢測(cè)一下：
1 利用凝膠色譜法，什么樣的蛋白質(zhì)先洗脫出來(lái)（ ）
A. 相對(duì)分子質(zhì)量大的
B. 溶解度高的
C. 相對(duì)分子量小的
D. 所代電荷多的
答案：A
2 用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)（ ）
A路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢 B路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快
C路程較短，移動(dòng)速度較慢 D路程較短，移動(dòng)速度較快
答案：D
3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過(guò)程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于
A 電荷的多少 B 分子的大小
C 肽鏈的多少 D 分子形狀的差異
答案：B
4 蛋白質(zhì)提取和分離分為哪幾步（ ）
A. 樣品處理、凝膠色譜操作、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳
B. 樣品處理、凝膠色譜操作、純化
C. 樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定
D. 樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定
答案：c

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